摘要：【目的】明確引起烏原鯉（Procyprismerus）發(fā)病死亡的病原菌，分析其毒力基因，為烏原鯉養(yǎng)殖中的病害診斷及有效防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā繌幕疾踉幐闻K和腎臟中分離病原菌，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列分析對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，通過人工回歸感染試驗(yàn)確定分離菌株的致病性，使用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并對(duì)18種毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)?！窘Y(jié)果】從患病烏原鯉肝臟和腎臟中分離純化到1株革蘭氏陰性短桿菌（命名為19042401），經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定和16S rDNA序列分析，確定菌株19042401為維氏氣單胞菌（Aeromo-nasveronii）；人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株對(duì)烏原鯉具有較強(qiáng)的致病性，半數(shù)致死量（LD50）為5.75×107 CFU/kg；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在19種常見抗生素中，菌株19042401對(duì)卡那霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素等6種藥物敏感，對(duì)鏈霉素、羅紅霉素、慶大霉素等7種藥物中度敏感，對(duì)青霉素、恩諾沙星、阿莫西林等6種藥物耐藥；毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果表明，菌株19042401攜帶Act、Aer、GcaT、Acg、OmpAI、Alt、Fla、Exu、Ser和AhyB共10種毒力基因?！窘Y(jié)論】維氏氣單胞菌是引起此次烏原鯉發(fā)病的致病菌，攜帶10種毒力基因，對(duì)烏原鯉具有較強(qiáng)的致病性，僅對(duì)少數(shù)藥物敏感，對(duì)多種常用抗

生素具有不同程度的耐藥性，養(yǎng)殖生產(chǎn)中可選用多西環(huán)素進(jìn)行治療。

關(guān)鍵詞：烏原鯉；維氏氣單胞菌；分離鑒定；毒力基因

中圖分類號(hào)：S941.42文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2024）05-1520-10

Identification and virulence gene analysis of pathogenic Aeromonas veronii isolated from Procyprismerus

WU Wei-jun1，TAN Hong-lian1，HAN Yao-quan1，YANG Ming-wei2，DENG Dong-ming3，CHEN Jing1，WEI Xin-xian1*，TONG Gui-xiang1*

（1Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture，Nanning，Guangxi 530021，China；2Guangxi Aquatic and Animal Husbandry School，Nanning，Guangxi 530021，China；3Datang Agricultural and Rural Comprehensive Service Center of Lipu，Guilin，Guangxi 546604，China）

Abstract：【Objective】The pathogen causing Procyprismerus disease and death was identified，and its virulence genes were analyzed to provide theoretical basis for disease diagnosis and effective prevention in future P.merus culture.【Method】Pathogenic bacteria were isolated from the liver and kidney of diseased P.merus，and the isolated strains wereidentified by morphological observation，physiological and biochemical characteristics identification and 16S rDNA se-quenceanalysis.The pathogenicity of the isolated strain was determined by artificial regression infection test，and the drug sensitivity test was carried out by disk diffusion method，and 18 virulence genes were detected by PCR.【Result】A Gram negative short bacillus（named 19042401）was isolated and purified from the liver and kidney of diseased P.merus.After morphological observation，physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis，it wasidentified as Aeromonas veronii.The results of artificial regression infection showed that the strain had strong pathoge-nicity，with a lethal dose（LD50）of 5.75×107 CFU/kg.The results of drug sensitivity test showed that among 19 kinds of common antibiotics，strain 19042401 was sensitive to 6 drugs such as kanamycin，azithromycin and doxycycline，mode-rately sensitive to 7 drugs such as streptomycin，roxithromycin and gentamicin，and resistant to 6 drugs such as penicil-lin，enrofloxacin and amoxicillin.The results of the virulence gene PCR indicated that strain 19042401 carried 10 viru-lence genes，including Act，Aer，GcaT，Acg，OmpAI，Alt，F(xiàn)la，Exu，Ser and AhyB.【Conclusion】A.veronii was the pathogenic bacterium causing the disease of P.merus，which has strong pathogenicity and carries 10 virulence genes.It is only sensitive to a few drugs and has different degrees of resistance to many commonly used antibiotics.Doxycycline can be used for treatment in aquaculture production.

