劉卓凡 孟洋 李欣蓉 田甜 宋國敏 孫世偉

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所 海南萬寧 571533；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 云南昆明 650201；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 湖北武漢 430070；4.海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南萬寧 571533；5.長江師范學(xué)院 重慶 408100）

咖啡果小蠹[Hypothenemus hampei(Ferrari)]屬鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae）小蠹亞科（Scolytinae）咪小蠹屬（Hypothenemus），主要分布在埃塞俄比亞、哥倫比亞、巴西、越南、泰國等70多個(gè)咖啡種植國家和地區(qū)，是一種危害咖啡種子的鉆蛀性害蟲，每年給全球咖啡產(chǎn)業(yè)造成約5億美元的損失[1-2]?？Х裙◇加?985年在?？诳诎妒状伪唤孬@[3]，于2019年第一次被發(fā)現(xiàn)在海南省萬寧市入侵[4]，并迅速擴(kuò)散至海南省主要咖啡產(chǎn)區(qū)?？Х裙◇荚诤Ｄ隙嗟氐姆N群不斷擴(kuò)大，為害日趨嚴(yán)重，給當(dāng)?shù)乜Х犬a(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對國內(nèi)咖啡產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。該蟲以雌成蟲從果實(shí)臍區(qū)鉆蛀進(jìn)入內(nèi)部，蛀食果肉和種子，并產(chǎn)卵于蛀道內(nèi)。咖啡果小蠹雌雄比約10:1，繁殖能力強(qiáng)，每頭雌蟲可產(chǎn)卵20～60粒，待幼蟲化蛹、羽化交配后，雌成蟲飛離繼續(xù)危害新鮮果實(shí)[5-6]。咖啡果小蠹是目前已知的唯一可在咖啡果實(shí)內(nèi)完成完整生命周期的昆蟲，其隱蔽的生活方式使得防治困難，化學(xué)防治具有局限性。因而，尋找一種綠色高效的防治手段對其進(jìn)行控制十分關(guān)鍵。昆蟲的感器是感知外界環(huán)境變化和對刺激產(chǎn)生反應(yīng)的重要結(jié)構(gòu)，大多富集于觸角，其通過辨別不同氣味使昆蟲產(chǎn)生吸引和驅(qū)避反應(yīng)[7-8]。植食性昆蟲可以通過刺激觸角上感器中的化學(xué)感器細(xì)胞，利用寄主植物揮發(fā)物來確定寄主、配偶和產(chǎn)卵、冬眠場所，不同類型的感器有不同的功能[9]。因此，研究咖啡果小蠹的觸角感器類型對于了解其在寄主選擇和定位過程具有十分重要的意義。

近年來，不少學(xué)者采用掃描電子顯微鏡技術(shù)研究了小蠹亞科昆蟲的觸角感器，包括華山松大小蠹（Dendroctonus armandi）[10]、紅脂大小蠹（Dendroctonus valens）[11-12]、光滑足距小蠹（Xylosandrus germanus）[13-14]、臍腹小蠹（Scolytus schevyrewi）[15]、云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）[16-17]、橫坑切梢小蠹（Tomicusminor）[16]、短毛切梢小蠹（Tomicusbrevipilosus）[16]、小粒材小蠹（Xyleborus saxeseni）[18]、松六齒小蠹（Ips acuminatus）[19]、暗翅足距小蠹（Xylosandrus crassiusculus）[14]、咖啡黑（枝）小蠹（Xylosandrus compactus）[20]、南方松大小蠹（Dendroctonus vitei）[21]、落葉松八齒小蠹（Ips subelongatus）[22]、云杉八齒小蠹（Ips typographus）[23]等，這些昆蟲的感器種類和功能有所差異，例如云南切梢小蠹、橫坑切梢小蠹、短毛切梢小蠹和南方松大小蠹觸角上的錐形感器表面具孔，被認(rèn)為是一種嗅覺感器[16-17,21]；紅脂大小蠹和落葉松八齒小蠹觸角上的毛形感器頂端具孔，兼具感受化學(xué)信息和機(jī)械刺激的功能[11-12,22]。咪小蠹屬在國內(nèi)少有分布，對屬內(nèi)特征的了解較為薄弱。前人對咖啡果小蠹的研究極少，主要集中在檢疫方面，咖啡果小蠹作為新入侵害蟲，目前尚無有關(guān)其觸角感器的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用掃描電鏡技術(shù)對咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角外部形態(tài)與感器進(jìn)行觀察，明確咖啡果小蠹成蟲觸角感器的超顯微結(jié)構(gòu)，并分析各感器的潛在功能，旨在進(jìn)一步明確觸角感器在寄主選擇和定位過程中的作用，為后續(xù)開展咖啡果小蠹電生理學(xué)、行為學(xué)調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

