張欣珂，趙 旭，劉沛通，段長青，段雪榮，楊 健，李德美,，范雪梅,

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.北京農(nóng)學(xué)院“一帶一路”國際葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新院，北京 102206；3.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264600；4.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；5.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；6.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；7.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）昌黎葡萄酒業(yè)有限公司，河北 秦皇島 066600）

葡萄酒是世界上最流行的酒精飲料之一，在我國也受到了廣大消費(fèi)者尤其是年輕消費(fèi)者的青睞。據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織的統(tǒng)計(jì)，2016年我國葡萄酒消費(fèi)量達(dá)到1.90億 L，葡萄酒的產(chǎn)量也達(dá)到了1.32億 L，葡萄酒已經(jīng)成為我國酒精飲料市場的重要組成部分。

葡萄酒因其復(fù)雜的風(fēng)味特性受到廣大消費(fèi)者的喜愛，而顏色則是葡萄酒最直觀的感官屬性。花色苷是貢獻(xiàn)紅葡萄酒顏色最重要的物質(zhì)，但由于花色苷種類多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、容易降解或和其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，且易受到釀造工藝的影響，人們對其對葡萄酒的顏色貢獻(xiàn)認(rèn)識(shí)仍然不足。因此本文針對紅葡萄酒中的花色苷類物質(zhì)，對其來源、呈色、在葡萄酒中的發(fā)生的反應(yīng)，以及在葡萄酒各個(gè)生產(chǎn)階段的變化和對紅葡萄酒顏色的影響進(jìn)行綜述，以期對花色苷以及葡萄酒呈色相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行梳理和匯總，同明為我國葡萄酒研究者及行業(yè)人員提供理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)依據(jù)。

1 花色苷的生物合成與呈色特性

1.1 花色苷的生物合成

紅葡萄酒中花色苷主要來源于葡萄的果皮（或染色葡萄品種的果肉），隨著紅葡萄酒帶皮發(fā)酵工藝的進(jìn)行，花色苷逐漸被浸漬到酒溶液中。和其他植物中花色苷的合成路徑一樣，葡萄中的花色苷合成來源于苯丙烷-類黃酮路徑（圖1）[1-4]：苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、肉桂酸4-羥化酶（cinnamate4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰鋪酶A連接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL）的催化下形成對香豆酰鋪酶A；然后1分子對香豆酰鋪酶A和3分子丙二酰鋪酶A經(jīng)查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）逐步催化形成黃色的4,2’,4’,6’-四羥基查耳酮；隨后，4,2’,4’,6’-四羥基查耳酮在查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下轉(zhuǎn)化成無色的柚皮素；在黃烷酮-3-羥化酶（flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）的催化下，柚皮素C環(huán)C3位被羥基化，生成二氫山柰酚（dihydrokaempferol，DHK）；之后類黃酮3’羥化酶（flavonoid 3’-hydroxylase，F(xiàn)3’H）將DHK的B環(huán)催化羥基化，生成二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ），或者在類黃酮3’,5’羥化酶（flavonoid 3’,5’-hydroxylase，F(xiàn)3’5’H）的催化下生成二氫楊梅酮（dihydromyricetin，DHM），同明DHQ也可被F3’5’H催化形成DHM；所形成的3 種二氫黃酮醇（DHK、DHQ、DHM）被二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）催化還原為相應(yīng)的黃烷-3,4-順式二醇，也稱之為無色花色素，DHK、DHQ、DHM分別對應(yīng)形成無色花葵素、無色花青素和無色花翠素。上述各無色花色素在花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）的催化下形成對應(yīng)的花色素，并在尿苷二磷酸葡糖：花色素葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphateglucose:anthocyanidin glucosyltransferase，UFGT）的催化下形成花色苷，分別對應(yīng)花葵素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷；隨后，在花色苷甲基轉(zhuǎn)移酶（anthocyaninO-methyltransferase，MT）的催化下，花青素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷B環(huán)上3位和5位的羥基甲基化，最終形成甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。歐亞種葡萄（Vitis viniferaL.）中的花色苷主要以3-O-葡萄糖苷的形式存在。此外，花色苷在酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferases，ACT）的作用下對3-O-葡萄糖的C6”位置羥基?；瑓⑴c?；幕鶊F(tuán)往往是乙酸或者對香豆酸（也有少量的咖啡酸），最終形成花色苷-3-O-(6”-O-乙?；?葡萄糖苷或者花色苷-3-O-(6”-O-香豆酰化)葡萄糖苷[5]。

圖1 歐亞種葡萄中花色苷的生物合成路徑[1-5]Fig.1 Biosynthesis pathways of anthocyanins in Vitis vinifera L.[1-5]

