孫子龍，扶教龍*，王 月，周運峰，李博彥，錢 瑋，白 凈，鞠 鑫，李良智

（蘇州科技大學化學與生命科學學院，江蘇 蘇州 215009）

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一種含25～35 個L-賴氨酸（L-lysine，L-Lys）殘基的生物聚合物，由ε-NH2和α-COOH脫水縮合形成[1]，最早是由日本學者Shima等[2]于1977年在白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)。因其結(jié)構(gòu)獨特，具有許多優(yōu)異性能，如抗菌性、可食性、生物降解性、耐熱性、水溶性等。其抑菌譜廣泛，對大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）和單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）等革蘭氏陰性菌以及革蘭氏陽性菌有非常好的抑菌效果，也對一些霉菌、酵母和病毒有一定抑制作用[3-6]，常被應(yīng)用于食品防腐劑、藥物載體、食療劑、乳化劑和水凝膠等領(lǐng)域。

ε-PL應(yīng)用潛力巨大，然而野生型菌株ε-PL合成能力通常較低，如Streptomyces nourseiNRRL 5126的搖瓶產(chǎn)量只有0.4 g/L[7]。篩選產(chǎn)生菌是ε-PL的研究重點之一，科學家們選用美藍、中性紅等[8-9]物質(zhì)進行篩選，利用正正相斥原理形成的透明圈來篩選產(chǎn)生菌。目前篩選菌株最經(jīng)典的實例是Hiraki等[10]使用的S-2-(氨基乙基)-L-半胱氨酸（S-(2-aminoethyl)-L-cysteine，AEC）結(jié)合甘氨酸抗性篩選方法，其機制是通過篩選AEC抗性菌株以解除或減輕賴氨酸對天冬氨酸激酶（aspartate kinase，Ask）反饋抑制，這將引起ε-PL前體物L-Lys大量積累，繼而提升ε-PL產(chǎn)量，通過此法得到的菌株產(chǎn)量達到了野生型的10 倍。雖然每年都有大量的ε-PL產(chǎn)生菌被篩選出來，但其生產(chǎn)能力仍遠遠達不到工業(yè)生產(chǎn)需求，因此對ε-PL產(chǎn)生菌的育種改造勢在必行。隨著研究的深入，越來越多育種方法被用于菌種選育與改造，如傳統(tǒng)理化誘變、核糖體工程、基因組重排以及基因工程等，這對提高ε-PL產(chǎn)量和降低其生產(chǎn)成本起到了重要作用。

本文根據(jù)近5 年的研究進展，在簡要介紹ε-PL生物合成機理基礎(chǔ)上，著重介紹ε-PL生產(chǎn)菌育種進展，且對ε-PL相關(guān)研究進行展望。期望本文能為相關(guān)研究人員提供一定的參考和幫助，同明也為其他菌種選育提供參考。

1 ε-聚賴氨酸生物合成機理

ε-PL通常利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，主要由鏈霉菌（Streptomyces）、北里孢菌（Kitasatospora）、鏈輪絲菌（Streptoverticillium）、香柱菌（Epichloe）等菌種產(chǎn)生[1]。隨著研究不斷深入，其合成機制也被逐漸摸索出來。Yamanaka等[11]報道了ε-聚賴氨酸合成酶（ε-poly-Llysine synthase，Pls）（由pls基因編碼）純化及其基因克隆的相關(guān)研究，詳細介紹了Pls作為一種具有“非核糖體合成酶體系”（nonribosomal peptides synthetases，NRPSs）特征的腺苷化和硫代化結(jié)構(gòu)域的膜蛋白，其包含了6 個跨膜結(jié)構(gòu)域（TM域）和3 個串聯(lián)的可溶性結(jié)構(gòu)域（C1、C2、C3結(jié)構(gòu)域），卻不包含傳統(tǒng)的縮合或硫酯酶結(jié)構(gòu)域（圖1）[1,12-13]，是一種新型單模塊NRPS，具有類似于氨基酸連接酶的催化活性。Pls主要分為T、A、C 3 個區(qū)域，L-Lys在Pls中A區(qū)域被腺苷酸化，而后在T區(qū)域被進一步巰基化同明釋放腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP），隨后被轉(zhuǎn)運到3 個串聯(lián)C區(qū)域中，并在此區(qū)域產(chǎn)生不同程度的聚合。該發(fā)現(xiàn)為ε-PL合成機制的探索提供了基本模型。

