榮家慶,任慧英,劉文華,張 燦

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109)

大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)是臨床上最常見的條件致病菌,也是近年來流行病學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對象,通常引起多種動物發(fā)生大腸桿菌病,多以幼齡畜禽高發(fā),嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)健康,每年由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失數(shù)以億計(jì)[1]?？股仡愃幬镌切笄蒺B(yǎng)殖過程中治療大腸桿菌病的首選,然而隨著抗生素的長期廣泛使用,耐藥性大腸桿菌迅速出現(xiàn)并蔓延,臨床上已有大量多重耐藥和廣泛耐藥菌株報(bào)道[2,3]?？股啬退幮缘娜蛐詡鞑ヒ殉蔀橥{人畜健康的社會公共安全問題,亟需尋找新型抑菌制劑防控耐藥菌的傳播和感染[4]。噬菌體作為細(xì)菌的天敵,在自然界中廣泛存在,可特異性侵入并破壞宿主細(xì)菌,且不對動物本身造成損害,具有替代抗生素治療細(xì)菌病的潛力。早在19世紀(jì)初期,噬菌體即應(yīng)用于臨床細(xì)菌病的防治,后因發(fā)現(xiàn)抗生素治療細(xì)菌病效果卓越,噬菌體研究被擱置,幾十年間僅在格魯吉亞等少數(shù)國家以噬菌體雞尾酒制劑方式應(yīng)用于臨床,如今噬菌體重新成為世界關(guān)注的熱點(diǎn)[5]。在臨床生產(chǎn)中通常選擇裂解譜寬、效價高、裂解能力強(qiáng)、無毒力基因的烈性噬菌體進(jìn)行噬菌體雞尾酒的配制[6]。

本試驗(yàn)以96株大腸桿菌為宿主菌,從雞場糞樣中分離得到1株長尾噬菌體,命名為LHE71,并對其生物學(xué)特性和全基因組進(jìn)行分析,以期為后續(xù)噬菌體制劑的開發(fā)和應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和樣品 96株大腸桿菌臨床分離株由本實(shí)驗(yàn)室保存;5份糞便樣品,采集自山東省臨沂市某雞場。

1.1.2 主要試劑 磷鎢酸(Phosphotungstic acid,PTA)和SM緩沖液,均購自北京雷根生物技術(shù)有限公司;LB培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂等,均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 超凈臺(SW-CJ-2F型),蘇凈集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品;電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH·B11·360-s型),上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;電熱恒溫水浴鍋(HH·SYZ1-N型)和六聯(lián)電子調(diào)溫電爐,龍口市先科儀器公司產(chǎn)品;臺式離心機(jī)(TDL80-2B型),上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;可調(diào)式微量移液器,大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司產(chǎn)品;透射電子顯微鏡(HT7700 TEM),日力高新技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離和純化 以96株大腸桿菌臨床分離株為宿主菌,使用糞便樣品進(jìn)行噬菌體的分離。取10 g糞樣放入燒杯中,加入100 mL LB培養(yǎng)液放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h,加入96株大腸桿菌的混合菌液5 mL,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,4 000 r/min離心30 min,取上清液,用0.22 μm無菌濾器抽濾,濾液置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用雙層平板法[7]進(jìn)行噬菌體的分離和純化。取100 μL濾液分別與等體積的 96株大腸桿菌菌液于上層培養(yǎng)基中混勻,倒于普通瓊脂平板上,凝固后在37 ℃條件下倒置培養(yǎng)3～4 h,觀察并記錄各菌株平板上的噬斑。摳取單個噬斑于離心管中,用1 mL生理鹽水浸出,于37 ℃孵育30 min,12 000 r/min離心5 min,取上清,用0.22 μm無菌濾器抽濾,將濾液稀釋至適宜濃度梯度,取50 μL分離出噬菌體對應(yīng)的大腸桿菌菌液 (109CFU/mL)與等體積的濾液混勻,雙層平板法純化噬菌體。按上述方法將噬菌體純化3代以上,得到噬斑形態(tài)單一的純化噬菌體,-80 ℃凍存于30%甘油中待用。