Key words：Procyprismerus；Aeromonas veronii；isolation and identification；virulence gene

Foundation items：Guangxi Key Research and Development Plan Project（Guike AB21220017）；Guangxi Agricul-tural Science and Technology Self-financing Project（Z2022189，Z2022209）；Open Fund of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture（GXKEYLA-JY202404）

0引言

【研究意義】烏原鯉（Procyprismerus）又名烏鉤、烏鯉、墨鯉、黑鯉、烏鯽，隸屬于鯉形目（Cyprini-formes）鯉科（Cyprinidae）原鯉屬（Procypris），僅分布于珠江流域西江水系部分干支流，其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，曾是廣西較常見的魚類（韓耀全等，2018）。20世紀(jì)90年代以來，隨著廣西江河水電站的梯級(jí)建設(shè)、筑壩攔截，造成江河阻隔、河流渠化嚴(yán)重，連同過度捕撈、水質(zhì)污染等因素，導(dǎo)致自然魚類資源急劇減少，烏原鯉瀕臨滅絕，目前僅在龍江上游、北盤江下游有少量分布，被《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書》列為瀕危物種（樂佩琦和陳宜瑜，1998），并于2021年被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》列為二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。盡管烏原鯉人工繁殖已取得一定成效，但其在養(yǎng)殖過程中仍存在性成熟時(shí)間長(zhǎng)、繁殖力不強(qiáng)、病害較多等問題。因此，開展烏原鯉病害防治相關(guān)研究對(duì)其自然漁業(yè)資源恢復(fù)和養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來，已從草魚（Ctenopharyngodonidella）（黃浦江等，2021）、鯉（Cyprinus carpio）（裴立碩等，2023）、鯽（Carassius auratus）（齊燕玲等，2023）等鯉科魚類中分離到維氏氣單胞菌（Aeromo-nasveronii），該菌隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），是一種可感染人、畜、魚的條件性致病菌，魚類感染后常見癥狀為鰭條、尾柄及腸道出血，皮膚潰爛，肝臟腫大和腹水等（韓璐璐等，2022；呂圓圓等，2023）。此外，還從患病的斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）（田浪等，2018）、草龜（Chine-mysreevesii）（王苗等，2020）、大口黑鱸（Micropterus salmoides）（楊超等，2021）、鱖（Sinipercachuatsi）（鄧汝森等，2022）、烏鱧（Channa argus）（王曉磊等，2022）、羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）（彭鑫等，2023）、克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）（湯環(huán)宇等，2023）、黃顙魚（Pelteobagrusfulvidraco）（王潤(rùn)萍等，2023）、黃喉擬水龜（Mauremysmutica）（周晗等，2023）、雜交鱘（Acipenser baerii♀×Acipenser schrenckii♂）（Zhu et al.，2023）等多種水產(chǎn)動(dòng)物中分離到維氏氣單胞菌，且均具有較強(qiáng)致病性。維氏氣單胞菌毒力因子主要包括氣溶素、溶血素、腸毒素、脂多糖、外膜蛋白、鞭毛、分泌系統(tǒng)及部分黏附因子等，其致病性是多種因素共同作用的結(jié)果，與一種或多種毒力基因表達(dá)有關(guān)（宋明芳等，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】2019年4月廣西南寧市蘇立魚苗場(chǎng)發(fā)生烏原鯉傳染病，病魚主要癥狀為爛鰓、離群獨(dú)游，發(fā)病初期尾柄發(fā)白，隨后尾鰭被侵蝕呈殘缺不齊狀；隨著病程發(fā)展，病魚尾柄充血發(fā)紅、皮膚肌肉潰爛，嚴(yán)重時(shí)骨骼外露甚至斷尾，陸續(xù)死亡；剖檢病魚主要病變部位，發(fā)現(xiàn)肝臟顏色變?yōu)闇\黃色、腸道少量出血。目前，未見有維氏氣單胞菌感染烏原鯉導(dǎo)致發(fā)病的報(bào)道，關(guān)于烏原鯉的研究主要集中在生長(zhǎng)繁育方面（徐華建等，2021；李娟等，2023），針對(duì)其病害防治的相關(guān)研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從患病烏原鯉肝臟和腎臟中分離病原菌，采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列分析對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，通過人工回歸感染試驗(yàn)確定分離菌株的致病性，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和毒力基因PCR檢測(cè)。明確引起烏原鯉發(fā)病死亡的病原菌，為烏原鯉養(yǎng)殖中的病害診斷及有效防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

