李 彤，王雨行，王向紅，張玉涵，米 思,

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 057250；3.河北省植物天然色素產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 邯鄲 057250）

胡椒（Piper nigrumL.）是胡椒科胡椒屬植物，主要種植于越南、印度尼西亞等熱帶地區(qū)[1]，因其具有刺激性辣味和強(qiáng)烈的芳香味被許多國家用作食品加工中的香料[2]。此外，胡椒果實中含有多種生物活性成分，使其具有抗癌和免疫調(diào)節(jié)等作用，因此也被用于醫(yī)學(xué)研究[3]。胡椒油樹脂是以胡椒為原料通過有機(jī)試劑、超臨界流體等提取浸提生產(chǎn)而成，保留了胡椒原料原有的辛辣風(fēng)味和營養(yǎng)價值。因此，胡椒油樹脂正逐漸替代胡椒粒或胡椒粉在食品香料中的地位。

已有研究表明，產(chǎn)地是影響包括胡椒在內(nèi)的食品香料品質(zhì)的重要因素之一[4-5]，Campmajo等[6]借助高效液相色譜技術(shù)實現(xiàn)了對不同歐洲產(chǎn)地辣椒的判別分析；Feng Xiya等[7]利用氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatographyion mobility spectroscopy，GC-IMS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析不同產(chǎn)地花椒中的揮發(fā)性有機(jī)物的差異。近年來針對不同產(chǎn)地胡椒樣品的品質(zhì)分析比較也有報道。張玉涵等[8]利用超快速氣相電子鼻技術(shù)比較了不同國家胡椒及其提取物的成分組成差異；Tokalioglu[9]、Potorti等[10]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）手段評估了不同產(chǎn)地多種香料中化學(xué)元素組成的異同點。

胡椒油樹脂在我國乃至世界香辛料產(chǎn)業(yè)中占有越來越重要的地位。我國是胡椒消費(fèi)大國，目前胡椒產(chǎn)量尚不能滿足國內(nèi)市場需求，胡椒原料多是從越南、印度尼西亞等東南亞國家進(jìn)口。明確不同產(chǎn)地胡椒油樹脂的品質(zhì)特征與差異對后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。因此，本研究以產(chǎn)自越南、印度尼西亞、斯里蘭卡的胡椒油樹脂為研究對象，采用包括高效液相色譜、ICP-MS、GC-IMS在內(nèi)的多元儀器分析手段，結(jié)合方差分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）法分析不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中胡椒堿類化合物、化學(xué)元素以及揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成及含量，并識別對產(chǎn)地判別具有重要貢獻(xiàn)的化學(xué)標(biāo)志物，確定胡椒油樹脂的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)，旨在為不同產(chǎn)地的胡椒油樹脂的品質(zhì)辨別與選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡椒油樹脂由晨光生物科技集團(tuán)提供，來源于印度尼西亞、斯里蘭卡和越南3 個產(chǎn)地，樣品命名：印尼1、印尼2、蘭卡1、蘭卡2、越南1、越南2。胡椒油樹脂樣品置于4 ℃冰箱保存，待測。

甲醇（色譜純）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；胡椒堿標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、蓽茇酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）北京索萊寶科技有限公司；胡椒酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）北京喀斯瑪惠通科技有限公司；胡椒醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）上海麥克林生物科技有限公司；2-甲基-3-庚酮對照品（純度＞99%）德國Dr.Ehrenstorfer公司；其余有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1525型高效液相色譜儀 美國Waters公司；FlavourSpec?GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S公司；CEM MARS 5型密閉微波消解儀 美國CEM公司；7700X型ICP-MS儀 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜分析

標(biāo)準(zhǔn)品制備：稱取胡椒堿、胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，分別用無水乙醇溶解并定容至5 mL作為母液，將母液梯度稀釋成100、62.5、50、25、12.5、5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

樣品制備：稱取0.050 g的胡椒油樹脂，用無水乙醇定容至5 mL，避光超聲提取30 min，提取液用0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾待測。