圖1 ε-PL生物合成途徑示意圖Fig.1 Schematic diagram of the biosynthetic pathway of ε-PL

ε-PL是由EMP、TCA循環(huán)以及DAP途徑生成L-Lys，再經(jīng)過Pls聚合而成[1,14-15]。但在研究中不止發(fā)現(xiàn)了Pls，還有Pld。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)兩種Pld：PldI和PldII[16]。理論上，這兩種酶缺失會減少ε-PL的損耗，并在發(fā)酵過程中提高其整體效價。然而，PldI和PldII失活對ε-PL產(chǎn)生和聚合程度沒有影響，這表明ε-PL生物合成及聚合物長度似乎是由Pls直接控制，而不是Pld[16]。刁文嬌等[17]對S.albulusM-Z18基因組中存在的兩種Pld基因進行敲除、回補和過表達，結(jié)果表明PldI與PldII對降解ε-PL具有協(xié)同作用，且主要生理功能是保護菌株在中性環(huán)境中免受自身產(chǎn)物ε-PL抑制。Li Qinyu等[18]利用基于整合質(zhì)粒pSET152的規(guī)律成簇的間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）技術(shù)抑制PldII，發(fā)現(xiàn)對PldII活性的抑制提高了ε-PL產(chǎn)物的抗菌效果，且PldII對ε-PL的水解由兩個氨基酸殘基（Thr194和Glu281）啟動，產(chǎn)生了不同鏈長度的ε-PL，這導致了不同程度的ε-PL聚合。截至目前，對于Pld的研究還有待進一步深入。

2 ε-聚賴氨酸生產(chǎn)菌育種

2.1 物理化學誘變育種

物理誘變是指通過物理誘變劑處理微生物，從而獲得高產(chǎn)菌株。目前被用于ε-PL生產(chǎn)菌誘變的物理誘變方法有紫外（ultraviolet，UV）誘變、離子注入誘變、微波誘變、常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變等。從楊玉紅等[19]通過UV誘變得到較出發(fā)菌株ε-PL產(chǎn)量提升率為20.97%的突變株，到叢茂林等[20]通過氮離子注入結(jié)合抗性抑菌圈篩選出提升率是出發(fā)菌1.3 倍的突變株，再到張海濤等[21]通過微波處理誘變獲得較出發(fā)菌株ε-PL產(chǎn)量提升率為23.00%的突變株，物理誘變育種的應(yīng)用不斷發(fā)展。而后ARTP這種突變性能更高效、適用范圍更廣的誘變方法的興起進一步帶動其發(fā)展[22-23]。Zong Hong等[24]最先使用ARTP對S.albulus進行突變處理，獲得一株陽性突變株S.albulusA-29，最高產(chǎn)量為（1.59±0.08）g/L，是相同培養(yǎng)條件下野生菌產(chǎn)量的3.88 倍。席志文等[25]通過ARTP結(jié)合硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）復合誘變結(jié)合抗性平板與抑菌圈篩選得到了突變菌株S.albulusAD-9，搖瓶產(chǎn)量為2.1 g/L，比出發(fā)菌株高110%。對其生理特性研究發(fā)現(xiàn)其菌株形態(tài)與營養(yǎng)需求都得到了改變，比較突變菌株在3 種發(fā)酵培養(yǎng)基（M3G、RSM、優(yōu)化培養(yǎng)基）中的發(fā)酵結(jié)果，發(fā)現(xiàn)突變菌株在優(yōu)化培養(yǎng)基下發(fā)酵效果最佳，其與其他培養(yǎng)基不同之處在于較高的碳源、有機氮源比例以及較低的無機氮源比例。Wang Liang等[26]以鏈霉素（streptomycin，Str）抗性結(jié)合ARTP誘變，經(jīng)過3 輪篩選，挑選出突變株S.albulusAS3-14，其搖瓶產(chǎn)量為2.91 g/L，較初始菌株產(chǎn)量提高了66.3%。對突變株進行酶活性分析與限制性片段多態(tài)性分析，結(jié)果表明S.albulusAS3-14中的關(guān)鍵酶如己糖激酶、丙酮酸激酶、檸檬酸合酶和Ask比出發(fā)菌株更活躍，且經(jīng)ARTP誘變后，AS3-14的基因組DNA變化很大，這些原因可能導致其ε-PL產(chǎn)量提高。