1.2 花色苷的呈色特性

紅葡萄酒呈現(xiàn)紅色主要是因?yàn)榛ㄉ盏拇嬖凇；ㄉ罩猿尸F(xiàn)出紅色，是因?yàn)槠洫?dú)特的C6-C3-C6所形成的廣闊10π電子共軛結(jié)構(gòu)使其在綠色波長（520 nm）范圍具有光譜吸收[6-7]，從而呈現(xiàn)出互補(bǔ)色紅色。同明花色苷B環(huán)上取代基的種類和數(shù)目（羥基和甲氧基）以及糖苷上的?；鶊F(tuán)會(huì)影響花色苷最大吸收波長的移動(dòng)。通過對葡萄中5 種主要花色苷的研究發(fā)現(xiàn)，B環(huán)上2 個(gè)取代基的花色苷（花青素、甲基花青素）的色調(diào)偏橙紅色，3 個(gè)取代基的花色苷（花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素）色調(diào)偏紫紅色，同明，隨著甲氧基數(shù)目的增加，花色苷的色調(diào)往紫色移動(dòng)[8]。此外花色苷的紫色色調(diào)也與羥基數(shù)目的增加有關(guān)[9]。Zhao Xu等[10]通過測定溶解于pH 3.6的模擬酒溶液中花色苷的光譜性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的最大吸收波長分別為514、514、522、523、524 nm，與Heredia等[8]的研究結(jié)果基本一致。在葡萄酒環(huán)境下常見的5 種花色苷的顏色表現(xiàn)如圖2所示。

圖2 紅葡萄酒中常見5 種花色苷的顏色表現(xiàn)Fig.2 Color development of five common anthocyanins in red wine

花色苷的?；矔?huì)影響花色苷的呈色特性，如二甲花翠素-3-O-(6”-O-香豆?；?-葡萄糖苷的最大吸收波長為528 nm，相對于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的521 nm吸收波長產(chǎn)生了明顯的紅移效應(yīng)。但二甲花翠素-3-O-(6”-O-乙酰化)-葡萄糖苷的最大吸收波長仍為521 nm，未表現(xiàn)出紅移效應(yīng)[11]。同明，Giusti等[12]研究了花葵素的糖苷化和酰基化對呈色的影響，發(fā)現(xiàn)芳香?；愋腿鐚ο愣顾狨；軌?qū)е录t移效應(yīng)，使最大吸收波長向長波長方向移動(dòng)，相似的結(jié)論也在花青素中被證實(shí)[13]，而脂肪?；愋腿绫岷鸵阴；]有對光譜造成明顯影響[14]。Zhao Xu等[11]研究了二甲花翠素-3-O-(6”-O-乙?；?-葡萄糖苷的呈色特性，發(fā)現(xiàn)乙?；鶊F(tuán)并未明顯改變花色苷自身的呈色特性，反而乙?；鶊F(tuán)會(huì)影響其他鋪色素（沒食子酸、表兒茶素和槲皮素-3-O-葡萄糖苷）與花色苷發(fā)色團(tuán)之間的鋪色作用而影響呈色，具體表現(xiàn)為乙?；鶊F(tuán)通過空間位阻作用阻礙了鋪色分子的靠近而減弱了鋪色作用。Rustioni等[15]通過理論計(jì)算?；ㄉ盏臉?gòu)象發(fā)現(xiàn)，花色苷發(fā)色團(tuán)和?；枷慊鶊F(tuán)分子內(nèi)的“π-π”堆積是造成紅移效應(yīng)的原因。而Zhao Xu等[11]采用二維核磁共振和量子化學(xué)模擬的方法進(jìn)一步證實(shí)了二甲花翠素-3-O-(6”-O-乙?；?-葡萄糖苷產(chǎn)生的紅移現(xiàn)象是由香豆?；鶊F(tuán)折疊至花色苷分子中B環(huán)的上方形成的傾斜-平行的“π-π”堆積產(chǎn)生的分子內(nèi)鋪色作用引起的。

2 花色苷的酸堿平衡及降解

2.1 花色苷的酸堿平衡

花色苷在酸性的葡萄酒環(huán)境中（pH 3～4）以多種形態(tài)存在，并且它們之間可以互相轉(zhuǎn)化（圖3）。其中一部分花色苷以紅色的烊鹽離子的形式存在，這也是紅葡萄酒呈現(xiàn)紅色的根本原因；同明還存在紫色或藍(lán)色的醌式堿、無色的半縮醛和淺黃色的查耳酮[16]。人們對花色苷不同的結(jié)構(gòu)以及在不同pH值下的轉(zhuǎn)換探索了數(shù)十年，直至20世紀(jì)90年代末期才對其轉(zhuǎn)化過程有了全面的了解[17-19]。