患病烏原鯉采集自廣西南寧市蘇立魚苗場(chǎng)，體質(zhì)量約60～80 g；健康烏原鯉由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水養(yǎng)殖基地提供，平均體質(zhì)量50±5 g。血瓊脂培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2×F8 FastLong PCR MasterMix、細(xì)菌DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京艾德萊生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：ECLIPSE Ci-S顯微鏡（日本Nikon公司）、VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國(guó)bioMérieux公司）、ProFlex PCR儀（美國(guó)ABI公司）。動(dòng)物試驗(yàn)由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)EAE-GXIF-2019-P001。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌分離純化用75%酒精對(duì)患病烏原鯉進(jìn)行體表消毒，無菌條件下從肝臟和腎臟取樣劃線接種于血液營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)24h；挑取單菌落再次劃線培養(yǎng)，重復(fù)3次，獲得純化菌株，命名為19042401，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性鑒定

將分離菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，并進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。根據(jù)革蘭氏染色特征（革蘭氏陰性短桿菌）選擇相應(yīng)菌種鑒定卡（GN鑒定卡），在試管內(nèi)加入3.0 mL生理鹽水，用一次性無菌接種環(huán)挑取菌落置于試管中混勻，調(diào)節(jié)菌懸液至麥?zhǔn)蠞岫?.50～0.63，將菌懸液注入GN鑒定卡后放入VITEK 2 Compact系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。

1.2.3病原菌分子生物學(xué)鑒定將分離菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集菌液，使用細(xì)菌DNA抽提試劑盒提取總DNA，采用Weisburg等（1991）報(bào)道的引物fD1（5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'）和rP2（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT T-3'）擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50μL：2×F8 FastLong PCR MasterMix 25μL，上、下游引物（20 mmol/L）各2μL，模板DNA 5μL，滅菌水補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃10 s，55℃15 s，72℃10 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1500 bp，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將分離菌株的16S rDNA序列于GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用MEGA 5.05基于16S rDNA序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4人工回歸感染試驗(yàn)為確認(rèn)分離菌株的致病性，用體質(zhì)量相近的健康烏原鯉進(jìn)行人工回歸感染試驗(yàn)。取純化的菌株19042401接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)18h，用無菌生理鹽水洗下菌苔制成菌懸液，采用平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)節(jié)濃度分別為9×108、9×107、9×106、9×105、9×104 CFU/mL。將健康烏原鯉分為6組，每組20尾，設(shè)1～5組為感染組，每尾分別注射相應(yīng)濃度菌液0.2 mL，對(duì)照組每尾注射無菌生理鹽水0.2 mL，連續(xù)觀察7 d，記錄魚的發(fā)病和死亡情況，剖檢病死魚并從肝臟和腎臟取樣進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定，采用改良寇氏法（顧兵等，2009）計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.5藥敏試驗(yàn)將新鮮培養(yǎng)的菌落用生理鹽水調(diào)節(jié)成麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的菌懸液，涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；采用紙片擴(kuò)散法，將青霉素、鏈霉素、羅紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿奇霉素、多黏菌素B、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢拉定、頭孢哌酮/舒巴坦、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、氨芐西林、復(fù)方新諾明等19種藥敏紙片貼于涂布菌液后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，28℃培養(yǎng)24h后測(cè)量各藥物的抑菌圈直徑大小，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行結(jié)果分析。從敏感藥物中選擇適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的抗生素對(duì)發(fā)病烏原鯉進(jìn)行治療，驗(yàn)證其效果。

