胡麗筠，張 倩，陳雪妍，王金霞，李 榮，李亞蕾，羅瑞明

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750000）

牛肉在宰后成熟期間由于受自身肌肉組織生物化學變化的影響，導致肌肉品質(zhì)發(fā)生一系列的變化，這些生物化學變化主要包括內(nèi)源酶激活、結(jié)構(gòu)蛋白降解等[1]。蛋白酶體是一種多亞基蛋白酶復合物，使細胞質(zhì)和細胞核中的蛋白質(zhì)發(fā)生降解[2]，主要負責分解細胞中受損和不正確折疊的蛋白質(zhì)以及一些調(diào)節(jié)蛋白[3]，在真核生物中80%～85%的蛋白質(zhì)都是通過泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）進行降解[4]。蛋白酶體介導的UPP作為真核細胞中蛋白水解和細胞器清除的主要途徑，高度復雜，以特定方式參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解[5]。牛肉在宰后貯藏過程中由于肌肉組織代謝導致肌肉組織蛋白發(fā)生降解，進而影響其嫩度。MG-132是一種可逆性肽醛類蛋白酶體抑制劑，可進入細胞中抑制蛋白酶體活性，從而抑制UPP介導的蛋白質(zhì)降解[6]。

Taylor等[7]提出UPP在肉嫩化中發(fā)揮作用。曾珍[8]研究發(fā)現(xiàn)豬肉中20S蛋白酶體與剪切力、系水力相關(guān)。Liu Yue等[9]研究發(fā)現(xiàn)UPP在宰后羊肉蛋白水解中發(fā)揮作用，并可能有助于肉的嫩化。Zhang Bailin等[10]研究補充丙氨酰-谷氨酰胺對豬仔泛素化蛋白分解的信號通路影響，發(fā)現(xiàn)補充丙氨酰-谷氨酰胺通過上調(diào)蛋白質(zhì)合成和下調(diào)泛素化蛋白分解、蛋白質(zhì)降解改善豬仔的生長性能。Furukawa等[11]研究了熱應激雞肌肉蛋白降解的過程變化，推測熱應激引起的肌肉蛋白降解可能是由于atrogin-1激活泛素化，這一過程可能參與線粒體活性氧的產(chǎn)生和皮質(zhì)酮的分泌。這些研究說明UPP對肉質(zhì)形成的潛在作用。與其他蛋白質(zhì)翻譯后修飾相比，對UPP作用于肉質(zhì)的研究較少，需要進一步的研究闡明這種為改善肉質(zhì)提供基礎(chǔ)的機制。因此，本研究通過對宰后秦川牛背最長肌注射或不注射MG-132，提取不同時間點樣品中的蛋白，測定宰后過程中蛋白的降解情況、泛素蛋白含量、蛋白酶體活性以及微觀結(jié)構(gòu)變化，研究蛋白酶體介導的UPP是否對宰后秦川牛肉產(chǎn)生影響，以期為泛素依賴性蛋白的降解途徑影響宰后秦川牛肉品質(zhì)的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

25 月齡左右的去勢秦川公牛，購于寧夏尚農(nóng)生物科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司。

BCA試劑盒 江蘇碧云天公司；蛋白酶抑制劑德國Calbiochem公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、蛋白酶體抑制劑（MG-132）美國Merck公司；考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）上海麥克林生化科技股份有限公司；蛋白酶體ELISA檢測試劑盒 上海恒遠生物科技有限公司；鈣蛋白酶活性、泛素蛋白ELISA檢測試劑盒 江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NAI-CS150超聲波細胞破碎機 上海那艾精密儀器有限公司；Mini Vac Alpha冷凍離心機 美國Scan Speed公司；ML204/O2電子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；352型酶標儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司；Power PacTM基礎(chǔ)電泳儀 美國Bio-Rad Laboratories公司；TS-2水平脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Fluor Chem FC2凝膠成像系統(tǒng) 美國Alphalnnotech公司；JEM-1400FLASH透射電子顯微鏡日本電子株式會社；EM UC7超薄切片機 德國徠卡公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

分別取3 頭生長發(fā)育正常、體壯無病、25 月齡左右的去勢秦川公牛的背最長肌，在屠宰后立即沿垂直于肌纖維方向分割成120 g的肉樣，將樣品分別進行注射處理。