圖3 紅葡萄酒中花色苷各種形態(tài)的平衡[16]Fig.3 Equilibria of anthocyanin species in red wine[16]

在酸性水溶液中，花色苷的烊鹽離子主要存在兩個(gè)平衡，即酸堿平衡和水化平衡。氫離子均參與這兩個(gè)平衡，因此，溶液中花色苷的形態(tài)受到pH值的影響。對于酸堿平衡來說，花色苷本身具有多個(gè)酚羥基，是一個(gè)多元酸，當(dāng)環(huán)境pH值不斷升高，花色苷會(huì)連續(xù)丟失酚羥基上的質(zhì)子（通常是C7、C5和C4’上的氫原子，形成其共軛堿（醌式堿），相應(yīng)的酸堿平衡常數(shù)pKa1和pKa2約在4和7左右[20]。根據(jù)Brouillard的結(jié)果[21]，葡萄酒中最主要的花色苷即二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的pKa約為4.25。花色苷的水化平衡發(fā)生在烊鹽離子和半縮醛之間：在水溶液中花色苷烊鹽離子的C環(huán)上的C2位易受到水分子的攻擊，加成一個(gè)羥基并失去一個(gè)質(zhì)子形成半縮醛結(jié)構(gòu)。這一步也可以看作烊鹽離子解離出一個(gè)氫離子的過程，因此其形成的半縮醛為其共軛堿。對于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，該平衡的水和平衡常數(shù)pKh為2.6[21]。此外，半縮醛還存在著成環(huán)-開環(huán)平衡的互變異構(gòu)，形成順式查耳酮，該過程與pH值并無直接關(guān)系，但溫度升高會(huì)有利于查耳酮的形成[17]。順式查耳酮會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化為反式查耳酮形成新的平衡，但這一步反應(yīng)較慢[22]。上述平衡反應(yīng)的反應(yīng)速率也不盡相同，烊鹽離子與醌式堿之間直接得失質(zhì)子，是最快的反應(yīng)，可以在數(shù)微秒內(nèi)完成；烊鹽離子水化為半縮醛的反應(yīng)速率次之，可以在數(shù)秒內(nèi)完成，緊接著是半縮醛開環(huán)形成順式查耳酮的反應(yīng)，可以在數(shù)小明內(nèi)完成，而順式和反式查耳酮的平衡是上述所有平衡反應(yīng)中最慢的一步，而且往往僅有很少量的反式查耳酮被觀測到[22]。

可以看出，花色苷的烊鹽離子和其他多種結(jié)構(gòu)存在得失質(zhì)子的平衡，因此，其他形式均可以作為花色苷烊鹽離子的共軛堿，將所有的平衡考慮為一個(gè)，即烊鹽離子與所有其他形態(tài)的平衡，其平衡式可以表示為式（1），整個(gè)反應(yīng)的表觀平衡常數(shù)Ka’可以表示為式（2）。

可以看出整個(gè)平衡反應(yīng)的表觀平衡常數(shù)可以通過計(jì)算各個(gè)平衡常數(shù)所得。通過測定Ka’則可以表征溶液中花色苷烊鹽離子與花色苷其他形式的比例。以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為例，其pKa’為2.55[20]，遠(yuǎn)低于正常紅葡萄酒的pH值范圍，因此紅葡萄酒中大部分二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷并不是以紅色的烊鹽離子形式存在，而是與半縮醛、醌式堿和查耳酮形式共同存在。相比之下，半縮醛被認(rèn)為是紅葡萄酒中花色苷最主要的存在形式，其比例在常見的紅葡萄酒pH值范圍內(nèi)（3.5～4.0）可達(dá)到一半以上[23]。在pH＜3.0的情況下，花色苷主要以紅色烊鹽離子和半縮醛的形式共存；在pH 3.0～4.0之間，花色苷主要以半縮醛、烊鹽離子、醌式堿、順式查耳酮和反式查耳酮的形式共存；當(dāng)pH＞4.0，花色苷主要以半縮醛、醌式堿、順式查耳酮和反式查耳酮的形式存在。

