摘要：【目的】克隆凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）自噬相關(guān)基因13（ATG13），并分析凡納濱對蝦ATG13基因的組織表達特征及其在外源刺激后的表達變化，為探究ATG13基因在凡納濱對蝦抗病原感染過程中的作用機制提供理論依據(jù)。【方法】采用PCR擴增凡納濱對蝦ATG13基因，通過ProtParam、Softberry、SMART、InterProScan等在線軟件進行生物信息學分析，并以實時熒光定量PCR檢測凡納濱對蝦ATG13基因的組織表達特征及其在哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）和Poly（I：C）刺激后的表達變化?！窘Y(jié)果】凡納濱對蝦ATG13基因開放閱讀框（ORF）為1431 bp，共編碼476個氨基酸殘基；凡納濱對蝦ATG13蛋白相對分子量為52.4 kD，理論等電點（pI）為5.40，屬于疏水性蛋白，不存在信號肽，但其N末端存在1個ATG13功能域（第94～167位氨基酸處）。凡納濱對蝦ATG13氨基酸序列與果蠅（Drosophila melano-gaster）ATG13氨基酸序列的相似性高達97%，基于ATG13氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示凡納濱對蝦與果蠅的親緣關(guān)系最近。ATG13基因在凡納濱對蝦肝胰腺、肌肉、鰓、中腸、血細胞、心臟、腦和皮膚等組織中均有不同程度的表達，以肝胰腺中的相對表達量最高，其次是肌肉和中腸，在皮膚和血細胞中的相對表達量較低。經(jīng)哈維氏弧菌和poly（I：C）刺激后，凡納濱對蝦ATG13基因在肝胰腺、中腸和鰓組織中的相對表達量整體上呈先上升后下降的變化趨勢，且在刺激后12、24或48 h達最高值，極顯著高于對照組（PBS）（Plt;0.01）?！窘Y(jié)論】受哈維氏弧菌或poly（I：C）等外源刺激后，凡納濱對蝦通過上調(diào)自噬相關(guān)基因ATG13表達以調(diào)控機體清除受損的細胞器和維持細胞穩(wěn)態(tài)，即ATG13基因參與凡納濱對蝦抗病原感染的響應(yīng)過程。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；ATG13基因；自噬；哈維氏弧菌；Poly（I：C）

中圖分類號：S945.49文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）05-1471-09

Cloning and functional analysis of ATG13 gene of Litopenaeusvannamei

LI Guo-jian1，YUAN Yun-hao1，ZHONG Jian2，LUO Jun-liang1，YANG Shi-ping1*

（1College of Fisheries，Guangdong Ocean University/Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal DiseaseControl and Healthy Culture/Key Laboratory of Control for Diseases of Aquatic Economic Animals of GuangdongHigher Education Institutes，Zhanjiang，Guangdong 524088，China；2Zhanjiang Customs，Zhanjiang，Guangdong 524022，China）

Abstract：【Objective】This study aimed to clone the autophagy-related gene 13（ATG13）from Litopenaeusvanna-mei，and investigate its tissue expression pattern and response to exogenous stimulation.These findings provided a theo-retical basis for exploring the role of ATG13 gene in the process of disease-resistant infection of L.vannamei.【Method】The ATG13 gene ofL.vannamei was amplified by PCR，and bioinformatics analysis was performed by ProtParam，Soft-berry，SMART and InterProScan online softwares.Real-time fluorescence quantitative PCR was employed to determinethe tissue expression of ATG13 gene in L.vannamei and its expression changes after stimulation by Vibrio harveyi and Poly（I：C）.【Result】The open reading frame（ORF）of ATG13 gene was 1431 bp，encoding 476 amino acid residues.With arelative molecular weight of 52.4 kD and a theoretical isoelectric pI of 5.40，the ATG13 protein was a hydrophobic proteinlacking signal peptide but containing an ATG13 functional domain（94-167 amino acids）at its N-terminus.The ATG13amino acid sequence of L.vannamei shared a high similarity（97%）with that of Drosophila melanogaster，and the phylo-genetic tree based on ATG13 amino acid sequence similarity also indicated the closest relationship between L.vannamei and D.melanogaster.ATG13 gene was expressed in various tissues of L.vannamei，including hepatopancreas，muscles，gills，midgut，blood cells，heart，brain and skin.The relative expression of ATG13 gene was the highest in hepatopan-creas，followed by muscle and midgut，and relatively low in skin and blood cells.After stimulation with V.harveyi and Poly（I：C），the relative expression of ATG13 gene in hepatopancreas，midgut and gill tissues of L.vannamei initially in-creased and then decreased，and reached the highest value at 12，24 or 48 h after stimulation，which was extremely sig-nificantly higher than control group（PBS）（Plt;0.01）.【Conclusion】After exogenous stimulation with V.harveyi or Poly（I：C），L.vannamei up-regulates the expression of autophagy-related gene ATG13 to regulate the clearance of damaged organelles and maintain cell homeostasis，suggesting that ATG13 gene is involved in the response process of disease-resistant infection of L.vannamei.