1.2.2 噬菌體裂解譜測定 用雙層平板法[7]測定噬菌體的裂解譜。取100 μL 純化噬菌體增殖液(103PFU/mL)分別與96株大腸桿菌菌液以及E.coliK12菌液混合于上層培養(yǎng)基中,倒于普通瓊脂平板上,倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 噬菌體形態(tài)觀察 取20 μL純化噬菌體增殖液(5.0×1014PFU/mL)滴于銅網(wǎng)上靜置15 min,用濾紙吸去多余的液體。銅網(wǎng)上滴加5 μL 2% PTA,染色5 min,用濾紙吸去多余的染液,自然晾干后,用透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)特征。

1.2.4 最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)測定 取純化噬菌體增殖液進(jìn)行10倍倍比稀釋,與對應(yīng)宿主菌菌液(1.0×109CFU/mL)按照MOI為0.01、0.1、1、10、100和1 000混勻,加入5 mL LB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h,12 000 r/min離心20 min,0.22 μm無菌濾器抽濾,獲得噬菌體增殖液,雙層平板法[7]測定噬菌體效價,每個MOI設(shè)3個平行,最高效價的噬菌體對應(yīng)的MOI即為最佳MOI。

1.2.5 熱穩(wěn)定性測定 取500 μL純化噬菌體增殖液(1.0×1015PFU/mL)分別置于40、50、60、70和80 ℃水浴1 h,于20、40和60 min各取樣200 μL,用雙層平板法[7]測定噬菌體效價,每個溫度設(shè)3個平行。以時間為橫坐標(biāo),噬菌體效價為縱坐標(biāo),繪制噬菌體的熱穩(wěn)定性曲線。

1.2.6 紫外線穩(wěn)定性測定 取4 mL純化噬菌體增殖液(1.0×1015PFU/mL)置于平皿中,將其置于距紫外燈(功率:30 W)40 cm處持續(xù)照射。每10 min取200 μL噬菌體增殖液,用雙層平板法[7]測定噬菌體效價,連續(xù)測定60 min,每個時間點(diǎn)設(shè)3個平行。以時間為橫坐標(biāo),噬菌體效價為縱坐標(biāo),繪制噬菌體紫外線穩(wěn)定性曲線。

1.2.7 一步生長曲線測定 取純化噬菌體增殖液(3.0×108PFU/mL)和對應(yīng)宿主菌菌液(3×109CFU/mL)各200 μL,充分混勻,37 ℃孵育5 min,加至7 mL LB肉湯中,置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于不同時間點(diǎn)(從0 min開始,前1 h每隔10 min,1 ～3 h每隔20 min,3 h后每隔30 min)取200 μL增殖液,13 000 r/min離心1 min,取上清,雙層平板法[7]測噬菌體效價,每個時間點(diǎn)設(shè)3個平行。以時間為橫坐標(biāo),噬菌體效價為縱坐標(biāo),繪制一步生長曲線,確定噬菌體的潛伏期、爆發(fā)期和爆發(fā)量。

1.2.8 pH穩(wěn)定性測定 取純化噬菌體增殖液(1.0×1012PFU/mL)分別加入不同pH(3～12)的LB肉湯,37 ℃水浴條件下孵育,分別于1、2 和3 h取樣,雙層平板法[7]測定噬菌體效價,每個時間點(diǎn)設(shè)3個平行。以時間為橫坐標(biāo),噬菌體效價為縱坐標(biāo),繪制噬菌體pH穩(wěn)定性曲線。

1.2.9 噬菌體全基因組測序和分析 將噬菌體增殖液送至深圳市惠通生物科技有限公司,使用Illumina 測序平臺進(jìn)行全基因組測序,用SPAdes軟件進(jìn)行序列拼接,對獲得的數(shù)據(jù)使用RAST平臺(https://rast.nmpdr.org/)進(jìn)行注釋,獲得噬菌體的全基因組注釋信息,使用DNASTAR軟件分析(G+C)%含量,并將全基因組序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源比對,使用在線工具tRNAscan-SE(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)對噬菌體進(jìn)行tRNA預(yù)測;使用在線數(shù)據(jù)庫CGE Server(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)預(yù)測噬菌體基因組中攜帶的毒力基因和耐藥基因;使用在線工具Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)預(yù)測噬菌體基因組中解聚酶基因。根據(jù)以上基因組分析結(jié)果,使用SnapGene軟件繪制噬菌體的全基因組框架圖。

