劉榮++申剛

摘要 為有效防治薏苡黑穗病，提高薏苡的質(zhì)量和產(chǎn)量，通過(guò)抽樣調(diào)查薏苡黑穗病的發(fā)病情況，并采用組織分離法分離得到薏苡黑穗病病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)描述、ITS序列比對(duì)分析該菌。結(jié)果表明：薏苡不同品種（系）之間的感病情況存在差異，同一品種在不同區(qū)域的耐病性也不盡相同。此外，結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)方法鑒定得到該病原菌為薏苡黑粉菌。

關(guān)鍵詞 薏苡黑穗病；發(fā)病情況；病原菌；分離鑒定；貴州地區(qū)

中圖分類號(hào) S412 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）22-0102-02

Abstract For controlling job′s-tears smut，improving the quality and yield of Coix lacryma-jobi L.，surveyed morbidity of job′s-tears smut，obtained job′s-tears smut by tissue separation，and analyzed the bacteria in combiation with morphological description，ITS sequence alignment.The results showed that occurrence situation of job′s-tears was different among different varieties （or lines） of Coix lacryma-jobi L.，the same varieties in different regions also had different diseased resistance.In addition，we identified the pathogen of job′s-tears was Ustilago coicis Brefeld combined with morphological characteristics with molecular biology methods.

Key words job′s-tears smut；morbidity；pathogenic bacteria；identification；Guizhou Area

薏苡（Coix lacryma-jobi L.），又名藥玉米，屬于禾本科（Poaceae）薏苡屬（Coix）。薏苡作為一種藥食兼用作物，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被譽(yù)為“世界禾本科植物之王”[1]。雖然國(guó)發(fā)[2012]2號(hào)文件已將薏苡列為貴州特色發(fā)展的主要作物之一，但是貴州地區(qū)常年雨量充沛，時(shí)空分布不均，3個(gè)多雨區(qū)之一位于省之西南部，降雨日數(shù)較多，相對(duì)濕度較大。而水分是影響薏苡黑粉菌厚垣孢子萌發(fā)的主要因素之一[2]。薏苡在種植過(guò)程中易感染薏苡黑穗病，嚴(yán)重制約著薏苡的產(chǎn)量和品質(zhì)。薏苡黑穗病是由薏苡黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起，病原屬于擔(dān)子菌亞門；該病易感染，分布廣，在大多數(shù)國(guó)家均有報(bào)道[3-4]。據(jù)1957年、1958年進(jìn)行的田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)薏苡黑穗病危害十分嚴(yán)重，大田的平均病株率達(dá)80%～100%，病癭率達(dá)50%以上[5]。隨著薏苡感病雜交種的推廣，連作薏苡的增加，薏苡黑穗病害不斷蔓延、加重，以致薏苡產(chǎn)量喪失嚴(yán)重。因此，筆者就貴州地區(qū)薏苡同一品種不同生育期以及不同品種間黑穗病進(jìn)行調(diào)查分析，并將薏苡黑穗病病原菌進(jìn)行分類鑒定，旨在摸清薏苡種植區(qū)病情發(fā)生情況，為該地區(qū)的薏苡黑穗病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 薏苡黑穗病發(fā)生情況調(diào)查

供試材料為Y83、Y160、Y164，共3個(gè)品種（系）；各品種（系）的基本信息如表1所示。

調(diào)查時(shí)間為2014年5—10月及2015年5—10月；調(diào)查地點(diǎn)位于貴州省興義市、興仁縣、貞豐縣、晴隆縣，以主栽區(qū)興仁縣為主。選擇歷年薏苡黑穗病發(fā)病較重的種植區(qū)進(jìn)行調(diào)查。采用對(duì)角線5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)10株，每個(gè)品種4個(gè)重復(fù)，調(diào)查薏苡黑穗病發(fā)病率和嚴(yán)重度。

1.2 薏苡黑穗病病原菌的分離鑒定

病原菌的分離采用組織分離法及單孢分離法。病原菌的形態(tài)鑒定參考《中國(guó)真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”描述進(jìn)行。病原菌的分子鑒定運(yùn)用通用引物ITSl（5′-TCCGTA-GGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′）一對(duì)引物進(jìn)行病原菌的ITS（internal transcribed spacer）序列的擴(kuò)增，連接轉(zhuǎn)化后對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行克隆測(cè)序；利用軟件DNAStar的MegAlign程序和NCBI上的Blastn程序進(jìn)行序列比對(duì)分析。 儀器與試劑：BX51型顯微鏡（OL-YMPUS）、XD-1型二氧化碳臨界點(diǎn)干燥器（Eiko公司）、IB-3型離子鍍金儀（Eiko公司）、JSM-6390LV掃描電鏡（JEOL公司）；葡萄糖、瓊脂粉、3%戊二醛、乙醇、乙酸異戊脂等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種（系）薏苡黑穗病發(fā)生情況