Key words：Litopenaeusvannamei；ATG13 gene；autophagy；Vibrio harveyi；Poly（I：C）

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32073006）；Guangdong Rural Science and Tech-nology Commissioner Project（KTP20210291）；Construction Project of Modern Industrial Park for White Shrimp Bree-ding of Guangdong（K22219）

0引言

【研究意義】自20世紀70年代以來，我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷壯大，僅2020年我國的對蝦養(yǎng)殖量就達215萬t（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等，2021）。作為變溫無脊椎動物，對蝦極易遭受外界刺激而產(chǎn)生氧化應(yīng)激，甚至引起疾病暴發(fā)（熊大林等，2020；梅光明等，2022）。如在氨氮脅迫下，凡納濱對蝦（Litopenaeusvannamei）免疫系統(tǒng)紊亂，白斑綜合征病毒（WSSV）增殖速度加快，從而改變能量代謝途徑、降低能量儲備、干擾離子交換平衡、阻礙氮排泄過程及誘導氧化應(yīng)激（方金龍等，2017）。自噬作為機體應(yīng)對各種氧化應(yīng)激和炎癥過程的反應(yīng)，在維持機體氧化還原穩(wěn)態(tài)及存活中發(fā)揮重要作用（胡偉等，2020）。自噬過程需要一系列自噬相關(guān)基因（Autophagy related genes，ATG）的參與和調(diào)控，因此開展ATG基因克隆及其功能分析，有助于了解對蝦ATG基因在免疫防御中的功能作用，為揭示對蝦相關(guān)疾病的分子機理及制定科學防治措施提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】自噬是一種復(fù)雜的分解代謝過程（Mauthe and Reggiori，2016），多種因素均可激發(fā)自噬（Suares et al.，2021）。在炎癥性疾病中，自噬扮演著十分重要的角色，不僅影響細胞抗原的提呈，還影響細胞炎癥反應(yīng)、凋亡和能量代謝等過程（Zheng et al.，2019）。自噬在細胞代謝中也發(fā)揮不可替代的作用，包括清除受損的細胞器（Glick et al.，2010）、影響細胞分化及預(yù)防基因組受損等，而這些功能可有效防止多種疾病發(fā)生（Glick etal.，2010；Onorati etal.，2018；Levine and Kroemer，2019）。在一定情況下，自噬還能促進細胞凋亡（ParzychandKlionsky，2014）。自噬存在3種以上的不同形式，包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬等。其中，巨自噬是具有細胞核的細胞維持自身營養(yǎng)穩(wěn)定狀態(tài)和細胞器質(zhì)量穩(wěn)定的一種機制（Li et al.，2017）。近年來，自噬的潛在治療價值已逐漸被人們發(fā)現(xiàn)，目前上市的多種藥物都被證實具有相關(guān)自噬活性（Mizushima and Levine，2020），如二甲基延胡索酸具有調(diào)節(jié)自噬的作用。ATG基因家族約有20個成員（Nishimura and Tooze，2020），均與核心自噬相關(guān)，且大部分ATG基因都是溶酶體與自噬體融合的必需基因。ATG5～ATG12基因在細菌或病毒刺激下顯著上調(diào)，從而參與機體抗病原感染的過程（Yuan et al.，2022）。ATG13基因具有抗病毒的活性，且其表達水平能被病毒感染激活（Ma etal.，2020）。ATG13基因缺陷小鼠（Mus musculus）表現(xiàn)出心肌生長減緩和身體生長緩慢（Kaizuka and Mizushima，2016）；ATG13基因敲降或過表達均對自噬產(chǎn)生抑制效果，在自噬過程中發(fā)揮重要作用（Li etal.，2020；Zhou et al.，2021）。【本研究切入點】至今，有關(guān)ATG13基因的研究主要涉及人類（Qi et al.，2015）、小鼠（Kaizuka and Mizushima，2016）及擬南芥（Qi et al.，2020），在甲殼動物中僅見于日本沼蝦（Macrobrachiumnipponense）（孫盛明等，2021），因此開展凡納濱對蝦ATG13基因克隆及其功能研究，有助于明確ATG基因在甲殼動物抗病原感染過程中的作用機制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆凡納濱對蝦ATG13基因并進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR檢測凡納濱對蝦ATG13基因的組織表達特征及其在外源刺激后的表達變化，為探究ATG13基因在凡納濱對蝦抗病原感染過程中的作用機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試凡納濱對蝦購自廣東省湛江市東風水產(chǎn)品市場，平均體質(zhì)量6.1±0.3 g。選取健康、活力旺盛的凡納濱對蝦，置于500 L養(yǎng)蝦桶中暫養(yǎng)1周，每天投喂3次。暫養(yǎng)期間連續(xù)充氣增氧，養(yǎng)殖用水鹽度為3.0‰，pH約8.0，水溫控制在28.0℃。動物試驗經(jīng)廣東省水生動物疾病控制與健康培養(yǎng)重點實驗室倫理委員會審查批準。