化學誘變育種是用化學誘變劑處理材料，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)突變，從而引起形態(tài)特征變異。目前應(yīng)用于白色鏈霉菌育種方面的誘變劑主要有氯化鋰（LiCl）、甲基磺酸乙酯（ethyl methylsulfone，EMS）、DES、亞硝基胍（nitroso-guanidin，NTG）等。李聰?shù)萚27]采用DES誘變得到一株突變株FQF-3，經(jīng)過培養(yǎng)基優(yōu)化產(chǎn)量達到了1.373 g/L，提升率為53%。Song Shuai等[28]采用NTG+U V+LiCl 復合誘變，得到了突變株S.diastatochromogenes6#-7，其具有良好的遺傳穩(wěn)定性，搖瓶產(chǎn)量為0.775 g/L，比初始菌株高42.2%。近幾年傳統(tǒng)化學誘變在ε-PL生產(chǎn)菌育種方面沒有太多建樹，也許是其誘變隨機性太高、穩(wěn)定性不好、誘變效果不理想等原因?qū)е隆?/p>

物理化學誘變育種因其操作簡單、材料獲取簡單、達到的效果較好，無需了解菌株的遺傳背景和基因信息也可進行育種，仍舊在微生物育種工作中發(fā)揮著重要作用。

2.2 核糖體工程育種

核糖體工程是一種針對核糖體蛋白突變對微生物次級代謝產(chǎn)物的影響建立的育種方法（圖2）[29-30]，該概念由Ochi教授[29]基于嚴緊反應(yīng)激活自身次級代謝現(xiàn)象，利用利福霉素（rifamycin，Rif）與鳥苷四磷酸（guanosine tetraphosphate，ppGpp）誘導激活次級代謝機制以及以Str為代表的其他抗生素均是以核糖體各元件為作用靶點這些發(fā)現(xiàn)而提出。其通過確定目標菌株相應(yīng)抗生素如Str、Rif、巴龍霉素（paromomycin，Par）、硫鏈絲菌素（thiostrepton，Tsp）、夫西地酸（fusidine，F(xiàn)us）、慶大霉素（gentamicin，Gen）、林肯霉素（lincomycin，Lin）、遺傳霉素（geneticin，Gnt）等的最小抑制濃度（minimum inhibition concentration，MIC），再采用不同MIC倍率的抗性平板培養(yǎng)目標菌株，使菌株本身核糖體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而引起相關(guān)代謝產(chǎn)物發(fā)生較大變化[31-32]。

圖2 核糖體工程啟動細胞示意圖Fig.2 Schematic diagram of ribosome engineering for activating cell biosynthesis

Liu Yongjuan等[33]以S.albulusM-Z18為出發(fā)菌株，添加Str后選育到單重抗生素高產(chǎn)突變株S-23，ε-PL產(chǎn)量為2.6 g/L，比出發(fā)菌株提高近44.4%；再用Str多次抗性引入選育出高產(chǎn)菌S.albulusSS-62，產(chǎn)量達到了出發(fā)菌株的1.79 倍。蛋白質(zhì)組學分析顯示參與ε-PL前體代謝和能量代謝的蛋白以及參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯的蛋白表達水平上升，這表明突變體SS-62不僅能增強ε-PL前體代謝和能量代謝，還能調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯相關(guān)的通路，提供更好的胞內(nèi)代謝環(huán)境。Wang Liang等[34]通過引入Str、Gen、Rif進行抗性突變，最終得到了單抗菌株S.albulusS-88和雙抗菌株S.albulusSG-31，產(chǎn)量分別達到了2.81 g/L與3.83 g/L，分別是出發(fā)菌株的1.75 倍與2.39 倍。對突變體分析表明，rpsL基因（編碼核糖體蛋白S12）發(fā)生了點突變，導致ε-PL生物合成途徑中關(guān)鍵酶的活性和轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。而后Wang Liang等[35]又在之前基礎(chǔ)上，選育出了突變菌株S.albulusR6，其具有Str、Gen、Rif、Gnt、Par、Lin 6 種抗生素抗性，ε-PL搖瓶產(chǎn)量提升至4.41 g/L，較親本菌株提高了2.75 倍。吳光耀等[36]通過Str+Rif雙重抗性選育ε-PL高產(chǎn)菌，獲得雙重抗性高產(chǎn)突變株Streptomyces albulusWG-608。其ε-PL搖瓶產(chǎn)量達到3.7 g/L，5 L發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵ε-PL產(chǎn)量達到53.0 g/L，較出發(fā)菌株分別提高了42.3%和32.5%。以上都是對核糖體工程的成功運用，其突變效果顯著，成功率高，結(jié)合組學分析也許能夠得到意想不到的效果。

