菅 蕊,徐 真,張 晛,韓愛云,呂國平,劇慧棟,5

(1. 承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000 ; 2. 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)部,河北 邯鄲 056038 ;3. 石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北 石家莊 050000 ; 4. 河北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北 石家莊 050000 ;5. 河北省疑難細(xì)菌研究重點實驗室,河北 石家莊 050000)

馬屬動物曾在人類發(fā)展的歷史中有過重要的貢獻(xiàn),至今部分馬屬動物仍然被作為人類食物和生物醫(yī)學(xué)的實驗材料。馬屬動物的寄生線蟲嚴(yán)重威脅宿主的生命和健康,是引發(fā)各類疾病和死亡的重要因素。不同種類的線蟲對宿主的致病機制各異,因此準(zhǔn)確迅速地識別寄生線蟲可以有效降低其對宿主的危害[1,2]。目前,多數(shù)馬屬動物寄生線蟲有過光學(xué)顯微鏡的觀察和描述,而該類群線蟲在體前端的結(jié)構(gòu),尤其是頭部乳突、口囊、內(nèi)葉冠和外葉冠等結(jié)構(gòu),以及雄蟲尾部的生殖錐的形態(tài),是重要的形態(tài)學(xué)分類依據(jù),上述結(jié)構(gòu)在光鏡下無法得到滿意的觀察結(jié)果,因此,利用掃描電子顯微鏡可以大幅度提高鑒定的準(zhǔn)確性,從而對線蟲的種類進行精確鑒定[3-5]。

本試驗首次利用掃描電子顯微鏡技術(shù)對采自烏克蘭的馬、斑馬、普氏野馬和驢消化道內(nèi)杯口屬的不等齒杯口線蟲、拉氏杯口線蟲和副杯口屬的麥?zhǔn)细北诰€蟲的體表形態(tài)進行詳細(xì)觀察和描述,為上述3種線蟲的分類鑒定提供更精確的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 杯口屬的不等齒杯口線蟲、拉氏杯口線蟲和副杯口屬的麥?zhǔn)细北诰€蟲均采自烏克蘭馬(Equuscaballus)、驢(Equusasinus)、斑馬(Equusburchelli)和普氏野馬(Equusprzewalskii)的腸道內(nèi)容物,用80 ℃左右的熱水將蟲體燙直,并將線蟲保存于福爾馬林中,記錄宿主的種名、寄生部位、采集時間和地點。

1.2 主要材料 乳酚酸透明液(乳酸∶苯酚∶蒸餾水∶甘油=1∶1∶1∶2),乙醇(50%、70%、80%、90%和100%),0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH=7.2),戊二醛固定液(濃度2.5%),醋酸異戊酯,鋨酸(濃度1%),均由河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物系統(tǒng)學(xué)與分子進化實驗室配制。

1.3 主要儀器 掃描電子顯微鏡(HITACHI S-4800)。

1.4 線蟲的觀察 將已固定的線蟲標(biāo)本用80%乙醇或透明液制成臨時裝片,在掃描電子顯微鏡下對線蟲標(biāo)本的各個部分進行初步的形態(tài)觀察,查閱文獻(xiàn),確定線蟲種類。

取保存于福爾馬林中的線蟲標(biāo)本,用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;使用戊二醛固定液(濃度2.5%)固定3 h;然后使用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;鋨酸(濃度1%)溶液固定1 min;再用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;再進行脫水,用乙醇作為脫水劑,按照70%、80%、90%和100%的梯度進行2次脫水,每次脫水時間為20 min;將脫水的樣品放入醋酸異戊酯30 min。使用臨界點干燥法進行干燥:(1)樣品室預(yù)冷(注入液氮)→(2)樣品放入樣品室→(3)注入液態(tài)二氧化碳(樣品室的70%)→(4)用二氧化碳置換樣品中的醋酸異戊酯(溫度調(diào)到20 ℃,壓力應(yīng)達(dá)到50～70 kg/cm2,保持20 min)→(5)臨界處理,溫度提高到40 ℃,壓力應(yīng)達(dá)到80～100 kg/cm2,保持5 min→(6)放氣,速度在100～500 mL/min→(7)當(dāng)壓力低于30 kg/cm2時,切斷加熱器→(8)當(dāng)壓力為0時,取出樣品,用雙面膠或?qū)щ娔z將樣品固定在專用的樣品臺上,進行噴金,掃描電子顯微鏡下觀察并拍照[6-8]。

2 結(jié)果

2.1 杯口屬Poteriostomum(Quiel,1919)