1.2 RNA提取及cDNA合成

選擇健康的凡納濱對蝦，解剖采集其肝胰腺、肌肉、中腸、血細胞、腦、心臟和鰓等組織樣品，液氮速凍保存?zhèn)溆?。采用TransZol試劑盒（ER501-01-V2，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）在無RNA酶條件下提取凡納濱對蝦總RNA，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將凝膠電泳檢測合格的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3凡納濱對蝦ATG13基因克隆與測序

根據(jù)NCBI已公布的凡納濱對蝦ATG13基因（XM_027375959.1）開放閱讀框（ORF）序列設(shè)計引物（表1）（雷易果等，2020），以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系20.0μL：rTaq DNA聚合酶（RR001Q）10.0μL，cDNA模板1.0μL，ATG13-F和ATG13-R各1.0μL，無菌水7.0μL。擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，進行33個循環(huán)；72℃延伸5 min。目的基因以1%瓊脂凝膠電泳進行分離提純，切下目的基因條帶，用切膠回收試劑盒［B110092，生工生物工程（上海）股份有限公司］進行純化回收，連接至pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆菌液并送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序。

1.4生物信息學分析

通過NCBI（http：//blast.ncbi.nih.gov/Blast.cgi）完成氨基酸序列同源比對分析；采用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）進行蛋白理化性質(zhì)分析；運用Softberry（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=psiteamp;group=programsamp;subgroup=proloc）預(yù)測氨基酸序列中功能位點的分布情況；使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測ATG13蛋白信號肽；利用InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan）預(yù)測蛋白功能結(jié)構(gòu)域；采用MEGA 5.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，置信值設(shè)為1000次。

1.5組織表達特征分析

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板、qATG13-F和qATG13-R（表1）為引物、EF1a為內(nèi)參基因，通過實時熒光定量PCR檢測ATG13基因在凡納濱對蝦肝胰腺、肌肉、鰓、中腸、血細胞、心臟、腦和皮膚等組織中的表達情況，每組設(shè)3個平行。按照PerfectStart?Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）試劑盒說明進行操作，擴增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，進行40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算ATG13基因的相對表達量（范嗣剛等，2022）。

1.6外源刺激后凡納濱對蝦ATG13基因表達檢驗

選取健康、活力旺盛的凡納濱對蝦進行哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）人工感染試驗，隨機分成2組，每組30尾（設(shè)3個平行）。其中，哈維氏弧菌感染組在對蝦腹部肌肉注射100μL哈維氏弧菌懸液（1×106 CFU/mL），對照組注射等體積PBS。分別在攻毒前（0 h）及攻毒后6、12、24、48、72 h采集凡納濱對蝦的鰓、中腸和肝胰腺，提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。同時開展Poly（I：C）刺激試驗，以Poly（I：C）于腹部肌肉注射刺激凡納濱對蝦，共30尾（設(shè)3個平行），以注射等體積PBS為對照組。分別在攻毒前（0 h）及攻毒后6、12、24、48、72 h采集凡納濱對蝦的鰓、中腸和肝胰腺，提取其總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，按照PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒說明進行實時熒光定量PCR檢測。