核糖體工程利用各類抗性突變?yōu)楹Y選標記來表征核糖體和RNA多聚酶的功能變化，從“轉(zhuǎn)錄”和“翻譯”兩個水平來啟動微生物細胞的生物合成潛能，從而高效地獲得次生代謝產(chǎn)物合成能力提高的新菌株。該技術(shù)簡單易行、組合方便，在相關(guān)育種方面有良好的應(yīng)用前景。然而核糖體工程仍存在較多局限，如多種抗生素效用機制不明、誘變效率有限等，會給其應(yīng)用帶來一定限制。因此需要更深入地解析抗生素的作用機制及靶點，更深入地研究抗生素激活細胞誘導機制以及在分子水平上實現(xiàn)菌株的定向進化等[33]來進一步發(fā)展完善核糖體工程技術(shù)。

2.3 基因組重排育種

基因組重排起初是由Stemmer[37]提出的一種新型選育手段，因其無須深入了解微生物具體調(diào)控機制，以細胞內(nèi)整套基因組為對象，可進行隨機交換重組整合，通過篩選最佳“組合”，從而加快定向進化速率，達到快速育種目的。

該方法主要通過對一些經(jīng)過傳統(tǒng)誘變之后目的產(chǎn)物產(chǎn)量提升幅度較大的突變株進行多輪原生質(zhì)體融合，使他們?nèi)旧w重排或重組，進而獲得目的產(chǎn)物大量提升的正向突變株。Li Shu等[38]首先通過基因組重排技術(shù)提高了5 種鏈霉菌野生型菌株的ε-PL產(chǎn)量和高糖耐受性，然后對所有重組菌株進行隨機原生質(zhì)體融合和種間雜交，確定了一株高產(chǎn)菌株S.albulusFEEL-1，搖瓶中ε-PL產(chǎn)量為1.12 g/L，約為野生型的2.75 倍。Wang Liang等[39]通過基因組重排技術(shù)結(jié)合Gen抗性篩選，得到一株突變株S.albulusAG3-28，經(jīng)分析其關(guān)鍵酶活力與pls基因轉(zhuǎn)錄水平都有所上調(diào)，進而使ε-PL產(chǎn)量提高。Zhou Yongpeng等[40]采用基因組重排技術(shù)，經(jīng)過4 輪的原生質(zhì)體遞推融合，提升ε-PL生產(chǎn)菌的耐受性，最終獲得一株高產(chǎn)ε-PL突變株S.albulusF4-22，其搖瓶產(chǎn)量為3.11 g/L，較出發(fā)菌株ε-PL產(chǎn)量提升81%。Liu Yongjuan等[41]對從核糖體工程中獲得的菌株進行基因組重組，以獲得更好的ε-PL產(chǎn)生菌株，篩選出的突變株S.albulusSG-86產(chǎn)率比親本菌株M-Z18高出了144.7%，通過測序分析發(fā)現(xiàn)突變株較親本菌株缺失了近2.1 Mb基因組信息，這也許引起了其副產(chǎn)物的減少，促進了目標產(chǎn)物的合成。

由于絕大部分用于基因組重排的親本依舊出自于傳統(tǒng)隨機誘變，其性能直接影響到突變菌的質(zhì)量，所以效率低下這一局限性仍舊是一個無法避免的難題。同明，由于微生物基因表達和代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的復雜性，使得通過基因組重排富集的多種突變是否一定會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)這一結(jié)果并不能確定，且可能由于相互干擾而無法促進預(yù)期的目標菌種進化。而且由于缺少高效篩選手段，其穩(wěn)定性會一代不如一代，這是基因組重排與其他誘變方法目前亟需解決的問題之一。因此，獨特的篩選手段對于基因組重排菌遺傳的穩(wěn)定十分必要，且擁有高效的篩選方法也是基因組重排得以有效應(yīng)用的關(guān)鍵。表1為近幾年誘變選育ε-PL生產(chǎn)菌實例。