咖啡果小蠹成蟲采自位于海南省萬寧市的中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所咖啡試驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備在試驗(yàn)地內(nèi)采集被咖啡果小蠹為害的咖啡果實(shí)，置于人工氣候箱[T=(26.5±1)℃，RH=(75±5)%，14L:10D)]飼養(yǎng)，在體視鏡下解剖果實(shí)，獲取咖啡果小蠹成蟲以備用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)取咖啡果小蠹雌、雄成蟲各20頭，用超聲波清洗器（ELMA D-78224，德國）清洗1 min，室溫干燥后放入4%戊二醛溶液，置于4 ℃冰箱中固定24 h；用0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）沖洗3次，每次1 min，分別用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水，每次20 min；脫水后，將樣品用乙酸異戊酯置換2次，每次30 min，取出后在CO2臨界點(diǎn)干燥；將一小段導(dǎo)電膠粘在樣品臺(tái)上，在體視鏡（OLYMPUS SZX16，日本）下，用鑷子將干燥好的樣品按照腹面、背面、外側(cè)面和內(nèi)側(cè)面4個(gè)角度輕放在導(dǎo)電膠上；將樣品臺(tái)放入離子濺射儀（SBC-12，北京中科科儀股份有限公司）中鍍金屬膜；將經(jīng)上述處理后的咖啡果小蠹置于掃描電子顯微鏡（ZEISS EIGMA，德國）下，觀察其觸角的形態(tài)特征、感器類型及分布特點(diǎn)，電子顯微鏡工作電壓為10 kV。使用Adobe Photoshop CC 2015測量成蟲觸角各節(jié)長度及感器長度，3次重復(fù)，取平均值，對圖片添加比例尺并進(jìn)行標(biāo)注。每類感器統(tǒng)計(jì)4個(gè)面的總數(shù)，3次重復(fù)，取平均值。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)感器的類型主要參考Schneider[24]的方法進(jìn)行命名和歸類。記錄觸角各部位觸角感器的數(shù)量及分布，觸角感器百分比=(某種感器數(shù)量/感器的總數(shù)量)×100%。用Excel 2019記錄獲得的數(shù)據(jù)，通過SPSS 25.0軟件進(jìn)行計(jì)算與分析，并采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法（p＜0.05）對雌、雄蟲觸角各節(jié)長度、感器長度和感器數(shù)量進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌、雄成蟲觸角的基本形態(tài)

咖啡果小蠹雌、雄成蟲的觸角（圖1）結(jié)構(gòu)無明顯差異，均由柄節(jié)（Scape）、鞭節(jié)（Funicle）和錘頭部(Club) 3部分組成。柄節(jié)1節(jié)，粗長，呈棒錘狀，有少量感器，與頭部連接處有一凹陷；鞭節(jié)共5節(jié)，第1節(jié)呈念珠狀，第2、3、4、5節(jié)呈套筒狀，且逐漸變粗，其中，第1節(jié)、第3節(jié)、第5節(jié)上均有少量感器，其余各節(jié)無感器；錘頭部側(cè)面扁平，正面橢圓形，感器排列成3條帶狀，帶與帶之間相互平行。觸角各節(jié)表面上均有明顯的瓦棱狀花紋。雌、雄成蟲觸角及各節(jié)長度見表1，雌、雄成蟲間觸角長度、柄節(jié)長度和鞭節(jié)長度差異顯著，錘頭部長度二者之間不顯著。

表1 咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角及各節(jié)長度 單位：μm

圖1 咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角形態(tài)特征

2.2 觸角感器類型

雌、雄成蟲各類感器長度見表2，雌、雄成蟲間鋸齒形感器S.z.2與錐形感器S.b.1的長度存在差異，而其他類型感器長度雌、雄成蟲間無顯著差異。咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角上著生4類7種感器（圖2、3），分別為：毛形感器（S.tr.1、S.tr.2）、鋸齒形感器（S.z.1、S.z.2）、錐形感器（(S.b.1、S.b.2）、芽形感器（S.bs.），其中毛形感器、鋸齒形感器和錐形感器存在不同亞型。此外，在錘頭部表面還觀察到一種表皮孔。