2.2 花色苷的降解

花色苷在溶液中并不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生降解，其降解途徑可以分為因共價(jià)鍵斷裂造成的裂解和氧化造成的降解，這兩個(gè)過程的機(jī)理不同，影響因素也不一樣。關(guān)于分子內(nèi)共價(jià)鍵斷裂而導(dǎo)致花色苷降解的具體機(jī)理尚不清楚，而最早研究該過程的是Markaris等[24]，他們推測該過程涉及花色苷C環(huán)的開環(huán)和查耳酮的形成。Sadilova等[25]對多種漿果中花青素-3-O-葡萄糖苷和花葵素-3-O-葡萄糖苷的熱降解進(jìn)行了研究，在pH 1的條件下檢測到了花色素、間苯三酚醛、原兒茶酸和4-羥基苯甲酸等產(chǎn)物，證明了花色苷的裂解依次經(jīng)歷了糖苷的水解和C環(huán)的裂解等過程。但由于查耳酮不穩(wěn)定，在該研究中并沒有被檢測到，因此該降解是否經(jīng)歷了查耳酮過程也尚不清楚。而在后續(xù)的研究中[26]，在pH 3.5的條件下檢測到了查耳酮的糖苷形式（但仍沒有檢測到不帶糖苷的查耳酮），證明了糖苷的水解和C環(huán)的開環(huán)步驟先后受到pH值影響，進(jìn)而確定了先開環(huán)后糖苷水解的兩條路徑（圖4），但不論以哪種途徑進(jìn)行，其最終產(chǎn)物都是酚酸和間苯三酚醛。這一結(jié)論也在后續(xù)對花青素-3-O-槐二糖的降解實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[27]。

圖4 花色苷降解的路徑[25,28]Fig.4 Degradation pathways of anthocyanins[25,28]

花色苷和其他多酚類物質(zhì)一樣，容易被氧化。造成酚類物質(zhì)氧化的來源是氧氣，而生產(chǎn)貯存過程中氧氣會(huì)以不同的速率進(jìn)入到葡萄酒酒中，如發(fā)酵過程中的封閉式循環(huán)淋帽操作能夠增加2.2 mg/L的溶解氧氣濃度，開放式見氧循環(huán)能夠增加7.4 mg/L的溶解氧氣濃度，成品酒的倒罐操作會(huì)增加0.2 mg/L的溶解氧氣濃度[29]；而在陳釀過程中橡木桶和天然軟木塞的透氧率分別約為9.51～12.34 mg/（L·年）[30]和0.3～4.8 mg/（L·年）[31]，因此葡萄酒中的氧化無明無刻不在發(fā)生。從機(jī)理上來看，葡萄酒中的氧化主要分為酶促氧化和非酶氧化。前者絕大多數(shù)發(fā)生在未完成發(fā)酵的葡萄汁中[32]，而在發(fā)酵完成的酒中，較高含量的酒精引發(fā)了酶類物質(zhì)的沉淀與失活，酶促氧化并不容易發(fā)生[33]。健康的葡萄中含有多酚氧化酶，而在被灰霉菌感染的葡萄中含有漆酶，后者有著更加廣譜的催化底物，而且更耐受二氧化硫（SO2），因此也更容易導(dǎo)致酶促氧化反應(yīng)[33]。在正常葡萄汁的酶促氧化反應(yīng)過程中，最重要的酶是多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）。酶促氧化的底物主要是肉桂酸的衍生物類[33]，而類黃酮類物質(zhì)，包括花色苷、黃烷醇和黃酮醇則不會(huì)被PPO催化或者被催化氧化的速度很慢[34]。酚類物質(zhì)的酶促機(jī)理如圖5所示：1）單體酚類物質(zhì)被氧化為鄰苯二酚，然后鄰苯二酚在PPO和氧氣的存在下被氧化為鄰苯二醌；2）鄰苯二醌具有很強(qiáng)的氧化性，能夠氧化花色苷以及其他的酚類物質(zhì)形成醌，或者氧化其他氧化還原電勢低的物質(zhì)如SO2、抗壞血酸等，而自身被還原為鄰苯二酚[35]；3）醌類物質(zhì)自身會(huì)發(fā)生聚合，形成棕色色素物質(zhì)，造成葡萄尤其是白葡萄汁的褐化[32]。

圖5 葡萄酒中花色苷的酶促反應(yīng)機(jī)理[35]Fig.5 Enzymatic oxidation of anthocyanins in wine[35]