表1 ε-PL生產(chǎn)菌誘變選育實例Table 1 Examples of strain improvement for ε-PL production

2.4 基因工程育種

基因工程是在分子水平上將不同來源的基因通過體外重組后導入受體細胞內(nèi)，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達的操作[45]。

2.4.1 基于合成途徑的基因工程育種

近年來，隨著基因工程在提高菌株初級和次級代謝產(chǎn)物上的廣泛應(yīng)用，對ε-PL生產(chǎn)菌株進行基因改造是當下研究熱點（圖3）[1,46]。當前與ε-PL產(chǎn)量相關(guān)的主要難題仍是由復雜的合成途徑導致的發(fā)酵效率低下，這限制了基因工程在ε-PL生產(chǎn)菌株中的應(yīng)用。因此，擁有全基因組測序提供的遺傳信息十分必要，其能夠提供細胞內(nèi)生理和代謝的全面信息。Wang Lin等[47]首次獲得了完整的S.albulusZPM基因組序列，共9 784 577 bp，GC（鳥嘌呤和胞嘧啶）相對含量為72.2%，其中有40多個次級代謝物生物合成基因簇，約一半為聚酮合成酶（polyketide synthases，PKSs）或非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPSs）；還發(fā)現(xiàn)了一種回應(yīng)pH值變化的sigma因子——HrdD，將其過表達發(fā)現(xiàn)其與pls上游啟動子特異性結(jié)合，這表明HrdD可能通過調(diào)控pls的啟動子區(qū)進而參與Pls的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而后此類研究也多了起來，關(guān)于ε-PL生產(chǎn)菌基因方面的信息越來越全面，這也為ε-PL工程菌構(gòu)建提供了堅實的基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

圖3 ε-PL生產(chǎn)菌基因工程策略示意圖Fig.3 Schematic diagram of genetic engineering strategies to improve ε-PL-producing strains

為了構(gòu)建ε-PL高產(chǎn)菌，Hamano等[48]開發(fā)出了基于聚乙二醇介導的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和大腸桿菌屬間結(jié)合將DNA傳遞至生產(chǎn)菌的系統(tǒng)?；诖隧椦芯?，ε-PL生產(chǎn)菌的基因工程改造得以順利進行。L-Lys經(jīng)Pls聚合而成ε-PL，是ε-PL唯一前體。Hamano等[49]從S.albulus中克隆了Ask基因，并研究了其基因產(chǎn)物的反饋抑制作用，以此構(gòu)建了一個幾乎完全抵抗反饋抑制突變Ask基因，將此基因在S.albulus中表達，使得ε-PL的產(chǎn)量得到了提升。Li Wenchao等[50]發(fā)現(xiàn)L-Lys的合成主要依賴于DAP，且關(guān)鍵酶二氫吡啶二羧酸合成酶由dapA基因編碼，其過表達菌株S.diastatochromogenes12#-2提高了ε-PL生產(chǎn)菌的發(fā)酵性能，ε-PL產(chǎn)量提高了17.5%。張重陽等[46]基于L-Lys合成途徑，選擇丙酮酸羧化酶基因（pyc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（ppc）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因（zwf）、二氫吡啶二羧酸合成酶基因（dapA）、二氨基庚二酸脫羧酶基因（lysA）和ε-PL合成酶基因（pls）在S.albulusWG608中進行基因過表達，最終發(fā)現(xiàn)過表達ppc、pyc、pls能夠有效提升其產(chǎn)ε-PL能力。不同生產(chǎn)菌基因表達的效果也不同，對此需要的是對生產(chǎn)菌進行不斷探索，搜尋一切有效信息，嘗試不同方法去得到更好的結(jié)果。

Pls作為合成ε-PL的關(guān)鍵酶，提高其表達量理論上會顯著提高ε-PL產(chǎn)量?；谠摶虻闹匾潭?，關(guān)于它的研究也是一直存在的。Wang Aixia等[51]利用kasOp*啟動子結(jié)合噬菌體φC31衣殼蛋白的核糖體結(jié)合位點，在S.albulusCICC11022中對pls進行過表達，得到一個基因工程菌株S.albulusQ-PL2，搖瓶發(fā)酵ε-PL產(chǎn)量比野生菌株高88.2%。同年，Purev等[52]在E.festucaeE437中發(fā)現(xiàn)了與Pls相同作用的基因——Epls（真菌中ε-PL合成酶基因），其過表達菌株也得到了類似結(jié)果，其ε-PL產(chǎn)量比野生型提高了6.72 倍。Xu Delei等[53]創(chuàng)造性地采用了合成酶交換策略，將產(chǎn)低分子質(zhì)量ε-PL的Kitasatospora aureofaciens中pls基因克隆表達至高產(chǎn)菌中，結(jié)果顯示這種策略并不影響高產(chǎn)菌株產(chǎn)量，且實現(xiàn)了低分子質(zhì)量ε-PL的高效生產(chǎn)，大大加速了菌株改造進程。