胡椒堿和胡椒酸分析的色譜條件：Waters Diamonsil C18型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（77∶23，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長為343 nm（胡椒堿）和254 nm（胡椒酸）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

胡椒醇和蓽茇酰胺分析的色譜條件：流動相為甲醇-水（60∶40，V/V）；檢測波長為285 nm，其余均與胡椒堿的檢測條件一致。

1.3.2 ICP-MS

微波消解條件：稱取0.250 g胡椒油樹脂，置于PTFE消解管中，加入6 mL 65%的濃硝酸溶液進(jìn)行預(yù)消解。1 h后，加入2 mL 30%的H2O2溶液，混勻后于微波消解儀中進(jìn)行消解。微波消解儀溫度在8 min內(nèi)升至120 ℃，保持2 min；然后以8 ℃/min的速率升至160 ℃，并且保持5 min，再以4 ℃/min的速率升至180 ℃，保持15 min。消解后冷卻至室溫，用去離子水（＞18.2 MΩ）洗出樣品，定容至100 g，備用。

ICP-MS條件：射頻功率1 280 W；霧化室溫度2 ℃；載氣流速1.0 L/min；蠕動泵流速0.5 mL/min；氧化物指標(biāo)0.45%；雙電荷指標(biāo)1.01%。以Ge、In、Bi為所選內(nèi)標(biāo)，當(dāng)內(nèi)標(biāo)元素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（3 次重復(fù)測定）＞10%，需重新測定樣品。

1.3.3 GC-IMS分析

樣品前處理條件：準(zhǔn)確稱取2.500 g胡椒油樹脂置于20 mL頂空瓶中，加入100 μL 0.2 mg/mL的2-甲基-3-庚酮溶液，振蕩搖勻后備用。

自動進(jìn)樣條件：孵育溫度40 ℃，孵化轉(zhuǎn)數(shù)500 r/min，孵育時間10 min，采用頂空自動進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量1 mL，進(jìn)樣針溫度85 ℃，不分流模式進(jìn)樣。

GC條件：采用MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm），柱溫60 ℃，載氣為氮?dú)猓ā?9.999%）。

IMS條件：溫度45 ℃，分析時間30 min，載氣/漂移氣為氮?dú)猓ā?9.999%）；載氣的流速程序為0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～15 mL/min；10～25 min，15～100 mL/min；25～30 min，100 mL/min。

數(shù)據(jù)處理條件：采用GC-IMS儀器配套的VOCal軟件（內(nèi)置NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫）對不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中的風(fēng)味化合物進(jìn)行定性分析，利用Reporter和Gallery Plot插件對比風(fēng)味指紋圖譜的差異。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地胡椒油樹脂胡椒堿類化合物組成分析

本研究測定胡椒堿、胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺4 種化合物在胡椒油樹脂樣品中的含量，分析結(jié)果見表1。其中胡椒堿在胡椒油樹脂樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（25.83%～31.57%），這與劉紅等[2]的研究一致。胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較少，且4 種化合物含量在不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中均存在顯著差異（P＜0.05）。

表1 不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中胡椒堿及其類似物含量Table 1 Contents of piperine and related compounds in pepper oleoresin samples

胡椒堿是胡椒油樹脂中存在的特征辣味成分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高產(chǎn)生的刺激感越強(qiáng)[11]。蘭卡2中胡椒堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（31.57%）顯著高于其他產(chǎn)地樣品，越南產(chǎn)地胡椒堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體偏低（表1）。該結(jié)果與Rivera-perez等[12]的研究類似。已有研究表明，胡椒酸、胡椒醇和蓽茇酰胺等化合物的存在會對胡椒油樹脂的風(fēng)味品質(zhì)產(chǎn)生影響。胡椒酸是一種芳香酸[13]，其在蘭卡2中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.72%）顯著高于其他樣品。胡椒醇和蓽茇酰胺化合物在印尼1樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為1.88%和1.89%（表1）。綜上，不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中胡椒堿類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在顯著差異，越南產(chǎn)地的胡椒油樹脂樣品中4 種化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中，因此具有更加適中的口嘗辣感。產(chǎn)地是影響胡椒油樹脂辛辣成分組成的重要因素之一，這種差異可歸因于植物生長的土壤、水質(zhì)、氣候條件等[14-16]。

