doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2024.05.012

收稿日期：2023-06-13

基金項(xiàng)目：中國(guó)科學(xué)院國(guó)際伙伴計(jì)劃項(xiàng)目（161343KYSB20200015）

作者簡(jiǎn)介：羅志斌（1999-），男，湖南婁底人，碩士研究生，從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。（E-mail）1851375407@qq.com

通訊作者：焦金真，（E-mail）jjz@isa.ac.cn

摘要：" 為了探究呼倫貝爾羊瘤胃體外發(fā)酵體系對(duì)過瘤胃蛋氨酸（RPMet，由玉米淀粉和棕櫚油包被）的生物利用率及過瘤胃蛋氨酸對(duì)瘤胃微生物類群的影響，取4只裝有瘺管的雌性呼倫貝爾羊的瘤胃液進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)，在發(fā)酵起始階段與發(fā)酵后2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h測(cè)定發(fā)酵體系中的RPMet降解率。每個(gè)發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)設(shè)置5個(gè)平行處理，在以上7個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)取發(fā)酵液并進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析。結(jié)果表明，在體外發(fā)酵體系中，RPMet在發(fā)酵后8 h的降解率小于30.0%，說明該產(chǎn)品的包被效果較好。測(cè)序結(jié)果顯示，發(fā)酵24 h后的Simpson指數(shù)顯著低于發(fā)酵12 h后的Simpson指數(shù)（Plt;0.05）。主坐標(biāo)分析（PCoA）能夠顯示物種的β-多樣性，本研究結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)的聚類結(jié)果皆存在顯著差異（Plt;0.05）。擬桿菌門、瘤胃球菌屬、普雷沃氏菌屬菌的相對(duì)豐度在發(fā)酵后8 h內(nèi)顯著上升，發(fā)酵12 h后顯著下降（Plt;0.05）。厚壁菌門、廣古菌門、甲烷桿菌屬、解琥珀酸菌屬、顫螺菌屬菌的相對(duì)豐度在發(fā)酵后12 h內(nèi)顯著下降，之后顯著上升（Plt;0.05）。綜上所述，研究中所用的RPMet的包被效果較好，且發(fā)酵前期主要是普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬微生物降解玉米淀粉包被層，而RPMet的過度降解顯著提高了甲烷桿菌屬微生物的相對(duì)豐度。

關(guān)鍵詞：" 過瘤胃蛋氨酸；綿羊；體外發(fā)酵；16S rDNA；微生物

中圖分類號(hào)：" S852.23""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A""" 文章編號(hào)：" 1000-4440（2024）05-0874-07

Evaluation for bioavailability of rumen protected methionine and its effects on rumen microorganisms in Hulun Buir sheep by in vitro fermentation

LUO Zhibin1，2，" OU Huimin1，2，" LI Jianzhong2，" TAN Zhiliang1，" JIAO Jinzhen1

（1.Institute of Subtropical Agriculture， Chinese Academy of Sciences/Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region/National Engineering Laboratory for Poultry Breeding Pollution Control and Resource Technology/Hunan Key Laboratory of Animal Nutritional Physiology and Metabolic Process， Changsha 410125， China;2.College of Life Sciences， Hunan Normal University/Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation， Changsha 410081， China）

Abstract：" The purpose of this study was to investigate the bioavailability of rumen-protected methionine （RPMet， coated with corn starch and palm oil） in the rumen in vitro fermentation system of Hulun Buir sheep and the effects of rumen-protected methionine on rumen microbial groups. The rumen fluids of four female Hulun Buir sheep with fistulas were taken for in vitro fermentation test. The degradation rate of RPMet in the fermentation system was determined at the initial stage of fermentation and 2 h， 4 h， 6 h， 8 h， 12 h and 24 h after fermentation. Five parallel treatments were set up at each fermentation time node， and the fermentation broth was taken at the above seven time nodes for 16S rDNA sequencing analysis. The results showed that the degradation rate of RPMet was less than 30.0% at 8 h after fermentation in the in vitro fermentation system， indicating that the coating effect of the product was good. The sequencing results showed that the Simpson index at 24 h after fermentation was significantly lower than that at 12 h after fermentation （Plt;0.05）. Principal coordinate analysis （PCoA） could show the β-diversity of species. The results of this study showed that there were significant differences in the clustering results at each time point （Plt;0.05）. The relative abundance of Bacteroidetes， Ruminococcus and Prevotella increased significantly within 8 h after fermentation， and decreased significantly after 12 h of fermentation （Plt;0.05）. The relative abundance of Firmicutes， Euryarchaeota， Methanobrevibacter， Succiniclasticum and Oscillibacter decreased significantly within 12 h after fermentation， and then increased significantly （Plt;0.05）. In summary， the coating effect of the RPMet product is good. The Prevotella and Ruminococcus act as main genera to degrade the coating layer of corn starch during the early fermentation period， while excessive degradation of RPMet significantly increase the abundance of Methanobrevibacter.