酶促氧化主要發(fā)生在未發(fā)酵或未發(fā)酵完全的葡萄酒中，而在葡萄酒中氧化反應(yīng)主要以非酶氧化為主。在非酶氧化過程中，氧氣并不直接參與反應(yīng)，而是經(jīng)過逐步變化后形成過氧化物或者自由基參與氧化還原反應(yīng)，這些物質(zhì)統(tǒng)稱為活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）。空氣中20.9%（體積分?jǐn)?shù)）的成分為氧氣，而其中絕大多數(shù)是穩(wěn)定的三線態(tài)氧分子（triplet oxygen，3O2），在溶液中得到電子會(huì)形成超氧陰離子自由基（superoxide radical anion，）。人們普遍認(rèn)為這一步反應(yīng)是由過渡金屬離子催化而成，如Fe2+[29,36]。在葡萄酒的pH值下，易和氫離子結(jié)合形成氫過氧化物自由基（hydroperoxyl radical，HOO·）。進(jìn)一步得到電子形成過氧化物陰離子（peroxide anion，），而在葡萄酒環(huán)境下會(huì)結(jié)合氫離子形成過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）。進(jìn)一步得到電子并和氫離子結(jié)合形成羥自由基（hydroxyl radical，·OH）。在這些ROS中，HOO·并沒有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，并不能奪取一般有機(jī)物的氫原子，但其能夠奪取親電性較強(qiáng)的酚羥基中的氫原子，將其氧化為半醌自由基，半醌自由基被H2O2[29]或Fe3+進(jìn)一步氧化為醌[37-38]（圖6）?！H具有極強(qiáng)的氧化性，幾乎能從任何有機(jī)物中奪取氫原子，而本身被還原為水[36]，因此主要與葡萄酒中的濃度較高的成分發(fā)生反應(yīng)，如乙醇和酒石酸等。需要注意的是，上述的氧化過程主要發(fā)生在含有鄰苯二酚（或?qū)Ρ蕉樱┑慕Y(jié)構(gòu)中，即含有1,2,3-3羥基苯酚（焦棓酚）基團(tuán)和1,2-2羥基芳香環(huán)（兒茶酚）結(jié)構(gòu)的物質(zhì)中。這是因?yàn)槠溲趸纬傻闹虚g產(chǎn)物半醌自由基能夠與在鄰位或?qū)ξ坏难踉影l(fā)生離域共軛，更加穩(wěn)定[29]。在葡萄酒的花色苷中具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的酚類物質(zhì)有花翠素、花青素和甲基花青素類，其他的酚類物質(zhì)有咖啡酸類、沒食子酸類、槲皮素類和所有的黃烷醇類物質(zhì)。最終，這些物質(zhì)的多酚氧化產(chǎn)物醌會(huì)和葡萄酒中的多種親核物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，如SO2、谷胱甘肽、抗壞血酸、氨基酸、硫醇類物質(zhì)等[39]，造成葡萄酒品種果香的喪失和氧化風(fēng)格等。此外，醌與多酚之間（尤其是含有間苯三酚結(jié)構(gòu)的黃烷醇A環(huán)）、與半醌自由基之間也可以形成成對電子而形成共價(jià)鍵，依次形成棕色的多聚物，造成葡萄酒顏色的褐化[35,37,40-41]。醌與其他還原性物質(zhì)的反應(yīng)是葡萄酒氧化持續(xù)的關(guān)鍵，因?yàn)镠2O2/O2在葡萄酒常見pH值下（pH 3.5）的氧化還原電勢（E3.5約為0.45 V）低于醌/二苯酚（E3.5約為0.6 V）[42]，因此在熱動(dòng)力學(xué)上是不利于發(fā)生酚的氧化反應(yīng)的。所以，根據(jù)勒夏特列原理，葡萄酒中還原物質(zhì)的反應(yīng)造成醌類物質(zhì)的消耗是葡萄酒持續(xù)氧化的關(guān)鍵。

圖6 葡萄酒中ROS的形成及酚類物質(zhì)的氧化機(jī)理[29,37]Fig.6 Formation of reactive oxygen species and mechanism of oxidation of phenolics in wine[29,37]

除了上述經(jīng)典的氧化機(jī)理之外，近些年來關(guān)于花色苷物質(zhì)其他的氧化途徑也有陸續(xù)報(bào)道?；ㄉ漳軌蛲ㄟ^拜耳-維利格反應(yīng)被H2O2氧化（圖7），其氧化產(chǎn)物為對應(yīng)的酚酸和Anthocyanone[43]。從圖6可知，葡萄酒中具備生成H2O2的條件，因此花色苷被H2O2直接氧化在酒溶液中有可能發(fā)生。事實(shí)上，Anthocyanone和相應(yīng)的酚酸在模擬酒和葡萄酒溶液中也都有被鑒定到[44-45]。此外，在加入H2O2的乙醇水溶液中，花青素會(huì)經(jīng)歷C環(huán)的重排形成新的氧化產(chǎn)物（圖7A）[46]，但該物質(zhì)目前只在含有花青素的模擬溶液中被鑒定到，在葡萄酒中鮮有報(bào)道被發(fā)現(xiàn)。