2.2 不同產(chǎn)地胡椒油樹脂化學(xué)元素組成分析

本研究同時測定54 種化學(xué)元素在不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中的含量，其中Sc、Se、Y、Rh、Pd、Tb、Lu、Th 8 種元素在各樣品中均未檢測到，其余46 種元素測定結(jié)果見表2。K、P、Na、Cu、Mg、Fe、Al、Ca是胡椒油樹脂樣品中含量較豐富的元素，這與陳福北等[17]研究結(jié)果相似。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，Mo、Ru、Ce、Pr、Nd、Eu、Na、Mg、P、K、V、Cr、Mn、Fe、Co、Cu、As、Rb、Ag、Sn、Cs、Ba、La 23 種元素含量在不同樣品間存在顯著差異（P＜0.05）。其中，Mg、Ba、V、Ce、La、Nd、Pr、Eu 8 種元素在蘭卡2中含量最高；Fe、Sn、Cr、Mn、Co、As、Ag 7 種元素在印尼1中含量最高；K、P、Na、Rb、Ru 5 種元素在越南2中含量最高；Cs在印尼2中含量最高；Cu、Mo在越南1中含量最高（表2）。此外，Cd、As、Pb等重金屬元素均未超出GB 2762—2017《食品中污染物限量》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。

進(jìn)一步針對46 種化學(xué)元素進(jìn)行多元數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。圖1a為46 種化學(xué)元素分析的PCA得分圖，PC1的方差貢獻(xiàn)率為31.63%，PC2的貢獻(xiàn)率為18.38%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)50.01%，可以反映出大部分化學(xué)元素含量信息，樣品間分離程度好，表明各樣品的化學(xué)元素組成存在明顯差異。

圖1 化學(xué)元素的PCA（a）、PLS-DA（b）和VIP（c）得分圖Fig.1 PCA score plot (a),PLS-DA score plot (b) and VIP score plot (c) of chemical elements

2.3 不同產(chǎn)地胡椒油樹脂揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成分析

采用GC-IMS法對不同產(chǎn)地胡椒油樹脂風(fēng)味化合物組成進(jìn)行分析檢測，結(jié)果見圖2。受試樣品中共檢測出90 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，包括醛類18 種、醇類17 種、酮類14 種、酯類13 種、烯烴類7 種、酸類3 種、醚類3 種、胺類3 種、呋喃類2 種、噻唑類2 種、吡嗪類2 種、芳香烴類1 種、烷烴類1 種、其他化合物4 種（表3）。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，除2-癸烯醛、二乙醇縮乙醛、壬醛、順式-3-辛烯醇、乙醇、3-辛醇、甲基庚基甲酮、丁酸乙酯、丙酸己酯、己酸丙酯、4-三氟甲基苯腈外，其余79 種化合物含量在不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中均存在顯著差異（P＜0.05）（表3）。由揮發(fā)性風(fēng)味化合物指紋圖譜（圖2）可知，越南兩樣品風(fēng)味化合物組成較相似；除A框中化合物在蘭卡2中信號強(qiáng)度較高外，其他化合物在印尼2、蘭卡1、蘭卡2中的含量接近；B框中的化合物在印尼1中的含量明顯高于其他樣品。

圖2 揮發(fā)性風(fēng)味化合物指紋圖譜Fig.2 Volatile fingerprint of pepper oleoresin samples

表3 不同產(chǎn)地胡椒油樹脂樣品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成及含量Table 3 Composition and content of volatile flavor compounds in pepper oleoresin samples