處理組：宰后立即注射蛋白酶體抑制劑（MG-132先用微量的DMSO制成儲備液，再配制成5 μmol/L溶液）；對照組：注射與處理組中溶解MG-132相同體積的DMSO。每個肌肉樣品平均分為4 個區(qū)域，整個樣品中心和4 個區(qū)域的4 個中心均分別注入2.4 mL試劑，每塊肉樣共需注射12 mL試劑。

注射后，用保鮮膜和錫紙包裹樣品，并置于透氣性為23.5 g/（m2·d）的聚乙烯保鮮袋中。在4 ℃條件下貯藏0、2、4、6、8 d，進行實驗時，不能立即測定指標，將手術(shù)刀及鑷子進行滅菌處理后分別采集不同貯藏期樣本10 g，并將其放置在液氮中速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱存放至待用。

1.3.2 蛋白酶體活性的測定

預冷后的PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）沖洗組織，去除殘留血液，稱質(zhì)量后將組織剪碎。組織與PBS按料液比1∶9（g/mL），并加入蛋白酶抑制劑，于冰上充分研磨。最后將勻漿液于5 000×g離心5～10 min，取上清液進行檢測。實驗操作按照20S蛋白酶體ELISA檢測試劑盒的要求進行，使用酶標儀于450 nm波長處進行測定。宰后貯藏0 d樣品的蛋白酶體活性為100%，計算其余樣品的蛋白酶體相對活性。

（c）The farmer，whose name was Fred，sold us 10 pounds of potatoes.

1.3.3 鈣蛋白酶活性的測定

將組織加入適量生理鹽水搗碎，3 000 r/min離心10 min取上清液進行檢測。實驗操作按照鈣蛋白酶活性ELISA檢測試劑盒的要求進行，使用酶標儀于450 nm波長處進行測定。宰后貯藏0 d樣品的鈣蛋白酶活性為100%，計算其余樣品的酶相對活性。

1.3.4 背最長肌總可溶性蛋白溶解度測定

參考Joo等[12]方法，從宰后4 ℃貯藏0、2、4、6、8 d秦川牛背最長肌樣品中提取總可溶性蛋白，并參考馬旭華等[13]方法測定蛋白含量，繪制標準曲線y=5.761 4x＋0.012 4（R2=0.997 3），y為吸光度，x為蛋白質(zhì)溶解度（mg/g）。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

根據(jù)馬旭華等[13]和黃峰[14]方法對樣品進行處理。制備質(zhì)量分數(shù)5%的濃縮膠和質(zhì)量分數(shù)12%的分離膠，將所得上清液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度調(diào)至1.00 mg/mL，樣品緩沖液（2×）7.5 μL、蛋白質(zhì)溶液樣品15 μL加入聚合酶鏈式反應管中混勻煮沸加熱5 min，室溫冷卻后加入到上樣孔中。蛋白Marker（10～250 kDa）加入10 μL。濃縮膠電流設(shè)置為15 mA，分離膠電流設(shè)置為25 mA，溴酚藍跑到底部、蛋白Marker不同條帶均分離后關(guān)閉電源，電泳完成。小心取出凝膠置于培養(yǎng)皿中加入考馬斯亮藍R-250，50 r/min搖床染色1 h后脫色，脫色劑更換3～5 次，每30 min更換1 次。脫色完成后置于凝膠儀中成像。

1.3.6 泛素蛋白含量的測定

樣品處理同1.3.3節(jié)，實驗操作按照泛素蛋白ELISA檢測試劑盒的要求進行，使用酶標儀于450 nm波長處進行測定。宰后貯藏0 d樣品的泛素蛋白含量為100%，計算其余樣品的泛素蛋白含量。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察

參考姬探等[15]的方法，取不同貯藏期的樣品，切成20 mm×20 mm×20 mm的塊狀，用質(zhì)量分數(shù)3%的戊二醛進行預固定，用質(zhì)量分數(shù)1%四氧化鋨進行再固定。使用丙酮溶液脫水，脫完水的樣品先后經(jīng)過環(huán)氧樹脂（型號為Epon812）和脫水劑進行滲透包埋，用超薄切片機制備約50 nm厚的切片，在室溫條件下用醋酸鈾和枸櫞酸鉛先后染色，用透射電鏡拍照并觀察。觀察倍數(shù)為12 000 倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶體活性的變化