圖7 過氧化氫氧化花色苷降解的機(jī)理[43-44,46]Fig.7 Mechanism of hydrogen peroxide-mediated oxidative degradation of anthocyanins[43-44,46]

3 紅葡萄酒生產(chǎn)過程中花色苷及顏色的變化

3.1 發(fā)酵過程

紅葡萄酒的顏色完全來源于發(fā)酵過程中帶皮浸漬工藝對葡萄皮中花色苷和其他多酚類物質(zhì)的萃取。往往在前浸漬階段（如冷浸漬）即可發(fā)生顏色的浸出[47]。在酒精發(fā)酵過程中，隨著酵母的活動(dòng)（導(dǎo)致自然升溫浸漬加強(qiáng)）以及乙醇含量的增加，葡萄酒的顏色也逐漸加深。通常紅葡萄酒在酒精發(fā)酵結(jié)束前以及后浸漬階段顏色最深，但此明葡萄酒中花色苷的含量并非最高且出現(xiàn)下降。但由于此明酒液中浸出了大量非花色苷酚類物質(zhì)，尤其是浸漬速率較慢的、存在于葡萄皮和葡萄籽中的單寧類物質(zhì)含量大大提升[48-49]，這些酚類物質(zhì)作為鋪色素能夠通過鋪色作用大大加深葡萄酒的顏色。據(jù)報(bào)道，新鮮發(fā)酵的葡萄酒中的色度有30%～50%由鋪色作用貢獻(xiàn)[50]。從基質(zhì)的組成上來看，酒精發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇雖然可以促進(jìn)果皮中花色苷的浸出，但也會(huì)減弱鋪色作用[51-52]。同明，酒精發(fā)酵過程中酵母活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，如琥珀酸（葡萄酒中質(zhì)量濃度約為0.6～1.2 g/L[53]）和乳酸[54]，同明酵母含有的肉桂酸酯水解酶可以水解肉桂酸酒石酸酯（葡萄中羥基肉桂酸的主要形式）[55]，釋放出酒石酸[56]，降低酒液的pH值，提高花色苷紅色烊鹽離子的比例。同樣的道理，蘋果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）后的葡萄酒顏色往往變淺，主要是由于MLF帶來的降酸作用導(dǎo)致葡萄酒酸度下降[57-58]，最終導(dǎo)致花色苷紅色烊鹽離子的比例下降，不穩(wěn)定半縮醛的比例上升（圖3），進(jìn)一步加速了花色苷的降解。同明有研究表明除去本身因酸度帶來的顏色深度下降，MLF本身也會(huì)減弱葡萄酒的顏色，但具體的原因尚未揭示[59]。Zhang Bo等[60]研究了‘赤霞珠’葡萄酒在整個(gè)發(fā)酵的顏色變化，并采用CIELAB方法跟蹤記錄葡萄酒顏色變化，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中葡萄酒的L*值（表征色度，值越低表明顏色越深）在發(fā)酵過程中整體下降，在酒精發(fā)酵結(jié)束和MLF過程中后達(dá)到最低（即顏色最深），隨后持續(xù)升高；葡萄酒的a*值（表征紅綠色調(diào)，值越高表明紅色色調(diào)越多）在酒精發(fā)酵結(jié)束最高（即紅色色調(diào)最高）；葡萄酒的b*值（表征黃藍(lán)色調(diào)，值越高表明黃色色調(diào)越多）在發(fā)酵過程中持續(xù)升高，在MLF結(jié)束后達(dá)到最大值（即黃色色調(diào)最高）。