表2 咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角感器長度 單位：μm

圖2 咖啡果小蠹成蟲觸角柄節(jié)和鞭節(jié)上感器的形態(tài)特征

圖3 咖啡果小蠹成蟲觸角錘頭部上感器的形態(tài)特征

2.2.1 毛形感器（Sensilla trichodea, S.tr.）觸角上數(shù)量最多的一類感器，約占總感器數(shù)量的52%。集中著生在錘頭部，直立或微微彎曲。根據(jù)毛形感器的長度、彎曲程度、頂端情況分為2種亞型：第1種為毛形感器Ⅰ型（S.tr.1），大多數(shù)存在于錘頭部的節(jié)間帶上，無基底窩，彎曲程度不明顯，逐漸變細(xì)至鈍尖，感器表面密集分布凹陷小孔，數(shù)量最多，占毛形感器的90.3%；第2種為毛形感器Ⅱ型（S.tr.2），絕大多數(shù)散生在錘頭部端部，毛發(fā)狀，較S.tr.1長，數(shù)量少于S.tr.1，從底端向上逐漸變細(xì)，整體細(xì)長且頂端略尖，彎曲幅度略大，感器頂端帶有小孔，占毛形感器的9.7%。

2.2.2 鋸齒形感器（Sensilla zigzag, S.z.）直立或彎曲，在柄節(jié)、鞭節(jié)、錘頭部均有分布，約占總感器數(shù)量的43.6%。根據(jù)感器鋸齒排列方式和分布位置分為2種亞型：第1種為鋸齒形感器Ⅰ型（S.z.1），存在于柄節(jié)和鞭節(jié)第1節(jié)，麥穗狀，兩側(cè)有鋸齒，占鋸齒形感器的10.1%；第2種為鋸齒形感器Ⅱ型（S.z.2），存在于鞭節(jié)第3節(jié)、第5節(jié)和錘頭部，一側(cè)光滑，一側(cè)有鋸齒，占鋸齒形感器的89.9%。

2.2.3 錐形感器（Sensilla basiconica, S.b.）直立，形似短錐，數(shù)量稀少，占感器總數(shù)的3.9%。根據(jù)感器外壁和頂端是否具孔分為2種亞型：第1種為錐形感器Ⅰ型（S.b.1），存在于柄節(jié)與頭部連接處以及錘頭部，外壁光滑，頂端無孔，占錐形感器的53.5%；第2種為錐形感器ⅠⅠ型（S.b.2），存在于柄節(jié)和鞭節(jié)連接處以及錘頭部，外壁凹凸不平，頂端有孔，占錐形感器的46.5%。

2.2.4 芽形感器（Sensilla bud-shaped, S.bs.）直立，形似禾谷類種子發(fā)芽。所有感器中形態(tài)最為短小并且數(shù)量最少的一種感器，著生于錘頭部頂端，無基底窩，占感器總數(shù)的0.6%。

2.2.5 表皮孔（Cuticular pore, CP）分布在錘頭部末端不著生感器的空白區(qū)域，多著生于感器附近，直徑小于1 μm。

2.3 咖啡果小蠹成蟲觸角感器分布規(guī)律

咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角感器的分布見表3。咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角的感器類型以及分布特點(diǎn)無明顯差異。各類感器的數(shù)量上，雌蟲均高于雄蟲，其中毛形感器S.tr.2的數(shù)量中，雌蟲顯著多于雄蟲，其他類型的感器數(shù)量二者差異不顯著。在所有觸角感器中，毛形感器數(shù)量最多，約占總感器數(shù)量的52%，主要分布在錘頭部的帶狀區(qū)域；鋸齒形感器數(shù)量僅次于毛形感器，約占總感器數(shù)量的44%，除在第2～4鞭節(jié)未見分布，其余各節(jié)均有分布，這2類感器的數(shù)量占絕對優(yōu)勢。錐形感器、芽形感器數(shù)量合計(jì)占總數(shù)的4%左右，其中芽形感器僅分布在錘頭部，其余感器在觸角各部位均有分布。