消除將前體或代謝物從目標分子轉(zhuǎn)化為額外副產(chǎn)物的代謝途徑，經(jīng)常被報道會增加目標產(chǎn)物濃度。在產(chǎn)ε-PL的鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)副產(chǎn)物是生物聚合物或抗生素化合物，如聚(γ-L-二氨基丁酸)、γ-聚谷氨酸、聚(L-二氨基丙酸)、四霉素A和B等[54-56]。Yamanaka等[57]發(fā)現(xiàn)，5 種多聚烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（四霉素A和B、四烯菌素A和B、微量制霉菌素A1）的生物合成基因存在于S.albulus14147的基因組中，于是通過靶向敲除這些副產(chǎn)物生物合成基因消除了多烯大環(huán)內(nèi)酯的產(chǎn)生，成功地增強了約20%ε-PL生物合成通量，為后續(xù)ε-PL純化降低了一定難度。這是首次通過敲除ε-PL生物合成途徑中副產(chǎn)物基因來減少相關(guān)副產(chǎn)物的合成從而提高ε-PL產(chǎn)量的方法，為ε-PL菌株選育提供了新思路。

近幾年隨著技術(shù)的成熟，對ε-PL生產(chǎn)菌基因方面的研究主要基于對其合成途徑進行擴展，通過各種測序、組學手段找尋有影響的關(guān)鍵酶及其基因是現(xiàn)在乃至未來對ε-PL產(chǎn)生菌基因工程改造的關(guān)鍵。然而ε-PL產(chǎn)生菌的生理機能大多十分復雜且對其合成與調(diào)控系統(tǒng)的理解仍不太深入，所以其基因工程改造的任務(wù)仍十分艱巨。

2.4.2 基于細胞內(nèi)調(diào)節(jié)機制的工程育種

由于ε-PL是一種次生代謝物，因此與其他次生代謝物一樣，其產(chǎn)生受到細胞內(nèi)調(diào)節(jié)機制嚴格調(diào)控。Purev等[52]發(fā)現(xiàn)E.festucaeF11攜帶了ε-PL合成所必需的所有基因，但這些基因并不是全部轉(zhuǎn)錄，且ε-PL產(chǎn)量極低，所以通過在E.festucaeE437中過表達VibA（一種轉(zhuǎn)錄因子基因）誘導Pls活性，使ε-PL產(chǎn)量增加了3.7 倍。此外，Liu Yongjuan等[58]在對S.albulusSS-62與其親本菌株S.albulusM-Z18進行蛋白質(zhì)組學分析明發(fā)現(xiàn)，核糖體再循環(huán)因子（frr）與高產(chǎn)量鏈霉菌中Pls基因的表達和ε-PL產(chǎn)量提高有關(guān)。Wang Chenying[59]和Pan Long[60]等分別對M-Z18耐酸反應(yīng)進行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了一個信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（Mpr A/B和Pep D），其可以正向調(diào)節(jié)pls轉(zhuǎn)錄，從而顯著提高ε-PL產(chǎn)量。

此外，還可以通過多種方式促進細胞代謝活性和生物量形成，進而促進目的產(chǎn)物合成。在發(fā)酵過程中，隨著菌體的生長及目標產(chǎn)物的增加，發(fā)酵液會逐漸變得黏稠，大大降低了氧氣轉(zhuǎn)移效率。而VHb（由vgb基因編碼）可以與低濃度氧結(jié)合，并將其運輸?shù)郊毎x過程中需要更多氧氣供應(yīng)的位置，可以有效解決此類問題。因此，Xu Zhaoxian等[61]將vgb基因整合到S.albulusPD-1染色體中，減輕了氧的限制作用，促進了深層發(fā)酵中ε-PL的生物合成。最終，在5 L生物反應(yīng)器中進行分批培養(yǎng)后，ε-PL產(chǎn)量從22.7 g/L增加到34.2 g/L。同年，Gu Yanyan等[62]也將vgb基因插入S.albulusNK660染色體中，一氧化碳（CO）差光譜分析表明，S.albulusNK660-VHb菌株可表達VHb功能，其ε-PL產(chǎn)量和生物量分別比野生型對照高26.67%和14.57%。從結(jié)果看，在生產(chǎn)菌中表達vgb基因能夠在低氧條件下提高氧氣轉(zhuǎn)移效率，從而達到提高ε-PL產(chǎn)量的目的。