由圖1可知，隨著宰后貯藏時間的延長，對照組和MG-132組的蛋白酶體活性顯著降低（P＜0.05），這與Zhang Yuemei等[16]研究宰后貯藏期間豬腰肉的蛋白酶體活性變化結(jié)果一致。兩組實驗結(jié)果存在差異，其中MG-132組的蛋白酶體活性總體低于對照組，表明MG-132對宰后秦川牛肉中蛋白酶體活性有抑制作用。

圖1 貯藏期間蛋白酶體活性變化Fig.1 Change in proteasome activity during storage

2.2 鈣蛋白酶活性的變化

鈣蛋白酶系統(tǒng)對肉的成熟嫩化具有重要作用。鈣蛋白酶能夠水解肌肉組織中肌纖維蛋白等其他細胞骨架蛋白[17]。由圖2可知，隨著宰后貯藏時間的延長，對照組和MG-132組的鈣蛋白酶活性顯著降低（P＜0.05），兩組實驗結(jié)果相似，其數(shù)值無顯著差異，表明MG-132對宰后秦川牛肉中鈣蛋白酶活性沒有抑制作用。

圖2 貯藏期間鈣蛋白酶活性變化Fig.2 Change in calpain activity during storage

2.3 總可溶性蛋白含量的變化

由圖3可知，隨著宰后貯藏時間的延長，對照組和MG-132組的總可溶性蛋白含量顯著降低（P＜0.05），兩組實驗結(jié)果存在差異，其中MG-132組的總可溶性蛋白含量高于對照組，這是由于MG-132抑制了宰后秦川牛肉中蛋白酶體活性，導致蛋白酶體對宰后牛肉蛋白的降解作用受到抑制，表明MG-132對宰后秦川牛肉中總可溶性蛋白的降解有抑制作用。

圖3 貯藏期間總可溶性蛋白的含量變化Fig.3 Change in total soluble protein content during storage

采用SDS-PAGE分析秦川牛背最長肌蛋白質(zhì)降解情況，根據(jù)秦川牛背最長肌蛋白分子質(zhì)量選擇10～250 kDa為蛋白Marker指示范圍，共有9 條帶。電泳前在每個凹糟中加入等濃度的溶液，保證蛋白降解變化影響條帶的顏色和寬度。由圖4可知，隨著宰后貯藏時間的延長，MG-132組與對照組內(nèi)蛋白條帶的變化有所不同。對照組宰后0～8 d可以觀察到總體高分子質(zhì)量條帶逐漸變淺，低分子質(zhì)量條帶逐漸變深，結(jié)合圖3結(jié)果可知秦川牛背最長肌總可溶性蛋白出現(xiàn)降解現(xiàn)象。MG-132組的蛋白條帶相比于對照組，可以觀察到更加清晰蛋白條帶，40～250 kDa之間的蛋白條帶顯著比對照組深，且有一些條帶比對照組寬；但在20～35 kDa內(nèi)貯藏8 d的I總蛋白條帶比對照組淺，這可能是因為MG-132的抑制作用，誘導宰后肌細胞凋亡以及細胞自噬，使部分蛋白有限地降解[18-19]。通過比較宰后秦川牛背最長肌對照組和MG-132組的SDS-PAGE結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MG-132通過抑制宰后牛肉蛋白酶體的活性，改變了宰后牛肉蛋白的降解，說明蛋白酶體參與了宰后肌肉蛋白的水解過程。

圖4 貯藏期間總可溶性蛋白降解Fig.4 Degradation of total soluble proteins during storage

2.4 泛素蛋白含量的變化

由圖5可知，隨著宰后貯藏時間的延長，對照組和MG-132組的宰后秦川牛背最長肌蛋白的泛素蛋白含量在宰后2 d顯著下降后（P＜0.05），出現(xiàn)升高后降低的趨勢，這可能是由于宰后肌肉中泛素化修飾的蛋白聚合物被分解成許多不同長度的泛素單體或泛素綴合物，導致泛素蛋白含量短暫升高；貯藏期間MG-132組的泛素蛋白含量高于對照組，兩組實驗結(jié)果存在差異。表明MG-132通過抑制蛋白酶體活性，抑制了宰后UPP，使得宰后泛素蛋白含量升高[20]，說明該途徑在宰后依然起作用。