1.2.10 噬菌體進(jìn)化樹分析和共線性分析 選取噬菌體的末端酶大亞基和衣殼蛋白,在MEGA軟件中用鄰接法(Neighbor-joining method)選擇默認(rèn)參數(shù)構(gòu)建進(jìn)化樹。噬菌體全基因組序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對,選擇與噬菌體同源性較高的5個噬菌體,使用Mauve軟件進(jìn)行共線性分析。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體的分離、純化和裂解譜測定 利用雙層平板法從雞場糞樣中分離到1株大腸桿菌噬菌體,命名為LHE71。雙層平板法測定噬菌體LHE71的裂解譜,可裂解17株大腸桿菌分離株,裂解率為17.7%(17/96),結(jié)果見表1。噬菌體LHE71能夠裂解大腸桿菌參考株E.coliK12,因此,以E.coliK12為宿主菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 噬菌體LHE71的裂解譜范圍Table 1 Lytic spectrum range of phage LHE71

2.2 噬菌體形態(tài)觀察 大腸桿菌噬菌體LHE71經(jīng)3次純化,形成清澈透亮、邊緣整齊帶暈環(huán)的噬斑(圖1A),暈環(huán)隨培養(yǎng)時間的延長逐漸擴(kuò)大,最終暈環(huán)直徑可達(dá)4～5 mm(圖1B)。對大腸桿菌噬菌體LHE71進(jìn)行透射電鏡形態(tài)觀察,可見噬菌體LHE71由明顯的正二十面體頭部和不可伸縮的彎曲尾部構(gòu)成,頭部直徑約70 nm,尾部長約150 nm (圖2)。

圖1 噬菌體LHE71的噬斑形態(tài)觀察Fig.1 Plaque morphology observation of phage LHE71A:噬菌體孵育4 h; B:噬菌體孵育12 hA:Phage incubation for 4 h; B:Phage incubation for 12 h

圖2 噬菌體LHE71在透射電鏡下的形態(tài)Fig.2 Morphology of phage LHE71 under transmission electron microscope

2.3 最佳MOI測定 分別將噬菌體LHE71與宿主菌E.coliK12按不同MOI混合培養(yǎng),雙層平板法測定噬菌體最佳MOI,結(jié)果如表2所示,當(dāng)MOI為0.1時,噬菌體LHE71的效價最高,達(dá)到2.6×1015PFU/mL。

表2 噬菌體LHE71最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)Table 2 Optimal MOI of phage LHE71

2.4 熱穩(wěn)定性測定 用雙層平板法測定噬菌體在不同溫度條件下的穩(wěn)定性,結(jié)果如圖3所示,噬菌體LHE 71在40和50 ℃條件下,效價保持穩(wěn)定;當(dāng)溫度為60 ℃時,噬菌體LHE71效價在20 min內(nèi)未見明顯下降,60 min時噬菌體效價下降3個數(shù)量級;當(dāng)溫度為70 ℃時,噬菌體LHE71效價在20 min時顯著下降至103PFU/mL;當(dāng)溫度為80 ℃時,噬菌體效價迅速下降,40 min時全部失活。

圖3 噬菌體LHE71熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of phage LHE71

2.5 紫外線穩(wěn)定性測定 噬菌體LHE71紫外線穩(wěn)定性結(jié)果如圖4所示,噬菌體LHE71隨紫外線照射時間延長,效價逐漸下降;紫外線連續(xù)照射40 min時,噬菌體LHE71效價下降約7個數(shù)量級;紫外線連續(xù)照射60 min時,噬菌體LHE71效價降低至107PFU/mL。

圖4 噬菌體LHE71紫外線穩(wěn)定性Fig.4 UV stability of phage LHE71

2.6 一步生長曲線測定 以E.coliK12為宿主菌,測定MOI為0.1時噬菌體LHE71的一步生長曲線,結(jié)果如圖5所示,噬菌體LHE71的潛伏期約為40 min,爆發(fā)期約為110 min,150 min后進(jìn)入平臺期,爆發(fā)量為104PFU/cell。

圖5 噬菌體LHE71的一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of phage LHE71

2.7 pH穩(wěn)定性測定 噬菌體LHE71 pH穩(wěn)定性如圖6所示,噬菌體LHE71在pH 7～9范圍內(nèi)相對穩(wěn)定;當(dāng)pH<7或pH>9時,噬菌體效價隨時間延長而迅速下降;當(dāng)pH≤4或pH≥11時,噬菌體在1 h內(nèi)完全失活。