1.2.6毒力基因檢測(cè)為進(jìn)一步了解分離菌株的毒力，對(duì)已報(bào)道的維氏氣單胞菌18種毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)內(nèi)膜組分（TypeⅢsecretion system inner membrane component）基因Acsv、ADP-核糖基化毒素（ADP-ribosylation toxin）基因AexT、細(xì)胞毒性腸毒素（Cytotoxic enterotoxin）基因Act、氣溶素（Aerolysin）基因Aer、甘油磷酸酯膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（Glycerophospholipid cholesterol acyltransferase）基因GcaT、膠原酶（Collagenase）基因Acg、外膜蛋白（Outer membrane protein）基因OmpAI、絲氨酸蛋白酶（Serine protease）基因Ser和Ahp、溶血素（Haemolysin）基因Hly、熱穩(wěn)定性腸毒素（Heat-stable enterotoxin）基因Ast、熱不穩(wěn)定性腸毒素（Heat-labile enterotoxin）基因Alt、鞭毛（Flagellin）基因Fla、核酶（DNases）基因Exu、彈性蛋白酶（Elastase）基因AhyB、脂酶（Lipase）基因Lip、鞭毛蛋白（Flagellar protein）基因lafA、熱敏感蛋白酶（Temperature-sensitive protease）基因eprCAI，各毒力基因引物信息見表1。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌分離鑒定結(jié)果

2.1.1分離菌形態(tài)特征從患病烏原鯉肝臟和腎臟中分離到1株細(xì)菌，命名為19042401，該菌在血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，形成灰白色、圓形的較大菌落，呈β溶血（圖1-A）；經(jīng)涂片、革蘭氏染色后鏡檢，鑒定為革蘭氏陰性短桿菌（圖1-B）。

2.1.2生理生化鑒定結(jié)果使用VITEK 2 Com-pact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株19042401進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示為維氏氣單胞菌，Probability為97%。菌株19042401生理生化特性鑒定結(jié)果如表2所示，該菌株能利用D-葡萄糖、蔗糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-麥芽糖和七葉苷等，與鳥氨酸脫羧酶、H2S、D-山梨醇等反應(yīng)呈陰性，與氣單胞菌屬細(xì)菌特性相似（陸承平和劉永杰，2021）。

2.1.3分子生物學(xué)鑒定結(jié)果菌株19042401的16SrDNA經(jīng)雙向測(cè)序，結(jié)果顯示序列長(zhǎng)度為1430bp。將其序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與草魚（KY767498.1、MW116759.1）、大口黑鱸（OQ283655.1）、克氏原螯蝦（MT975235.1）等水生動(dòng)物源維氏氣單胞菌的16S rDNA序列相似性均在99%以上（圖2）；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該菌株與維氏氣單胞菌KY767498.1、OQ283655.1和OQ210048.1菌株聚為一支（圖3），親緣關(guān)系最近。結(jié)合菌株19042401的形態(tài)特征、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定菌株19042401為維氏氣單胞菌。