Key words：" rumen protected methionine;sheep;in vitro fermentation;16S rDNA；microorganism

對(duì)反芻動(dòng)物而言，氨基酸是其重要的營(yíng)養(yǎng)來源之一，然而在實(shí)際生產(chǎn)中，大部分氨基酸在反芻動(dòng)物瘤胃中就會(huì)被微生物分解利用，只有少量到達(dá)小腸并被機(jī)體吸收利用。在反芻動(dòng)物后腸段，氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)其新陳代謝、繁衍生殖、機(jī)體免疫等生理活動(dòng)都起著重要的支撐作用。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，通常會(huì)對(duì)氨基酸進(jìn)行包被，使大部分氨基酸通過反芻動(dòng)物瘤胃時(shí)不被降解。蛋氨酸是反芻動(dòng)物機(jī)體內(nèi)不可或缺的甲基供體，與細(xì)胞的信號(hào)傳遞、核酸和蛋白質(zhì)的合成等多項(xiàng)生理反應(yīng)過程有密切關(guān)聯(lián)。蛋氨酸是反芻動(dòng)物所需的主要限制性氨基酸之一，對(duì)反芻動(dòng)物的正常生理活動(dòng)及機(jī)體的免疫、健康等有關(guān)鍵作用。近年來，過瘤胃蛋氨酸（RPMet）在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，在肉羊飼糧中補(bǔ)充1頭8.0 g/d的RPMet，對(duì)肉羊生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率有顯著改善效果。在泌乳肉牛的日糧中添加1頭9.5 g/d的RPMet，可改善犢牛的表觀纖維消化率和飼料利用效率，加快新生牛犢的生長(zhǎng)速度。在奶牛飼糧中組合添加1頭25.0 g/d的RPMet和1頭30.0 g/d的過瘤胃賴氨酸（RPLys），可以提高奶牛乳中的乳脂率、乳蛋白含量，減少乳中的體細(xì)胞數(shù)。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，在黔北麻羊的低蛋白飼糧中添加占飼糧質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%或0.4%的RPMet，不會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育、血液免疫指標(biāo)及瘤胃的發(fā)酵狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響。引起上述研究結(jié)果不一致的原因主要有以下幾個(gè)方面：（1）RPMet的包被方式及生物利用率不一樣；（2）RPMet的添加量不一樣；（3）動(dòng)物的日齡、日糧及個(gè)體存在差異。

有研究發(fā)現(xiàn)，在可降解蛋白質(zhì)、可發(fā)酵碳水化合物適當(dāng)平衡的飼糧水平下，盡管只有10%的RPMet在奶牛瘤胃中釋放，但仍會(huì)提高產(chǎn)前奶牛瘤胃胃液中溶糊精琥珀酸弧菌（Succinivibrio dextrinosolvens）、解淀粉琥珀酸單胞菌（Succinimonas amylolytica）及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobacter succinogenes）的相對(duì)豐度，說明瘤胃微生物可能對(duì)RPMet的精準(zhǔn)釋放起到重要作用。遺憾的是，關(guān)于瘤胃消化RPMet過程中微生物類群的變化尚不清楚。因此，本研究擬以呼倫貝爾羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用體外發(fā)酵法評(píng)估瘤胃對(duì)RPMet的生物利用率，并探究RPMet對(duì)瘤胃微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)與多樣性的影響，旨在為RPMet在呼倫貝爾羊中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

過瘤胃蛋氨酸，購自杭州康德權(quán)飼料有限公司，外層由玉米淀粉、棕櫚油包被（玉米淀粉含量gt;80%），蛋氨酸含量≥75%，水分含量≤5%。從4只裝有瘺管的雌性呼倫貝爾羊的瘤胃中取得瘤胃內(nèi)容物，將內(nèi)容物用6層紗布進(jìn)行過濾，得到瘤胃液。

1.2" 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

以體重相近為原則，選取4只體重為（30.0±2.0） kg的成年雌性呼倫貝爾羊進(jìn)行試驗(yàn)，每只試驗(yàn)羊都安裝有穩(wěn)定的瘤胃瘺管，為體外發(fā)酵提供瘤胃液。在試驗(yàn)過程中，每只羊單籠飼養(yǎng)且可自由飲水。飼糧包括粗飼料和精飼料，其中粗飼料為稻草，精飼料由47.00%玉米粉、24.00%豆粕、22.00%麥麩、4.00%預(yù)混料、2.23%石粉和0.77%食鹽組成，飼糧的精粗比為1∶1（重量比）。飼糧的營(yíng)養(yǎng)水平（計(jì)算值）如下：干物質(zhì)（DM）含量85.61%，代謝能（ME）7.15 MJ/kg，粗蛋白（CP）含量12.13%，中性洗滌纖維（NDF）含量41.64%，酸性洗滌纖維（ADF）含量27.92%，粗脂肪（EE）含量2.00%，鈣（Ca）含量0.77%，磷（P）含量0.32%。在試驗(yàn)期內(nèi)，每天分別于08：00、17：00進(jìn)行飼喂，每次各投喂精料、粗料150 g（干物質(zhì)基礎(chǔ)）。