圖6 噬菌體LHE71的pH穩(wěn)定性Fig.6 pH stability of phage LHE71

2.8 噬菌體全基因組組成分析 噬菌體LHE71全基因組序列全長為50 158 bp,(G+C)%含量為45.11%。LHE71基因組中未發(fā)現(xiàn)tRNA,不攜帶耐藥基因和毒力基因。同源性比對結(jié)果顯示,在GenBank中共有32株噬菌體與LHE71具有同源性,其中志賀氏菌噬菌體Sfin-3與噬菌體LHE71同源性最高,覆蓋率為91%,相似性為92.41%。根據(jù) Turner等[8]報(bào)道,確定噬菌體LHE71為一新種。

2.9 噬菌體LHE71功能注釋和開放閱讀框分析 用RAST在線平臺對噬菌體LHE71進(jìn)行全基因組注釋,結(jié)果如圖7所示,噬菌體LHE71基因組共注釋81個開放閱讀框 (Open reading frame,ORF),其中僅18個為正向轉(zhuǎn)錄,其余均為反向轉(zhuǎn)錄。噬菌體LHE71全基因組呈現(xiàn)典型的模塊化特征,共有24個orf基因注釋為已知功能的基因,無tRNA,不含毒力基因和耐藥基因。全基因組按照功能可劃分為3個區(qū)域:(1)結(jié)構(gòu)蛋白部分集中在基因組下游,主要和翻譯后期組裝成完整的噬菌體結(jié)構(gòu)相關(guān),包括orf51、orf60、orf61、orf62、orf63、orf64、orf65、orf68、orf74、orf77、orf78、orf79、orf80和orf81;(2)DNA復(fù)制和代謝部分,該部分主要負(fù)責(zé)利用細(xì)菌基因組進(jìn)行自身復(fù)制和組裝,主要集中在全基因組中游,包括orf9、orf47、orf49、orf50、orf52、orf55和orf56;(3)裂解系統(tǒng),包括裂解酶(orf40)和穿孔素(orf41)。其余orf基因均為編碼未知功能蛋白的基因。經(jīng)Phyre 2在線平臺分析結(jié)果顯示,orf53編碼的蛋白和編號為C5EW5C的蛋白有較高的同源性(98%),預(yù)測與噬菌體形成暈環(huán)相關(guān)。

圖7 噬菌體LHE71的全基因組框架圖Fig.7 Whole genome frame diagram of phage LHE71箭頭:轉(zhuǎn)錄方向; 不同顏色:不同功能的蛋白,其中結(jié)構(gòu)蛋白為紅色,裂解系統(tǒng)蛋白為黑色,復(fù)制轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白為綠色,假設(shè)蛋白為藍(lán)色Arrow:Transcription direction; Different colors:Proteins with different functions,the structural proteins are red,the lysis system proteins are black,the replication-transcription-related proteins are green,and the hypothetical proteins are blue

2.10 噬菌體LHE71進(jìn)化樹分析和共線性分析 選取噬菌體LHE71的末端酶大亞基和衣殼蛋白基因序列,與其他同源性較高的噬菌體構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果如圖8所示,噬菌體LHE71分別與噬菌體phi2013和pSf-2親緣關(guān)系最近,且2株噬菌體均為同一屬成員,根據(jù)Turner等[8]報(bào)道,可以確定噬菌體LHE71為Drexlerviridae科Tunavirus屬的新成員。

圖8 噬菌體LHE71系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析Fig.8 Phylogenetic analysis of phage LHE71A:末端酶大亞基進(jìn)化樹; B:衣殼蛋白進(jìn)化樹A:Phylogenetic tree of terminase large subunits; B:Phylogenetic tree of capsid proteins

選取與噬菌體LHE71同源性較高的5個噬菌體進(jìn)行基因組共線性分析,結(jié)果見圖9所示,噬菌體LHE71與噬菌體MA9V-1基因組排序一致,與其余4株噬菌體的基因組比較,在9 500～50 000 bp區(qū)域出現(xiàn)了大片段的重排,其中6 100～7 500 bp區(qū)域無同源性,在GenBank數(shù)據(jù)庫中也無同源序列,為噬菌體LHE71獨(dú)有序列。