PCA結(jié)果（圖3a）表明，PC1、PC2方差貢獻(xiàn)率分別為35.71%、27.80%，累計貢獻(xiàn)率達(dá)63.51%。PC1中印尼2、蘭卡1、蘭卡2聚集度較高，越南1和越南2樣品較接近，樣品越聚集表明揮發(fā)性風(fēng)味化合物組成越相似[24]；PC2中印尼1與其他5 種樣品可明顯區(qū)分。以上PCA結(jié)果與指紋圖譜反映出的結(jié)果對應(yīng)。

圖3 揮發(fā)性風(fēng)味化合物PCA（a）、PLS-DA（b）和VIP（c）得分圖Fig.3 PCA score plot (a),PLS-DA score plot (b) and VIP score plot (c) of volatile flavor compounds

前期文獻(xiàn)報道指出，烯烴類化合物，例如2-蒎烯、檸檬烯、石竹烯等，是胡椒油樹脂中的特征香氣成分[3,8,26]。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，烯烴類化合物在越南1樣品中總體含量相對較高，其中2-蒎烯多存在于天然精油中[25]，含量最大（14.31 μg/g）；檸檬烯含量為4.46 μg/g，可賦予胡椒油樹脂柑橘香氣[27]；石竹烯含量為6.51 μg/g，賦予胡椒油樹脂木質(zhì)香氣。除烯烴類特征香氣化合物之外，越南1樣品中還含有相對豐富的醛類、酮類、酸類化合物（表3）。醛類化合物閾值較低，對胡椒油樹脂風(fēng)味品質(zhì)影響較大，尤其是2-十一烯醛、反式-2-己烯醛等含量較高的化合物，能夠賦予胡椒油樹脂樣品草香味[28]。4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮、甲基環(huán)戊烯醇酮等酮類化合物可作為雜環(huán)化合物的中間產(chǎn)物，間接反映香氣的貢獻(xiàn)[29]。此外，4-戊烯酸、正己酸等酸類化合物在越南1樣品中含量最高，主要賦予胡椒油樹脂焦糖香氣。以上分析結(jié)果表明，越南1胡椒油樹脂在風(fēng)味化合物組成及豐度方面優(yōu)于其他產(chǎn)地樣品，風(fēng)味濃郁，品質(zhì)較優(yōu)。

3 結(jié)論

本研究綜合分析比較印度尼西亞、越南、斯里蘭卡3 個產(chǎn)地胡椒油樹脂的胡椒堿類化合物、化學(xué)元素、揮發(fā)性風(fēng)味化合物的組成及含量。結(jié)果表明，斯里蘭卡產(chǎn)地樣品中胡椒堿類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，越南產(chǎn)地樣品中胡椒堿類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。借助ICP-MS手段同時測定胡椒油樹脂樣品中54 種化學(xué)元素的含量，元素豐度按照越南＞印尼＞蘭卡順序遞減，結(jié)合多元變量統(tǒng)計分析，篩選出Cs、Na、Cu、Rb、Ru、P、Mg、Sn、Ag、K、Mo、Cr、Co 13 種元素作為判別元素。利用GC-IMS技術(shù)鑒定出90 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，結(jié)合多元變量統(tǒng)計分析篩選出27 種具有判別意義的風(fēng)味標(biāo)志物，越南產(chǎn)地的胡椒油樹脂風(fēng)味化合物含量顯著優(yōu)于其他產(chǎn)地樣品，風(fēng)味較濃郁。綜上所述，產(chǎn)地是影響胡椒油樹脂化學(xué)組成的重要因素，相對而言越南產(chǎn)地的胡椒油樹脂辣感適中、化學(xué)元素含量最高、風(fēng)味最濃郁，品質(zhì)明顯優(yōu)于其他3 個產(chǎn)地。本研究借助多元儀器分析結(jié)合化學(xué)計量法構(gòu)建了印度尼西亞、越南、斯里蘭卡產(chǎn)地胡椒油樹脂的化學(xué)指紋圖譜，明確了不同產(chǎn)地樣品的品質(zhì)差異，為胡椒油樹脂的精深加工和產(chǎn)品開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。