1.7統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan?s多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1凡納濱對蝦ATG13基因克隆及測序分析結(jié)果克隆獲得的凡納濱對蝦ATG13基因cDNA片段長2132 bp，其ORF為1431 bp（圖1），共編碼476個氨基酸殘基。凡納濱對蝦ATG13蛋白相對分子量為52.4 kD，理論等電點（pI）為5.40，總平均親水性系數(shù)（GRAVY）為-0.548，屬于疏水性蛋白。Softberry預(yù)測發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦ATG13氨基酸序列含有1個cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點、10個蛋白激酶C磷酸化位點、9個酪蛋白激酶II磷酸化位點及9個N-端豆蔻?；稽c（圖1）。SMART預(yù)測結(jié)果（圖2）表明，凡納濱對蝦ATG13蛋白不存在信號肽。InterProScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對蝦ATG13蛋白N末端存在1個ATG13功能域（第94～167位氨基酸處）。

2.2 ATG13氨基酸序列同源比對分析及系統(tǒng)發(fā)育進化樹

由圖3可知，凡納濱對蝦ATG13氨基酸序列與節(jié)肢動物的ATG13氨基酸序列相似性較高，尤其與果蠅（Drosophila melanogaster）的序列相似性高達97%，說明ATG13的保守性較強?；贏TG13氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4）顯示，凡納濱對蝦與意大利蜜蜂（Apis mellifera）、光點小火蟻（Wasmannniaauropunctata）、褐飛虱（Nilapar-vatalugens）、茶翅蝽（Halyomorphahalys）、光肩星天牛（Anoplophoraglabripennis）及果蠅聚為一支，尤其與果蠅的親緣關(guān)系最近；而人類（Homo sapiens）、小家鼠（Mus musculus）、大西洋鮭魚（Salmo salar）和斑馬魚（Danio rerio）聚為另一支，與凡納濱對蝦的親緣關(guān)系相對較遠。

2.3凡納濱對蝦ATG13基因的組織表達分布情況

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖5）顯示，ATG13基因在凡納濱對蝦肝胰腺、肌肉、鰓、中腸、血細胞、心臟、腦和皮膚等組織中均有表達，尤其以肝胰腺中的相對表達量最高，其次是肌肉和中腸，在皮膚和血細胞中的相對表達量較低?？梢姡布{濱對蝦ATG13基因的表達具有組織差異性。

2.4哈維氏弧菌感染后凡納濱對蝦ATG13基因的表達變化

與對照組相比，哈維氏弧菌攻毒后24h，凡納濱對蝦肝胰腺中的ATG13基因相對表達量達最高值，且明顯高于其他時段的相對表達量，至攻毒后48和72 h，其相對表達量呈下調(diào)趨勢（圖6-A）；在凡納濱對蝦中腸中，ATG13基因的相對表達量在哈維氏弧菌攻毒后6 h開始顯著上升（Plt;0.05，下同），至攻毒后48h極顯著上升到最高值（Plt;0.01，下同），此后呈快速下調(diào)趨勢，其相對表達量極顯著低于對照組（圖6-B）；在凡納濱對蝦鰓組織中，ATG13基因相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢，于攻毒后24h達最高值，顯著高于對照組的相對表達量，攻毒后48和72 h的相對表達量呈下降趨勢，但仍極顯著高于對照組（圖6-C）。

2.5 Poly（I：C）刺激后凡納濱對蝦ATG13基因的表達變化

與對照組相比，經(jīng)Poly（I：C）刺激后凡納濱對蝦ATG13基因在肝胰腺、中腸和鰓組織中的相對表達量均有明顯變化（圖7）。在凡納濱對蝦肝胰腺中，ATG13基因的相對表達量在攻毒后6 h極顯著上調(diào)24.0倍，并在攻毒后12 h達最高值（圖7-A），隨后呈下調(diào)趨勢，但其相對表達量仍極顯著高于對照組；在凡納濱對蝦中腸中，ATG13基因的表達在攻毒后6～12 h呈極顯著上調(diào)趨勢，其相對表達量在攻毒后12h達最高值，隨后呈下調(diào)趨勢，至攻毒后72h的相對表達量極顯著低于對照組（圖7-B）；在凡納濱對蝦鰓組織中，ATG13基因的相對表達量于攻毒后6 h出現(xiàn)第1個峰值，是對照組的5.5倍，之后呈下調(diào)表達，但在攻毒后24 h其相對表達量達最高值，較對照組極顯著上調(diào)7.0倍，攻毒后72h的相對表達量顯著低于對照組（圖7-C）。