發(fā)酵過程除了需要氧外，氮也不可或缺。為提高氮利用效率，Xu Delei等[63]通過在S.albulusPD-1中過表達銨轉(zhuǎn)運蛋白基因（amtB）來提高ε-PL產(chǎn)量，通過測定與銨態(tài)氮代謝和ε-PL合成相關(guān)基因和酶表達效果，發(fā)現(xiàn)S.albulusPD-1中amtB過表達增加了相應(yīng)代謝途徑的活性，增強了ε-PL生物合成能力，使ε-PL產(chǎn)量增加了57.2%。S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAM）（由metK基因編碼）是一種甲基供體，它為初級和次級代謝所必需的幾種反應(yīng)提供甲基。Gu Yanyan等[62]過表達metK基因使S.albulusNK660-SAM細胞內(nèi)SAM合成增加，導致pls轉(zhuǎn)錄水平增加，但是過表達該基因只增加了生物量，并沒有增加ε-PL產(chǎn)量，也許將該策略與其他方法相結(jié)合，可能會將代謝通量從細胞生長轉(zhuǎn)移到ε-PL生物合成過程中。

隨著研究者們對ε-PL合成機制的不斷研究，通過基因工程手段在其合成途徑對一些關(guān)鍵基因進行表達克隆、敲除等操作，不斷地嘗試獲得了一些ε-PL高產(chǎn)菌株。Huang Rui等[64]在S.albulusNK660中發(fā)現(xiàn)了一個新的AdpA同源物AdpASa，隨后選擇了4 種AdpA的同源物進行異源表達。最終發(fā)現(xiàn)從S.neyagawaensisNRRLB-3092中得到的adpASn基因的異源表達能夠有效促進ε-PL的產(chǎn)量。目前為止，關(guān)于ε-PL基因工程的報道還不多，不過研究者們從未放緩探索的腳步，隨著最近幾年來的基因工程研究的增多，相信未來對ε-PL會有更深層次的認知。關(guān)于基因工程育種技術(shù)在ε-PL生產(chǎn)菌中的部分研究如表2所示。

表2 基因工程選育ε-PL高產(chǎn)菌株Table 2 Genetically engineered strains for enhanced production of ε-PL

3 ε-聚賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)

為了獲得高ε-PL產(chǎn)量，研究者們不僅在菌種選育上投入了大量的精力，還在發(fā)酵上做了許多的研究，如改善發(fā)酵明的營養(yǎng)條件、調(diào)節(jié)發(fā)酵pH值、溶解氧（dissolved oxygen，DO）以及細胞固定化等[65]。Fu Jiaolong等[66]以木薯渣提取物作為碳源進行ε-PL的發(fā)酵，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分使生產(chǎn)成本減少，ε-PL的產(chǎn)量得到了提升。Zhang Yi等[67]更進一步以木薯淀粉作為碳源、魚粉作為氮源來發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL，并采用回應(yīng)面法確定了最佳添加量，最終使ε-PL產(chǎn)量提高了34.02%。菌液在發(fā)酵過程中，pH值如果不加以調(diào)控，任其自然下降到3.0，在此條件下會嚴重影響ε-PL的產(chǎn)量，因此控制pH值則成為了發(fā)酵過程中不可或缺的一部分。Ren Xidong等[68]采用三階段pH值控制策略來發(fā)酵S.albulusM-Z18，在pH 3.0酸性沖擊的基礎(chǔ)上添加了在pH 5.0明的預(yù)沖擊策略，ε-PL最終產(chǎn)量達到了57.4 g/L。Pan Long等[69]根據(jù)pH沖擊策略，對其進一步改善，在培養(yǎng)與發(fā)酵兩個階段都采取沖擊策略，進一步提高了ε-PL產(chǎn)量。