圖9 噬菌體LHE71共線性分析Fig.9 Collinearity analysis of phage LHE71

3 討論

近40年來,新型抗生素研發(fā)工作近乎停滯,世界衛(wèi)生組織于2017年宣布全球抗生素瀕臨枯絕,細(xì)菌耐藥性將成為威脅健康的最大問題之一,抗生素替代品研發(fā)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)[9]。噬菌體能夠特異性裂解宿主菌,其裂解細(xì)菌的作用機(jī)制與抗生素完全不同,因而不受細(xì)菌耐藥性的限制,近年來已有大量噬菌體成功應(yīng)用于臨床的報(bào)道,噬菌體展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[10]。在格魯吉亞的Eliava噬菌體治療中心和位于波蘭Wroclaw市的噬菌體治療中心,噬菌體雞尾酒療法已被成功應(yīng)用上百年[11]。本試驗(yàn)從雞場糞樣中分離到1株大腸桿菌噬菌體,命名為LHE71,并對其生物學(xué)特性和全基因組開展了研究。

噬菌體具有嚴(yán)格的宿主特異性,這既是噬菌體治療的優(yōu)點(diǎn),同時在一定程度上也限制了噬菌體的臨床應(yīng)用。生產(chǎn)上通常將多種具有不同裂菌譜的噬菌體混合制成噬菌體雞尾酒,以解決噬菌體裂解譜普遍較窄的問題。因此,噬菌體雞尾酒制劑通常選擇宿主譜寬、裂解能力強(qiáng)且無毒力基因的噬菌體,使制劑具有廣譜的裂菌活性特征。本試驗(yàn)中分離到的烈性噬菌體LHE71基因組中不含毒力基因和耐藥基因,可特異性裂解多種血清型的大腸桿菌,并且對多種理化因子耐受性強(qiáng),表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

細(xì)菌生物膜是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的原因之一。與游離生長的細(xì)菌相比,生物膜中細(xì)菌的抗生素耐藥性增加了1 000～5 000倍,這給細(xì)菌感染的臨床治療帶來了極大困難。研究發(fā)現(xiàn),噬菌體編碼的解聚酶可以有效抑制細(xì)菌生物膜的形成,對已形成的細(xì)菌生物膜也有很強(qiáng)的裂解效果,有望成為應(yīng)對細(xì)菌感染的新型工具[12]。解聚酶最直觀的表現(xiàn)是能夠在噬斑周圍產(chǎn)生暈環(huán),暈環(huán)的大小反應(yīng)解聚酶的活性。本試驗(yàn)中分離到的大腸桿菌噬菌體LHE71可在雙層瓊脂平板上長出大小均勻、邊緣整齊且?guī)в袝灜h(huán)的噬斑,且暈環(huán)隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸擴(kuò)大,有典型的解聚酶特征;基因組分析發(fā)現(xiàn),LHE71orf53基因編碼具有解聚酶特征的肽段,值得進(jìn)一步研究。

噬菌體的增殖性能與噬菌體制劑的生產(chǎn)成本息息相關(guān)。噬菌體LHE71在MOI為0.1時,效價高達(dá)2.6×1015PFU/mL,爆發(fā)量達(dá)104PFU/cell,表明該噬菌體具有優(yōu)異的增殖性能。通常情況下,噬菌體效價和爆發(fā)量大小與宿主細(xì)胞的潛伏期和蛋白質(zhì)合成機(jī)制有關(guān)[13]。宿主細(xì)胞越大,噬菌體潛伏期越長,往往爆發(fā)量越高[14]。例如,噬菌體SA的潛伏期為30 min,爆發(fā)量為103PFU/cell[15];噬菌體MS2潛伏期為45 min,爆發(fā)量為2×103PFU/cell[16];1株以禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)為宿主菌的噬菌體潛伏期為24 h,爆發(fā)量高達(dá)2.4×104PFU/cell[17]。本試驗(yàn)生長曲線結(jié)果顯示,噬菌體LHE71潛伏期長,爆發(fā)量高,用于生產(chǎn)可極大節(jié)約生產(chǎn)成本,有開發(fā)為噬菌體制劑的價值。

綜上所述,本試驗(yàn)分離并鑒定了1株烈性大腸桿菌噬菌體LHE71,不含毒力基因和耐藥基因,對多種理化因子具有良好的耐受性,并且具有解聚酶活性,增殖性能高,具有良好的應(yīng)用價值,可進(jìn)一步開發(fā)為噬菌體制劑用于防控臨床耐藥性大腸桿菌感染。