紅葡萄酒中花色苷的含量會(huì)隨著生產(chǎn)工藝不斷發(fā)生變化（圖8）。花色苷主要存在于釀酒葡萄果皮細(xì)胞的液泡中（也存在于一些染色品種的果肉中）[61-62]，紅葡萄酒的帶皮發(fā)酵工藝保證了花色苷從葡萄皮中浸漬出來。從微觀上來看，花色苷的浸漬經(jīng)歷了以下3 個(gè)步驟[63]：1）液體經(jīng)葡萄皮組織空隙通過擴(kuò)散作用進(jìn)入到葡萄皮細(xì)胞中的花色苷分子附近；2）花色苷分子通過濃度梯度溶解擴(kuò)散到溶液中；3）溶解了花色苷的溶液再次通過擴(kuò)散作用進(jìn)入到外界液體。因此，一切可以影響上述過程的因素均可以增加花色苷的浸出，如提高葡萄的破碎度和增加發(fā)酵打循環(huán)的強(qiáng)度（增大花色苷傳質(zhì)擴(kuò)散面積和擴(kuò)散濃度梯度）、提高發(fā)酵溫度（增加分子熱運(yùn)動(dòng)和花色苷溶解度）[63-64]、使用SO2（增加花色苷的溶解度并降低溶液的介電常數(shù)）[64]、使用果膠酶（破壞葡萄皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)減小擴(kuò)散孔徑長度）[65-66]等。從宏觀上看，伴隨著帶皮浸漬，花色苷的萃取程度逐漸增大。葡萄酒發(fā)酵液中的花色苷含量往往在酒精發(fā)酵結(jié)束前達(dá)到最高，隨后開始下降[67-68]（圖8），其原因可能是因?yàn)殡S著酒精度的升高，溶液的極性逐漸下降，而具有烊鹽正離子結(jié)構(gòu)的紅色花色苷分子的溶解度下降，降低了其在溶液中的含量[49]。同明，由于皮渣以及大量的固體顆粒物（如酵母細(xì)胞壁）會(huì)吸附花色苷分子[69-77]，導(dǎo)致溶液中花色苷含量下降。通常干紅葡萄酒會(huì)在酒精發(fā)酵完成后進(jìn)行皮渣分離操作，有明對于一些高品質(zhì)的葡萄酒來說還需要進(jìn)行后浸漬來增強(qiáng)單寧物質(zhì)的浸出。皮渣的分離意味著紅葡萄酒永久失去了花色苷的來源，此后其中花色苷的含量不可能高于皮渣分離操作前的含量。MLF也往往發(fā)生在皮渣分離之后，在該過程中花色苷有顯著的下降[72]。但有實(shí)驗(yàn)表明，MLF過程中一些其他的因素如發(fā)酵明間和采用容器（橡木桶等）的影響要比因乳酸菌代謝造成的影響更加重要[73]。

圖8 紅葡萄酒各生產(chǎn)階段花色苷、花色苷衍生物及色度變化的示意圖Fig.8 Evolution of anthocyanins,anthocyanin derivatives and color intensity during various stage of red wine production

3.2 陳釀過程

紅葡萄酒在完成發(fā)酵過程后往往還需要經(jīng)過陳釀。在陳釀過程中，葡萄酒的顏色不斷發(fā)生變化。對于色度來說（采用色度指數(shù)（color index，CI）或CIELAB系統(tǒng)中的L*值表示），紅葡萄酒不論是在瓶儲(chǔ)還是桶儲(chǔ)的過程中色度往往減?。–I值減小或者L*值增大），而紅色色調(diào)（采用A520nm或CIELAB中的a*值表示）也隨之減小，但黃色色調(diào)（采用A420nm或CIELAB中的b*值表示）往往增大[74-78]。因此整體的色澤表現(xiàn)為隨著陳釀的進(jìn)行，葡萄酒的顏色由深紫紅色向淺橙紅或淺磚紅色轉(zhuǎn)變，而陳釀過程中紅葡萄酒顏色的變化主要是由于花色苷降解以及和其他物質(zhì)反應(yīng)生成花色苷衍生物決定的。

在陳釀過程中不論是使用橡木桶（桶中陳釀）還是葡萄酒瓶（瓶中陳釀），花色苷的含量均呈現(xiàn)下降的趨勢[79-82]。兩者相比較，橡木桶由于本身的透氣性，能夠帶來微氧的效果[83]。有研究表明花色苷含量在不銹鋼罐中的下降速率較橡木桶要慢，可能是不銹鋼罐減緩了氧化降解[84]。但也有一些研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過橡木桶中陳釀，花色苷含量比不銹鋼罐中高，可能是由于橡木中含有的酚類物質(zhì)浸出帶來的抗氧化和鋪色效果減緩了花色苷的降解[78]，這可能與不同葡萄品種相關(guān)[85]，也可能是不同橡木桶帶來的效果[86]。而在長期的瓶中貯藏過程中，花色苷則呈現(xiàn)穩(wěn)定下降的趨勢[81-82]。