表3 咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角各節(jié)感器的分布及數(shù)量

咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角各節(jié)上的感器類型和數(shù)量有較大差異，柄節(jié)和鞭節(jié)感器類型相同，數(shù)量少且類型單一，均只有鋸齒形感器和錐形感器，其中鋸齒形感器都分布在柄節(jié)和鞭節(jié)表面，錐形感器都分布在連接處。柄節(jié)感器數(shù)量占總體的3.9%，鞭節(jié)感器數(shù)量占總體的5.1%。錘頭部擁有全部類型的感器，且分布數(shù)量也最多，占總體的91.0%，錘頭部感器分為3節(jié)，每節(jié)均由最外層的鋸齒形感器S.z.2包裹著排列于內(nèi)層的其他類型感器，第1節(jié)鋸齒形感器環(huán)狀排成1列，圍繞節(jié)間輪生，毛形感器環(huán)狀排成1列，主要分布在兩側(cè)，中間部分少有分布，其中一側(cè)有1個(gè)錐形感器；第2節(jié)鋸齒形感器和毛形感器均圍繞節(jié)間輪生，其中鋸齒形感器環(huán)狀排成1列，毛形感器雌蟲環(huán)狀排成2列、雄蟲環(huán)狀排成1列；第3節(jié)各類感器密集散生，未有明顯的環(huán)狀排列。雌、雄成蟲第2、4鞭節(jié)上均無任何感器?？Х裙◇寂c其他種類小蠹感器數(shù)量占比如圖4所示?？梢钥闯?，咖啡果小蠹的鋸齒形感器占比明顯高于其他種類小蠹，但尚不明確咖啡果小蠹鋸齒形感器數(shù)量顯著高于其他種類小蠹蟲的原因。

圖4 咖啡果小蠹與其他種類小蠹各感器數(shù)量占比

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

掃描電子顯微鏡對咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角感器的超顯微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果表明，咖啡果小蠹的觸角上有4類7種感器。此外，在一些感器基部周圍發(fā)現(xiàn)了一種表皮孔，這些表皮孔可能起到分泌潤滑劑的作用[25]。

小蠹科成蟲觸角感器類型較為相似，咖啡果小蠹與足距小蠹屬的光滑足距小蠹、咖啡黑（枝）小蠹觸角感器類型及分布相似，都具有毛形感器、鋸齒形感器、錐形感器和芽形感器，但在數(shù)量上有所差異，后2種小蠹蟲的毛形感器在錘頭部密集散生，而咖啡果小蠹則在節(jié)間輪生[13,20]。咖啡果小蠹的毛形感器與松六齒小蠹、華山松大小蠹和云南切梢小蠹分布相似，都分布在錘頭部及帶與帶之間；咖啡果小蠹與松六齒小蠹、云南切梢小蠹的鋸齒形感器分布相似，均在其觸角的柄節(jié)、鞭節(jié)以及錘頭部分布，但二者也存在一定的差異性，咖啡果小蠹的芽形感器散生于錘頭部；華山松大小蠹芽形感器分布于柄節(jié)背面末端、鞭節(jié)和柄節(jié)的連接處或觸角錘頭部，云南切梢小蠹芽形感器著生于柄節(jié)基部的凹陷中[10,17,19]。