2.2人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

為確認(rèn)菌株19042401的致病性，用其感染健康烏原鯉。結(jié)果顯示，烏原鯉感染24h后開始出現(xiàn)死亡，發(fā)病魚主要癥狀表現(xiàn)為攝食減少，眼眶周圍出血、眼球外突，肛門紅腫，鰭條出血（圖4-A）；剖檢病死魚，可見腹腔有較多淡紅色積液（圖4-B），肝顏色變淺，腸黏膜出血（圖4-C），肝臟和腸道粘連（圖4-D），與自然發(fā)病烏原鯉癥狀相似。各感染組死亡率如表3所示，隨著菌液濃度的升高，累計(jì)死亡尾數(shù)呈增多趨勢(shì)，1～5組累計(jì)死亡率分別為100%、70%、50%、10%、0，而對(duì)照組無死亡；經(jīng)計(jì)算，菌株19042401對(duì)烏原鯉的LD50為5.75×107 CFU/kg。對(duì)人工感染的發(fā)病烏原鯉進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，獲得與菌株19042401形態(tài)特征一致的單一優(yōu)勢(shì)菌，因此確定菌株19042401是引起此次烏原鯉發(fā)病的病原菌。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果

菌株19042401對(duì)19種常見抗生素的敏感性如表4所示，該菌對(duì)卡那霉素、阿奇霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦、氧氟沙星6種藥物敏感，對(duì)鏈霉素、羅紅霉素、慶大霉素、多黏菌素B、頭孢拉定、諾氟沙星、環(huán)丙沙星7種藥物中度敏感，對(duì)青霉素、恩諾沙星、阿莫西林、阿莫西林/棒酸、氨芐西林、復(fù)方新諾明6種藥物耐藥，具有多重耐藥性。從敏感藥物中選擇水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物可用的多西環(huán)素對(duì)發(fā)病烏原鯉進(jìn)行治療，病魚逐漸康復(fù)，表明其具有良好的治療效果。

2.4毒力基因檢測(cè)結(jié)果

對(duì)菌株19042401進(jìn)行18種維氏氣單胞菌毒力基因PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，可檢測(cè)到Act、Aer、GcaT、Acg、OmpAI、Alt、Fla、Exu、Ser和AhyB共10種毒力基因，而其余8種毒力基因Acsv、AexT、Ahp、Hly、Ast、Lip、lafA和eprCAI未檢測(cè)到。

3討論

維氏氣單胞菌在自然界中廣泛分布，是可感染多種動(dòng)物的條件性致病菌，多種養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物均有感染發(fā)病報(bào)道，魚類感染后常出現(xiàn)鰭條及腸道出血、皮膚潰爛、肝臟腫大和腹水等癥狀。本研究采集到發(fā)病烏原鯉，主要癥狀為鰓、尾鰭和皮膚潰爛，從其肝臟和腎臟中分離到1株革蘭氏陰性短桿菌，命名為19042401，其生理生化特性與氣單胞菌屬細(xì)菌特性相似（陸承平和劉永杰，2021），且與其他魚源維氏氣單胞菌生理生化特性基本一致（裴立碩等，2023；齊燕玲等，2023）。菌株19042401的16S rDNA序列與草魚、大口黑鱸、克氏原螯蝦等水生動(dòng)物源維氏氣單胞菌的16S rDNA序列相似性均在99%以上；在基于16S rDNA序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，菌株19042401與維氏氣單胞菌聚為一支，綜上所述，確定菌株19042401為維氏氣單胞菌?；貧w感染試驗(yàn)結(jié)果表明菌株19042401是引起此次烏原鯉發(fā)病的病原菌，其對(duì)烏原鯉的LD50為5.75×107 CFU/kg，根據(jù)Santos等（1988）的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，菌株19042401對(duì)烏原鯉具有中等毒力。