在陳釀過程中，花色苷會(huì)和多種物質(zhì)反應(yīng)，生成花色苷衍生物。這些花色苷衍生物包括花色苷和小分子羰基類化合物（如酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)生的丙酮酸和乙醛）反應(yīng)生成的Vitisin類[87]、花色苷和羥基肉桂酸反應(yīng)生成的酚基型吡喃花色苷（Pinotin類）[88]、花色苷和黃烷醇直接反應(yīng)生成的直連型聚合物[89-91]和通過乙醛介導(dǎo)形成的橋連型聚合物[92-93]、Vitisin A和羥基肉桂酸繼續(xù)反應(yīng)生成的Portisin[94-95]、花色苷自身發(fā)生聚合形成的自聚物[96-97]，以及與大分子單寧反應(yīng)的聚合色素。這些花色苷衍生物或聚合色素的具體形成過程已有詳細(xì)的綜述[98-99]，在此不再贅述。這些新形成的花色苷衍生物往往具有獨(dú)特的色澤和化學(xué)性質(zhì)，它們的形成和變化是導(dǎo)致紅葡萄酒陳釀?lì)伾兓闹匾?。目前通過對不同工藝階段樣品和不同酒齡葡萄酒的分析，發(fā)現(xiàn)橙紅色的Vitisin在發(fā)酵和陳釀初期含量達(dá)到最高[100]，但陳釀和儲(chǔ)藏過程中含量下降，橙紅色的Vitisin B含量的下降尤為迅速[77,101]；橙紅色但是色淺的酚基型吡喃花色苷含量較為穩(wěn)定[77,101]，甚至在長期陳釀的酒中含量更高[102]；紫紅色的花色苷和黃烷醇直接聚合的產(chǎn)物也在在陳釀過程中呈現(xiàn)下降趨勢[101]，且下降的速率與單體花色苷下降速率接近[77]；紫紅色的乙醛橋聯(lián)的花色苷黃烷醇聚合物也從陳釀初期快速下降[101]，且下降速率與Vitisin B接近，均大于單體花色苷的下降速率[77]；而一項(xiàng)對于具有50 年酒齡的一系列‘赤霞珠’葡萄酒的垂直檢測結(jié)果表明，聚合色素含量在葡萄酒的長期陳釀過程中也逐漸下降[103]。總體來看，由于紫紅色的花色苷分子和部分花色苷衍生物（花色苷和黃烷醇直接聚合的產(chǎn)物和乙醛橋聯(lián)的花色苷黃烷醇聚合物）較不穩(wěn)定，下降速率較快，導(dǎo)致其在陳釀過程中比例逐漸減少，而一些花色苷衍生物尤其是吡喃花色苷如Vitisin A和酚基型吡喃花色苷（橙紅色）較為穩(wěn)定，其在陳釀過程中占比逐漸增加，所以葡萄酒在陳釀過程中顏色逐漸由深紫紅色向淺橙紅色或磚紅色轉(zhuǎn)變[77]。但值得注意的是，一些非花色苷酚類物質(zhì)也會(huì)由于氧化形成一些黃色（如兒茶素的氧化產(chǎn)物）[40,104]或者棕色的色素（圖5），也會(huì)對葡萄酒的顏色造成影響。

4 結(jié)語

葡萄酒是具有生命周期的飲品，而其中貢獻(xiàn)顏色的花色苷類物質(zhì)也隨葡萄酒的生產(chǎn)工藝不斷變化。花色苷在葡萄中經(jīng)過苯丙烷-類黃酮路徑合成，是一個(gè)生物化學(xué)的過程。而進(jìn)入浸漬發(fā)酵過程后，花色苷的變化受到主要受到物理和化學(xué)作用的影響。其中，花色苷分子的酸堿平衡受到環(huán)境尤其是pH值的影響，從根本上影響葡萄酒的呈色。除了本身的酸堿平衡，葡萄酒中的花色苷會(huì)經(jīng)過多種途徑降解，其中氧化降解和自身裂解是花色苷降解的主要途徑，均會(huì)導(dǎo)致葡萄酒顏色品質(zhì)的下降。同明，花色苷會(huì)與其他分子反應(yīng)生成花色苷衍生物，進(jìn)而能夠相對維持葡萄酒的顏色。從葡萄酒的生產(chǎn)過程來看，花色苷的變化與葡萄酒的顏色密切相關(guān)，在發(fā)酵結(jié)束明葡萄酒中花色苷含量最高，此明葡萄酒呈現(xiàn)鮮艷的紫紅色。而隨著陳釀過程中花色苷的不斷降解和一些花色苷衍生物的形成，葡萄酒的色度下降，色調(diào)也逐漸由紫紅向磚紅色轉(zhuǎn)變。截至目前，雖然人們對葡萄酒中花色苷的理解已遠(yuǎn)非昔日可比，但仍有一些問題尚未研究清楚，如花色苷降解的機(jī)理及誘因、葡萄酒中大量未被鑒定到的色素以及部分色素的形成機(jī)理等等。這些問題的解決會(huì)對深入了解葡萄酒的呈色以及控制提高葡萄酒的生產(chǎn)有更好的幫助。