圖5 貯藏期間泛素蛋白含量變化Fig.5 Change in ubiquitin content during storage

2.5 微觀結(jié)構(gòu)變化

在貯藏過程中宰后牛背最長肌微觀結(jié)構(gòu)的變化如圖6所示。宰后貯藏0 d，對照組牛背最長肌肌節(jié)清晰完整，肌纖維排列整齊，肌細胞之間排列較為緊密，Z線結(jié)構(gòu)明顯。隨著貯藏時間延長，肌纖維的結(jié)構(gòu)被破壞，排列較為松散，Z線結(jié)構(gòu)開始模糊，肌原纖維斷裂程度逐漸加重，肌原纖維之間產(chǎn)生較大的縫隙，與劉吉娟[21]研究宰后灘羊結(jié)構(gòu)變化結(jié)果一致。宰后貯藏0 d，MG-132組的牛背最長肌結(jié)構(gòu)與對照組之間無區(qū)別，隨著貯藏時間延長，MG-132組的牛背最長肌結(jié)構(gòu)保留較好，Z線以及明暗帶的邊界都比對照組清晰。表明抑制蛋白酶體可以減少肌肉超微結(jié)構(gòu)的破壞，說明蛋白酶體在宰后貯藏過程中可使肌原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生降解。

圖6 貯藏期間微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.6 Change in microstructure during storage

2.6 總可溶性蛋白與泛素蛋白含量的相關(guān)分析

為了進一步探究宰后貯藏期間秦川牛背最長肌中UPP是否對肉品質(zhì)產(chǎn)生影響，對對照組的總可溶性蛋白與泛素蛋白含量進行Pearson相關(guān)性分析。由表1可知，宰后貯藏期間總可溶性蛋白與蛋白酶體活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與泛素蛋白含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明宰后牛背最長肌蛋白降解與泛素蛋白含量變化有著密切的關(guān)系。

表1 總可溶性蛋白與泛素化水平的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between proteasome activity and ubiquitin content

3 討論

真核細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的3 種主要降解途徑有UPP、自噬溶酶體途徑、鈣蛋白酶途徑[22]，蛋白酶體是UPP中催化泛素與底物蛋白偶聯(lián)體降解的關(guān)鍵酶，包括20S蛋白酶體和26S蛋白酶體[23]。MG-132是一種醛基肽類特異性蛋白酶體抑制劑，是目前公認的UPP蛋白酶體抑制劑，可快速進入細胞，抑制蛋白酶體活性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，蛋白酶體活性顯著降低（P＜0.05），對照組較MG-132組活性較高，說明本實驗注射的5 μmol/L MG-132對宰后秦川牛背最長肌的蛋白酶體活性有一定抑制作用。雖然蛋白酶體可能與早期肌原纖維去穩(wěn)定無關(guān)[25]，但是在宰后貯藏后期的牛背最長肌中蛋白酶體依然保持高活性，對肉質(zhì)有重要影響，蛋白酶體的穩(wěn)定性，使它們能夠在機體死后與其他蛋白水解系統(tǒng)協(xié)同作用，在肉嫩化中發(fā)揮作用[26]。由于鈣蛋白酶也可以影響水解蛋白的結(jié)果[27]，一定濃度的MG-132會抑制鈣蛋白酶活性，因此，為排除鈣蛋白酶活性對實驗結(jié)果的影響，測定對照組和MG-132組的鈣蛋白酶活性。結(jié)果表明，抑制劑并沒有影響鈣蛋白酶的活性，實驗觀察到的蛋白降解以及肌原纖維結(jié)構(gòu)的差異與鈣蛋白酶無關(guān)，因此，在后續(xù)實驗中發(fā)揮作用的是蛋白酶體。