2.1.1 不等齒杯口線蟲P.imparidentatum(Quiel,1919) 雄蟲、雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。頸乳突刺狀,長約14 μm(10～17 μm),與排泄孔大致在同一平面(圖1A)。頭徑約205 μm(200～208 μm),口孔直徑約125 μm(121～126 μm),外葉冠82枚,短小,刺狀(圖1B)?？陬I(lǐng)明顯,在口領(lǐng)頂端的2個正側(cè)方各有1個頭感器,2個頭感器之間對稱排列著4個亞中乳突,亞中乳突基部膨大,寬約8 μm(6～11 μm),頂端尖且伸至外葉冠前緣(圖1C)。頭感器較扁平,基部寬約8 μm(5～10 μm)(圖1D)。

圖1 不等齒杯口線蟲的掃描電子顯微鏡觀察Fig.1 Scanning electron microscope observation of P. imparidentatumA:體前端; B:頭部頂面觀,4個近中乳突和2個頭感器; C:近中乳突放大觀; D:頭感器放大觀; E:雄蟲交合傘; F:雄蟲生殖錐放大觀; G:雌蟲尾部; H:雌蟲肛門放大觀A: Anterior end; B: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; C: Enlarged view of sub-median papillae; D: Enlarged view of amphids; E: Copulatory bursa of the male; F: Enlarged view of the male genital cone; G: Posterior end of the female; H: Enlarged view of the female anus

雄蟲交合傘短寬,傘緣有鋸齒(圖1 E),生殖錐腹唇錐形,丘狀凸不明顯,背唇附屬物發(fā)育不全,皮質(zhì)領(lǐng)缺乏(圖1 F)。

雌蟲陰門開口橢圓型,寬約48 μm(42～53 μm),距肛門約598 μm(圖1 G),肛門開口弧形,長約220 μm(210～232 μm),尾長約720 μm(700～750 μm)(圖1 H)。

采集地點:烏克蘭

宿主:斑馬(Equusburchelli)、馬(Equuscaballus)

2.1.2 拉氏杯口線蟲P.ratzii(Kotlan,1919) 雄蟲、雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。頸乳突刺狀,長約25 μm(21～28 μm),與排泄孔大致在同一平面(圖2A～2C)?？陬I(lǐng)明顯,與體部相接處有環(huán)狀突起,頭徑約150 μm(138～163 μm),口孔近圓形,直徑約100 μm(85～108 μm),外葉冠75枚,尖而窄,內(nèi)葉冠寬度是外葉冠的2倍(圖2D)。亞中乳突細(xì)長,圓錐形,基部寬約10 μm(9～11 μm),伸至外葉冠前緣(圖2E)。在口領(lǐng)頂端的2個正側(cè)方各有1個頭感器,頭感器寬而鈍圓,頂端有一小孔狀凹陷,基部寬約12 μm(9～14 μm)(圖2F)。

圖2 拉氏杯口線蟲的掃描電子顯微鏡觀察Fig.2 Scanning electron microscope observation of P. ratziiA:體前端; B:排泄孔放大觀; C:頸乳突放大觀; D:頭部頂面觀,4個近中乳突和2個頭感器; E:近中乳突放大觀; F:頭感器放大觀; G:雄蟲交合傘; H:雄蟲生殖錐放大觀; I:雌蟲尾部A: Anterior end; B: Enlarged view of the excretory pore; C: Enlarged view of cervical papilla; D: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; E: Enlarged view of sub-median papillae; F: Enlarged view of amphids; G: Copulatory bursa of the male; H: Enlarged view of the male genital cone; I: Posterior end of the female

雄蟲交合傘背葉寬,傘緣鋸齒狀(圖2G),生殖錐皮質(zhì)領(lǐng)在生殖錐兩側(cè),背唇上的附屬物發(fā)育不全(圖2H)。

雌蟲陰門開口近圓形,寬約33 μm(30～36 μm),距肛門約402 μm(390～415 μm),肛門開口半月形,長約245 μm(238～255 μm),尾長約470 μm(455～480 μm)(圖2I)。

采集地點:烏克蘭

宿主:馬(Equuscaballus)

2.2 副杯口屬Parapoteriostomum(Hartwich,1986)

2.2.1 麥?zhǔn)细北诰€蟲P.mettami(Leiper,1913) 雄蟲、雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。頸乳突線狀,長約32 μm(28～35 μm),與排泄孔大致在同一平面,排泄孔周圍有一圈皮質(zhì)凸起,寬約13 μm(10～15 μm)(圖3A～3C)。蟲體中等大小,口領(lǐng)明顯,與體部有明顯環(huán)溝隔開,頭部直徑約178 μm(168～185 μm),口孔直徑約52 μm(45～58 μm),外葉冠尖細(xì),75枚(圖3D)。亞中乳突細(xì)長,頂端稍微膨大,長約9 μm(7～11 μm)(圖3E)。在口領(lǐng)頂端的2個正側(cè)方各有1個頭感器,頭感器裂孔狀,寬約6 μm(5～8 μm)(圖3F)。