3討論

ATG13與機體的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)（Yuan et al.，2022），但目前有關(guān)甲殼類動物ATG13基因的研究相對較少。本研究根據(jù)NCBI已公布的凡納濱對蝦ATG13基因（XM_027375959.1）ORF序列設(shè)計引物，擴增得到的凡納濱對蝦ATG13基因ORF序列長1431bp，共編碼476個氨基酸殘基。凡納濱對蝦ATG13氨基酸序列與果蠅ATG13氨基酸序列的相似性高達97%，基于ATG13氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示凡納濱對蝦與果蠅的親緣關(guān)系最近，說明凡納濱對蝦ATG13基因較保守，其潛在功能可能與果蠅的相似。ATG13基因在凡納濱對蝦肝胰腺、肌肉、鰓、中腸、血細胞、心臟、腦和皮膚等組織中均有不同程度的表達，以肝胰腺中的相對表達量最高，其次是肌肉和中腸，在皮膚和血細胞中的相對表達量較低，與褐飛虱中腸ATG13基因相對表達量較高的結(jié)論（吳建艮等，2022）一致。肝胰腺作為對蝦的消化腺，也是重要的免疫和代謝器官，ATG13基因在凡納濱對蝦肝胰腺中高表達。凡納濱對蝦肌肉中的ATG13基因相對表達量較高，可能是由于對蝦的肌肉代謝較快，而細胞更新離不開自噬作用（Mizushima and Levine，2020）；ATG13基因在凡納濱對蝦鰓組織中高表達，可能是鰓組織直接與外界接觸，極易遭受海水中大量細菌與碎屑的刺激，引起鰓損傷，而鰓組織要保持正常的呼吸功能就會通過自噬以修復(fù)損傷的細胞結(jié)構(gòu)，同時清除進入細胞內(nèi)的病原體（Venclovas，2012；F?lfan et al.，2017）?；虻慕M織分布特征和表達水平與不同組織在機體中行使的功能密切相關(guān)（郭慧等，2023）。凡納濱對蝦肝胰腺、腸道、肌肉及鰓組織中的ATG13基因表達差異，正是由于各組織在機體中行使的功能不同，肝胰腺和腸道作為重要的免疫器官，積極參與機體免疫反應(yīng)，因此ATG13基因的相對表達量較高。

弧菌對凡納濱對蝦具有很大的危害（李君怡等，2020），可引起凡納濱對蝦發(fā)生弧菌相關(guān)疾病，如哈維氏弧菌會引起凡納濱對蝦腸道組織損傷（樊英等，2018），進而破壞對蝦的免疫防御系統(tǒng)等（夏青等，2015）。Poly（I：C）是一種人工合成的雙鏈RNA，作為病毒核酸類似物可模擬病毒感染過程，在水產(chǎn)動物病害免疫防控研究中常用作免疫刺激劑（Dai et al.，2021）。經(jīng)Poly（I：C）刺激后，凡納濱對蝦肝胰腺、中腸和鰓組織中的ATG13基因相對表達量整體上均呈先上升后下降的變化趨勢，且在刺激后12或24h達最高值，與日本沼蝦肝胰腺中ATG13基因在低氧脅迫6和24 h后其相對表達量顯著高于對照組的結(jié)論（雷易果等，2020）相似。此外，褚吉興等（2018）研究表明，經(jīng)WSSV刺激后凡納濱對蝦鰓和肝胰腺中的ATG6基因表達發(fā)生顯著變化，表明自噬基因家族在外源刺激下均發(fā)生上調(diào)表達；尹文娟等（2021）研究證實，受WSSV刺激后凡納濱對蝦血細胞中的ATG3基因相對表達量呈先下降后上升的變化趨勢；魏威等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）受碳酸鹽堿度脅迫12h后，其鰓組織中的ATG5基因相對表達量是對照組的2.77倍。可見，經(jīng)病原感染等外源刺激后凡納濱對蝦發(fā)生氧化應(yīng)激，需上調(diào)自噬基因表達以調(diào)控機體清除受損的細胞器和維持細胞穩(wěn)態(tài)。

4結(jié)論

受哈維氏弧菌或Poly（I：C）等外源刺激后，凡納濱對蝦通過上調(diào)自噬相關(guān)基因ATG13表達以調(diào)控機體清除受損的細胞器和維持細胞穩(wěn)態(tài)，即ATG13基因參與凡納濱對蝦抗病原感染的響應(yīng)過程。

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（責任編輯蘭宗寶）