隨著宰后貯藏時間的延長，MG-132組的總可溶性蛋白含量高于對照組，表明MG-132對宰后秦川牛肉中總可溶性蛋白的降解有抑制作用。結(jié)合SDS-PAGE結(jié)果分析可知，對照組的秦川牛背最長肌總可溶性蛋白出現(xiàn)明顯降解現(xiàn)象，高分子質(zhì)量蛋白逐漸被降解，低分子質(zhì)量蛋白逐漸累積。40～250 kDa內(nèi)的MG-132組蛋白條帶顯著深于對照組，且蛋白條帶更加清晰；在20～35 kDa內(nèi)有蛋白條帶比對照組淺，這可能是因為MG-132的抑制作用，誘導宰后肌細胞凋亡以及細胞自噬參與部分蛋白的有限降解；在35～70 kDa內(nèi)蛋白條帶比對照組深，已知肌動蛋白、原肌球蛋白分子質(zhì)量在該范圍內(nèi)，已鑒定出蛋白酶體的潛在底物有肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白[28]，肌球蛋白是骨骼肌中豐富的肌原纖維蛋白，具有收縮功能和調(diào)節(jié)功能，尤其是在骨骼肌的收縮功能上發(fā)揮重要作用，肌動蛋白等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白的水解和肌節(jié)變化是導致宰后成熟過程中肉質(zhì)嫩化的主要原因[29-30]；隨著貯藏時間延長，肌動蛋白、肌球蛋白等肌原纖維蛋白的持續(xù)降解促使肌原纖維之間形成間隙，并隨降解程度加劇，縫隙越來越寬。MG-132組的宰后牛背最長肌的微觀結(jié)構(gòu)保留較好，Z線、M線以及明暗帶的邊界都較對照組清晰。綜上所述，蛋白酶體可以降解宰后牛肉總可溶性蛋白，并且在宰后貯藏過程中使肌原纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，參與宰后肌肉蛋白的水解過程，改變宰后肌肉的超微結(jié)構(gòu)，影響宰后嫩度。

宰后秦川牛背最長肌的泛素蛋白含量發(fā)生變化，MG-132組的泛素蛋白含量總體高于對照組，表明蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體活性，抑制宰后泛素化蛋白的UPP降解，使得泛素蛋白含量升高；對總可溶性蛋白與泛素蛋白含量進行Pearson相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)宰后貯藏期間總可溶性蛋白與蛋白酶體活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與泛素蛋白含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明宰后蛋白降解與泛素蛋白含量變化有著密切的關(guān)系。UPP在宰后調(diào)理期間保持活躍[26]，此外，骨骼肌中的主要降解系統(tǒng)之一是UPP，它選擇性地降解蛋白質(zhì)[32]。Liu Yue等[9]研究發(fā)現(xiàn)UPP途徑對宰后羊肉成熟發(fā)揮作用，影響肌肉收縮；表明蛋白酶體介導的UPP通過對宰后泛素蛋白的降解，影響宰后蛋白的降解，說明宰后UPP對肉質(zhì)形成具有潛在作用。綜上所述，宰后秦川牛肉背最長肌中蛋白酶體除了可以單獨地降解蛋白，破壞宰后肌原纖維結(jié)構(gòu)，還可以通過UPP影響泛素依賴性蛋白的降解，進一步影響宰后牛肉蛋白的降解。

4 結(jié)論

本研究通過對宰后秦川牛背最長肌注射或不注射蛋白酶體抑制劑MG-132，提取不同貯藏時間樣品中的蛋白，研究宰后秦川牛背最長肌在貯藏過程中蛋白的降解情況、泛素蛋白含量、蛋白酶體活性以及微觀結(jié)構(gòu)變化，得到以下研究結(jié)論：隨著宰后貯藏時間的延長，MG-132組中的蛋白酶體活性總體低于對照組，總可溶性蛋白、泛素蛋白含量總體高于對照組；SDS-PAGE結(jié)果顯示，MG-132組在40～250 kDa之間總可溶性蛋白的蛋白條帶整體深于對照組；MG-132組的牛背最長肌結(jié)構(gòu)保留較好，Z線以及明暗帶的邊界都較對照組清晰，且總可溶性蛋白與泛素蛋白含量變化呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。綜上所述，MG-132對宰后秦川牛肉中蛋白酶體有抑制作用，改變了宰后牛肉蛋白的降解，抑制宰后牛肉UPP中泛素化蛋白的降解，減少肌肉結(jié)構(gòu)的破壞，說明宰后UPP對肉質(zhì)形成具有潛在作用，宰后秦川牛肉背最長肌中蛋白酶體除了可以單獨降解蛋白，破壞宰后肌原纖維結(jié)構(gòu)，還通過介導UPP影響泛素依賴性蛋白的降解，最終影響宰后牛肉的品質(zhì)。