圖3 麥?zhǔn)细北诰€蟲的掃描電子顯微鏡觀察Fig.3 Scanning electron microscope observation of P. mettamiA:體前端; B:排泄孔放大觀; C:頸乳突放大觀; D:頭部頂面觀,4個近中乳突和2個頭感器; E:近中乳突放大觀; F:頭感器放大觀; G:雄蟲交合傘; H:雌蟲尾部; I:雌蟲陰門A: Anterior end; B: Enlarged view of the excretory pore; C: Enlarged view of cervical papilla; D: Apical view of the head with four sub-median papillae and two amphids; E: Enlarged view of sub-median papillae; F: Enlarged view of amphids; G: Copulatory bursa of the male; H: Posterior end of the female; I: Female cunnus

雄蟲交合傘肋粗壯,生殖錐突出于交合傘之外,長約0.7 mm(0.65～0.75 mm),腹唇長于背唇,背唇距末端約100 μm(90～115 μm)處有突起(圖3G)。

雌蟲陰門開口近圓形,寬約26 μm(22～30 μm),距肛門約96 μm(85～105 μm),肛門開口弧形,長約98 μm(90～105 μm),尾長約208 μm(200～215 μm)(圖3H～3I)。

采集地點:烏克蘭

宿主:驢(Equusasinus)、斑馬(Equusburchelli)、普氏野馬(Equusprzewalskii)

3 討論

本試驗利用掃描電子顯微鏡首次對杯口屬和副杯口屬的3種線蟲的體表結(jié)構(gòu)進行了比較觀察,杯口屬和副杯口屬線蟲在葉冠、蟲體大小和交合傘背肋的分裂方式上非常相似,其屬間與種間的形態(tài)學(xué)差別主要集中在頭端和生殖器,可通過口囊特征、內(nèi)葉冠的插入方式和背肋的特點進行區(qū)分,在光學(xué)顯微鏡下很難對上述結(jié)構(gòu)精確觀察,在掃描電子顯微鏡下外葉冠的形狀和數(shù)目、雄蟲交合傘的形狀、背肋的分列方式、生殖錐和雌蟲的尾部等結(jié)構(gòu)辨識清晰、立體感強,可更簡單直觀地對杯口屬和副杯口屬進行區(qū)分,有利于精確鑒定線蟲的種類,結(jié)果表明,通過掃描電子顯微鏡觀察,能發(fā)現(xiàn)3種線蟲的外部形態(tài)特征有明顯的差異。

杯口屬的2個種的線蟲形態(tài)在光學(xué)顯微鏡下非常相似,通過掃描電子顯微鏡更易區(qū)分,不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲的主要區(qū)別是內(nèi)、外葉冠的特征,本試驗不等齒杯口線蟲外葉冠數(shù)量為82枚,不同于張路平等[1]報道的76～80枚;拉氏杯口線蟲外葉冠數(shù)量為75枚,不同于Lichtenfels等[9]報道的60～70枚,與張路平等[5]報道的結(jié)果60～76枚相同。與前人光學(xué)顯微鏡下的觀察結(jié)果相比,掃描電子顯微鏡提供的數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確具體。不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲的生殖錐非常相似,在光學(xué)顯微鏡下很難發(fā)現(xiàn)區(qū)別,本試驗首次利用掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)其區(qū)別是不等齒杯口線蟲生殖錐皮質(zhì)領(lǐng)缺乏,而拉氏杯口線蟲生殖錐皮質(zhì)領(lǐng)在生殖錐兩側(cè)。不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲雌蟲尾長分別約為720 μm和470 μm,其比例約為2∶1,肛門開口長約為220 μm和245 μm,與張路平等[5]對上述結(jié)構(gòu)的測量相比,使用電子掃描顯微鏡測量的結(jié)果精確度得到了大幅度提高。

本試驗測定的麥?zhǔn)细北诰€蟲外葉冠數(shù)目為75枚,不同于Lichtenfels等[9]報道的60枚和張路平等[5]報道的62～68枚;雄蟲交合傘肋粗壯,生殖錐突出于交合傘之外,長約0.7 mm,背唇突起距末端約0.1 mm;雌蟲陰門與肛門距離較近,肛門開口較不等齒杯口線蟲和拉氏杯口線蟲小,約為98 μm;對上述結(jié)構(gòu)詳細(xì)的觀察和測量尚屬首次。

終上所述,本試驗利用掃描電子顯微鏡對3種馬屬動物寄生線蟲進行了觀察,認(rèn)為掃描電鏡圖譜辨識清晰,立體感強,更簡單直觀,擴大了不等齒杯口線蟲和麥?zhǔn)细北诰€蟲外葉冠數(shù)目的區(qū)間,精確觀察了杯口屬雄蟲生殖錐的皮質(zhì)領(lǐng),增加了許多有意義的數(shù)據(jù),為精確鑒定上述3種線蟲提供參考依據(jù)。