觸角感器可以感受機(jī)械刺激和化學(xué)物質(zhì)信息，是參與完成基本生物學(xué)行為的重要部分[26]，不同類型的感器執(zhí)行不同功能。毛形感器是最基礎(chǔ)的嗅覺感器，兼具感受性信息素和寄主揮發(fā)物的作用，同時(shí)毛形感器可以幫助昆蟲尋找合適的產(chǎn)卵場所[7,27-28]。不同亞型的毛形感器作用有所差別，咖啡果小蠹觸角感器中毛形感器S.tr.1數(shù)量最多，這種感器存在于大多數(shù)小蠹蟲的觸角中，如紅脂大小蠹、云南切梢小蠹、橫坑切梢小蠹、短毛切梢小蠹、光滑足距小蠹、暗翅足距小蠹、落葉松八齒小蠹、云杉八齒小蠹，此類感器外壁上遍布許多細(xì)小的孔洞，這些孔洞可能與氣味接收、識(shí)別和辨別有關(guān)[11,14,16,22-23]。因此，S.tr.1被認(rèn)為是嗅覺感器的證據(jù)。毛形感器S.tr.2與Chen等[11]在紅脂大小蠹和Shi等[22]在落葉松八齒小蠹發(fā)現(xiàn)的一種毛形感器相同，感器彎曲且頂端具孔，這種毛形感器已被發(fā)現(xiàn)具有化學(xué)感器和機(jī)械感器的功能。吳瓊等[29]通過對華山松大小蠹觸角進(jìn)行透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，鋸齒形感器中無神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)結(jié)構(gòu)，只具有感器的外部形態(tài)特征，不具備感器的感受功能?？Х裙◇汲上x觸角上有著豐富的鋸齒形感器，在錘頭部鋸齒形感器沿著毛形感器的密集帶排列，為這些嗅覺感器提供了保護(hù)作用，并且可以防止蟲體受到機(jī)械傷害。錐形感器內(nèi)有豐富的神經(jīng)細(xì)胞，具有識(shí)別氣味的能力[12]。在其他小蠹上并未發(fā)現(xiàn)與咖啡果小蠹類似的頂端帶孔的錐形感器S.b.2，光滑足距小蠹和暗翅足距小蠹的觸角感器中存在一種頂端具孔的錐形感器，但其表面光滑，并且此感器數(shù)量雄性多于雌性[14]。S.b.2上的微孔可能與毛形感器S.tr.2頂端上的微孔作用類似，都可以通過感受外界氣體物質(zhì)形成神經(jīng)沖動(dòng)，咖啡果小蠹可能依靠觸角上的錐形感器參與了寄主定位。芽形感器也被認(rèn)為是一種錐形感器。Payne等[30]認(rèn)為，芽形感器可能具有化學(xué)感受功能，但對化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)類型可能不同于其他錐形感器。感器內(nèi)樹突可沿毛發(fā)內(nèi)腔向上延伸至尖端，并暴露于空氣中以檢測水蒸氣、CO2或其他化學(xué)物質(zhì)[31]。

雌性咖啡果小蠹觸角整體長度、柄節(jié)長度和鞭節(jié)長度都顯著高于雄性，而錘頭部二者并未有差異，這可能是因?yàn)楦衅鞔蠖嗝芗阱N頭部，是感受化學(xué)物質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)，因此二者差異并不顯著。感器長度中，鋸齒形感器S.z.2和錐形感器S.b.1雌性和雄性二者差異顯著，這可能是由于雄蟲一生只存活在果實(shí)內(nèi)部，不存在雄性競爭和尋找食物等壓力，因此，其保護(hù)型鋸齒形感器長度顯著小于雌蟲；同時(shí)，由于生存壓力小，雄蟲識(shí)別氣味的錐形感器長度顯著小于雌蟲。雌蟲錘頭部的毛形感器S.tr.2數(shù)量顯著多于雄蟲，這可能是因?yàn)镾.tr.2參與了雌性尋找寄主植物和產(chǎn)卵場所過程。本研究觀察了咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角的形態(tài)特征、感器類型和分布規(guī)律，明確了咖啡果小蠹雌、雄成蟲觸角感器的類型和分布規(guī)律及各種感器在寄主定位中的作用及功能，但需進(jìn)一步通過透射電鏡試驗(yàn)、電生理試驗(yàn)和行為學(xué)研究來證實(shí)。

3.2 結(jié)論

咖啡果小蠹觸角具有4類7種感器，分別為：毛形感器、鋸齒形感器、錐形感器和芽形感器，其中毛形感器、鋸齒形感器和錐形感器均具有2種亞型?？Х裙◇嫉?種感器在雌、雄成蟲上都有發(fā)現(xiàn)，不存在性二型現(xiàn)象，所有類型的感器數(shù)量雌蟲都多于雄蟲。雌、雄成蟲觸角感器的形態(tài)、種類和分布位置均無明顯差異，以毛形感器數(shù)量最多，該類感器在咖啡果小蠹的寄主定位中起到重要作用，毛形感器S.tr.2數(shù)量雌雄間存在差異，與尋找寄主植物和產(chǎn)卵場所有關(guān)；鋸齒形感受器數(shù)量與毛形感受器相當(dāng)，起著感受機(jī)械刺激和保護(hù)嗅覺感受器的作用。雌雄成蟲在觸角長度、柄節(jié)長度和鞭節(jié)長度上有明顯差異，錘頭部長度無明顯差異；雌雄成蟲在鋸齒形感受器S.z.2和錐形感受器S.b.1長度上有明顯差異，可能與咖啡果小蠹的生存方式有關(guān)。