薏苡黑穗病主要感染薏苡的莖、葉、穗。由表2可知，薏苡在種植過(guò)程中感染黑穗病的情況較嚴(yán)重，且不同品種（系）之間的感病情況存在差異。從調(diào)查的3個(gè)品種（系）來(lái)看，Y83的病株率較其他2個(gè)品種高，Y160的發(fā)病率大于Y164的發(fā)病率。以調(diào)查地點(diǎn)為依據(jù)，不同地區(qū)的感病性也不盡相同，3個(gè)品種抗黑穗病能力在興仁縣均較弱，Y83和Y160在興義市的發(fā)病率相對(duì)要低些，而Y164在晴隆縣的耐病性較高。從而可以推斷，Y164的抗病能力強(qiáng)于Y160和Y83，而Y83的抗病能力最弱。

2.2 薏苡黑穗病病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定。通過(guò)分離得到薏苡黑穗病病原菌后，將其接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察。圖1為病原菌培養(yǎng)15 d后的菌落形態(tài)，可以看出：菌落直徑約為5.82 cm，菌落中央皺褶凸起、邊緣整齊，表面呈白色、反面淡黃色。顯微形態(tài)觀察：成熟的黑粉孢子近球形或卵圓形，7.45～11.00 μm×7.5～10.5 μm，有刺。通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：刺間有小疣。以上形態(tài)觀察描述與《中國(guó)真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”的薏苡黑粉菌的形態(tài)特征一致，初步斷定該病原菌為薏苡黑粉菌。

2.2.2 分子鑒定。根據(jù)形態(tài)鑒定的結(jié)果，選取3個(gè)典型菌株，并采用CTAB法提取其基因組DNA。以基因組DNA為模板，ITSl和 ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約600 bp的片段（圖2），克隆測(cè)序后分析顯示：3株菌株的擴(kuò)增序列一致，將其ITS序列在NCBI（national center for biotechnology information）上進(jìn)行Blastn（核苷酸序列比對(duì)）同源性分析發(fā)現(xiàn)：該序列與Ustilago coicis（JX219371.1）的ITS 1 5.8S 核糖體RNA基因相似性最高，達(dá)99%（圖3）。進(jìn)一步證實(shí)薏苡病原菌為薏苡黑粉菌。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)Y83、Y160、Y164 3個(gè)品種在不同區(qū)域耐黑穗病能力進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示Y83抗黑穗病能力最弱，Y160次之；同時(shí)調(diào)查同一品種在不同區(qū)域的耐病性，不同地區(qū)的感病性也不盡相同，不同品種（系）在興仁縣的發(fā)病率都相對(duì)較高。由此可以推斷：薏苡不同品種在同一地區(qū)感染黑穗病的發(fā)生情況存在差異；因貴州地區(qū)特殊的氣候條件，薏苡同一品種在不同區(qū)域耐黑穗病能力不同。而且黔西南屬于貴州省三大多雨區(qū)之一，降雨日數(shù)較多，相對(duì)濕度較大，這種溫濕度適宜孢子萌發(fā)生長(zhǎng)。因此，在選擇薏苡種植品種時(shí)，不僅要重視薏苡的品質(zhì)、產(chǎn)量，還要考慮品種的抗病能力。

對(duì)分離得到的黑穗病病原菌進(jìn)行形態(tài)和分子的綜合鑒定，觀察得到3個(gè)菌株的形態(tài)特征和測(cè)序結(jié)果一致。1940年，Mundkur[6]對(duì)植物黑穗病調(diào)查研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)薏苡黑粉菌，并命名為C.lacryma-jobi Mundkur。而Chowdhury[7]提出的觀點(diǎn)與Mundkur存在分歧，他在研究過(guò)程中把此菌與Ustilago coicis同義進(jìn)行報(bào)道。后來(lái)，Zhang等[8]對(duì)該菌的超顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析后得出：該菌與Ustilago trichophora親緣關(guān)系最近，達(dá)84%。但筆者將研究結(jié)果同《中國(guó)真菌志》第十二卷的“黑粉菌科”比較以及對(duì)序列比對(duì)分析，初步斷定該病原菌為薏苡黑粉菌。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 楊繼祥.藥用植物栽培學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1993：284-292.

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[5] 李彥勇，鄭茂源.薏苡黑穗病[J].植物保護(hù)，1964（6）：13.

[6] MUNDKUR B B.A second contribution towards a knowledge of Indian Ustilaginales：Fragments xxvi-l.[J].Trans Br Mycol Soc，1940，24（3/4）：312-336.

[7] CHOWDHURY S.Some studies on the smut Ustilago coicis Bref.of Job′s tears millet[J].J.Indian Bot，Soc，1946（25）：123-130.

[8] ZHANG J Z，GUAN P G，TAO G，et al.Ultrastructure and phylogeny of Ustilago coicis[J].Journal of Zhejiang University SCIENCE B，2013，14（4）：336-345.