維氏氣單胞菌致病性的強(qiáng)弱與外毒素、胞外蛋白酶和各種黏附因子等多種毒力因子的表達(dá)、分泌相關(guān)（宋明芳等，2018）。本研究對(duì)菌株19042401進(jìn)行維氏氣單胞菌毒力基因PCR檢測(cè)，可檢測(cè)到細(xì)胞毒性腸毒素基因Act、氣溶素基因Aer、甘油磷酸酯膽固醇?；D(zhuǎn)移酶基因GcaT、膠原酶基因Acg、外膜蛋白基因OmpAI、熱不穩(wěn)定性腸毒素基因Alt、鞭毛基因Fla、核酶基因Exu、絲氨酸蛋白酶基因Ser、彈性蛋白酶基因AhyB共10種毒力基因，結(jié)合回歸感染試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步說明菌株19042401具有較強(qiáng)的致病性。氣溶素是維氏氣單胞菌攜帶率最高的毒力因子，具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性，低濃度即可破壞宿主的細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞凋亡（Buckley，1991；Li etal.，2020），其表達(dá)水平與細(xì)菌毒力呈正相關(guān)（Yang et al.，2021）；而腸毒素包括細(xì)胞毒性腸毒素、熱穩(wěn)定性腸毒素和熱不穩(wěn)定性腸毒素，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡（Krzyminska et al.，2012），其中細(xì)胞毒性腸毒素具有溶血活性、細(xì)胞毒性和腸毒性；外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的主要組成成分，OmpAI缺失會(huì)降低細(xì)菌的黏附活性，其致病率也隨之降低（Namba etal.，2008）；同時(shí)，F(xiàn)la缺失的菌株致病性也會(huì)減弱（蔡金雙等，2020）。此外，氣單胞菌能產(chǎn)生多種蛋白酶，多數(shù)蛋白酶可間接參與機(jī)體的致病過程，其中胞外蛋白酶是重要的致病因子，包括脂酶、酪蛋白酶、淀粉酶、熱敏感蛋白酶和卵磷脂酶及菌株19042401攜帶的核酶、絲氨酸蛋白酶和彈性蛋白酶等。相關(guān)研究表明，致病性維氏氣單胞菌攜帶多個(gè)毒力基因的現(xiàn)象較普遍，克氏原螯蝦源維氏氣單胞菌攜帶Aer、Act和fla共3個(gè)毒力基因（胡騫，2020），鱖源維氏氣單胞菌攜帶Aer、Alt、Fla、Exu、Ser、AhyB和Lip共7個(gè)毒力基因（鄧汝森等，2022），羅氏沼蝦源維氏氣單胞菌攜帶Acsv、AexT、Act、Aer、GcaT、Acg和OmpAI共7個(gè)毒力基因（彭鑫等，2023），但多種毒力基因的攜帶與維氏氣單胞菌毒力間的關(guān)系及毒力基因相互作用的致病機(jī)理仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

目前，使用抗生素仍是治療細(xì)菌性疾病的主要手段，而藥敏試驗(yàn)可為抗生素的臨床合理使用提供重要參考。本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株19042401僅對(duì)多西環(huán)素等少數(shù)藥物敏感，對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等多種常用抗生素具有不同程度的耐藥性，與其他蟹源（周慧華等，2019）、蝦源（彭鑫等，2023；湯環(huán)宇等，2023）、魚源（趙良煒等，2023；張晶晶，2023）維氏氣單胞菌的藥敏特性有較大差異，差異原因可能與寄主來源、地域和時(shí)期不同有關(guān)。本研究根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用多西環(huán)素對(duì)發(fā)病烏原鯉進(jìn)行治療，取得較好治療效果。因此，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病，根據(jù)病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇合法合規(guī)的敏感藥物進(jìn)行防治，不僅更易取得良好的防治效果，且能避免濫用藥物導(dǎo)致的藥物浪費(fèi)、水產(chǎn)品藥物殘留、耐藥菌株產(chǎn)生及環(huán)境污染等問題。

4結(jié)論

維氏氣單胞菌是引起此次烏原鯉發(fā)病的致病菌，攜帶10種毒力基因，對(duì)烏原鯉具有較強(qiáng)的致病性，僅對(duì)少數(shù)藥物敏感，對(duì)多種常用抗生素具有不同程度的耐藥性，養(yǎng)殖生產(chǎn)中可選用多西環(huán)素進(jìn)行治療。

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（責(zé)任編輯劉可丹）