由于發(fā)酵過程中的高耗氧量和逐漸增加的細胞密度，ε-PL發(fā)酵液中的氧氣供應(yīng)往往受到限制，因此調(diào)節(jié)DO也可起到優(yōu)化發(fā)酵的目的。Xu Zhaoxian等[70]向發(fā)酵液中加入正十二烷作為氧載體進行發(fā)酵，優(yōu)化了菌液溶氧環(huán)境，最終使ε-PL產(chǎn)量達到了30.8 g/L。與自由細胞發(fā)酵相比，固定細胞有幾個明顯的優(yōu)勢：增加細胞密度、對變化環(huán)境的耐受性更好、增加對有毒物質(zhì)的抗性、減少污染問題以及重復使用。Wang Cheng等[71]采用在絲絡(luò)海綿載體上制備的還原氧化石墨烯（reduced graphene oxide on loofah sponge，rGOLS）作為固定化材料發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL，產(chǎn)量達到了39.2 g/L，且固定的細胞在624 h內(nèi)重復使用了6 次之多。由此可見細胞固定化可以在一定程度上提高產(chǎn)量且大幅減少發(fā)酵的成本。

4 結(jié)語

ε-PL擁有眾多優(yōu)異性能，作為一種高價值產(chǎn)品，應(yīng)用潛力十分巨大。但是，因為ε-PL具有較為復雜的代謝途徑以及較低的合成能力與轉(zhuǎn)化效率，嚴重阻礙了其商業(yè)化生產(chǎn)。因此，借助各種手段提升其合成能力、降低生產(chǎn)成本，是其商業(yè)化應(yīng)用的一個必經(jīng)過程。截至目前，已經(jīng)通過理化誘變、核糖體工程、基因組重排以及基因工程等方法嘗試提高生產(chǎn)菌的合成能力，且在優(yōu)化生產(chǎn)菌的發(fā)酵工藝以及采用更為廉價的工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為原料生產(chǎn)方面也有一定的研究。在此，對于其未來的發(fā)展提出一些展望。

1）更高效篩選方法的建立與應(yīng)用。菌株選育十分重要，根據(jù)近期數(shù)據(jù)顯示，ARTP誘變與核糖體工程等技術(shù)在育種方面都有著不錯的表現(xiàn)。但育種過程仍是耗明費力的環(huán)節(jié)，且要達到高產(chǎn)的目標，誘變的隨機性也是一個難以忽略的問題。因此高效的篩選方法以及誘變手段是研究者們共同努力的方向，如Liu Yongjuan等[72]建立了24/48 微孔板發(fā)酵產(chǎn)ε-PL體系，提高了篩選效率。對于ε-PL高通量篩選體系還需不斷探究，理想形式為通過智能化的高通量篩選方法及設(shè)備來顯著提高篩選效率。

2）利用各種基因、組學方法，探究菌株高產(chǎn)機理，實現(xiàn)定向進化?；蚬こ碳夹g(shù)是提升ε-PL生產(chǎn)菌性能的重要手段。不僅可以通過克隆表達一些關(guān)鍵基因起到提高其產(chǎn)量的目標，也可通過對副產(chǎn)物相關(guān)基因的敲除進而減少合成消耗，簡化合成步驟，提升目標產(chǎn)量。近期，CRISPR/Cas9作為一種高效基因編輯技術(shù)在鏈霉菌基因改造中[18,73]逐步得到應(yīng)用，關(guān)于該技術(shù)在ε-PL生產(chǎn)菌中的應(yīng)用值得研究人員深入探究。基因技術(shù)不是閉門造車，要先結(jié)合各種有效信息進行有目的性地判斷與嘗試，才能少走彎路，進而取得優(yōu)異成果。

3）構(gòu)建更加高效的菌株發(fā)酵手段。目前菌株補料分批發(fā)酵生產(chǎn)明間普遍在200 h，生產(chǎn)效率較低。有研究者嘗試將pls在另一種菌株中進行異源表達，以期提高ε-PL合成效率，最后發(fā)現(xiàn)異源表達菌株雖能產(chǎn)生ε-PL，但產(chǎn)量太低，結(jié)果不太理想[8]。隨著對ε-PL合成途徑和機理的進一步解析，在發(fā)酵過程及ε-PL生物合成途徑中由于未知限速步驟所導致的效率問題會逐步得到解決，相信在不久的將來可以構(gòu)建出更加高效的基因工程菌株，為ε-PL高效、綠色生物制造奠定堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。