1.3" 體外發(fā)酵

參考Menke等的方法制備3 000 ml人工瘤胃緩沖液，不斷向配制好的溶液中輸入純CO2以保證其處于無氧狀態(tài)，將水浴鍋溫度設(shè)置為39.5 ℃，使人工瘤胃緩沖液保持恒溫。在試驗(yàn)羊進(jìn)食前，通過瘺管取得瘤胃內(nèi)容物，用6層脫脂紗布擠壓內(nèi)容物并過濾，得到1 000 ml瘤胃液，將其與無氧、恒溫的人工瘤胃緩沖液混勻，即獲得體外發(fā)酵所需的人工瘤胃培養(yǎng)液。參照Wang等的方法，稱取2 g左右過瘤胃蛋氨酸樣品放入發(fā)酵瓶中，并加入50 ml瘤胃培養(yǎng)液，即得1個(gè)發(fā)酵體系。將發(fā)酵液于39.5 ℃搖床恒溫水浴箱中分別發(fā)酵2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h，每個(gè)發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)設(shè)置5個(gè)平行發(fā)酵體系。在每個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)（包括起始階段），搖勻發(fā)酵瓶并吸取2 ml發(fā)酵液至離心管中，于-80 ℃保存以備后續(xù)測(cè)定16S rDNA。借助真空泵，用蒸餾水對(duì)發(fā)酵體系進(jìn)行洗滌抽濾，將發(fā)酵剩余產(chǎn)物在65 ℃烘干24 h，并測(cè)定氨基酸含量。

1.4" RPMet生物降解率的測(cè)定

稱取0.2 g左右的發(fā)酵剩余產(chǎn)物，加入1 ml 6.00 mol/L鹽酸，通過勻漿機(jī)將發(fā)酵剩余的過瘤胃氨基酸顆粒充分混勻粉碎，隨后將混合物轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，加純水至刻度線定容并充分混勻，再取100 μl定容后的溶液與900 μl 0.06 mol/L鹽酸混勻，過0.22 μm孔徑的濾膜后注入測(cè)定瓶中。使用全自動(dòng)氨基酸分析儀（日立公司產(chǎn)品，型號(hào)為L(zhǎng)8900）對(duì)待測(cè)液進(jìn)行檢測(cè)，樣液用離子交換柱吸附后分離，再與茚三酮溶液進(jìn)行反應(yīng)，用分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行測(cè)定，以比色法計(jì)算樣液中氨基酸的含量。參照以下公式計(jì)算瘤胃中RPMet的降解率：

X=×100%

式中：X為發(fā)酵剩余產(chǎn)物中的氨基酸含量，g/kg；C為處理后待測(cè)液中的氨基酸含量，ng/μl；50表示處理后待測(cè)液中的氨基酸含量，ng/ml；F為處理后待測(cè)液的稀釋倍數(shù)；V為水解后定容體積，ml；M為發(fā)酵剩余產(chǎn)物的重量，g；109表示將氨基酸含量的單位由ng換算成g的系數(shù)；1 000表示將氨基酸含量的單位由g換算成kg的系數(shù)；A為過瘤胃蛋氨酸中起始的蛋氨酸含量，g/kg。

1.5" 瘤胃微生物多樣性及組成分析

1.5.1" 瘤胃微生物DNA的提取" 取各體外發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)結(jié)束后的發(fā)酵液2 ml，用DNA試劑盒（購自張家口賽諾生物科技有限公司）提取發(fā)酵液中的總DNA。制備2%瓊脂糖凝膠，在電泳儀中對(duì)提取的DNA進(jìn)行電泳，檢測(cè)DNA的可用性。

1.5.2" 擴(kuò)增子測(cè)序" DNA樣品PCR操作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行，從而對(duì)DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增純化，后續(xù)再進(jìn)行Miseq文庫的構(gòu)建，并完成對(duì)純凈PCR產(chǎn)物的測(cè)序。使用特定引物（上游引物：3′-CCTAYGGGRBGCASCAG-5′，下游引物：3′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-5′，其中R=A/G，S=G/C，Y=C/T，B=G/C/T，N=A/G/C/T）對(duì)擴(kuò)增子16S rRNA區(qū)域的基因V3amp;V4進(jìn)行目標(biāo)序列的擴(kuò)增。采用德國(guó)（Qiagen）的Qiagen凝膠提取試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)生的混合產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化。構(gòu)建測(cè)序DNA文庫所用的試劑盒為美國(guó)Illumina庫的TruSeqDNAPCR試劑盒，在創(chuàng)建文庫的同時(shí)完成索引代碼的編輯。測(cè)序文庫的檢測(cè)用Qubit2.0熒光計(jì)（ThermoScientific）完成，并使用安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化操作。用IlluminaNovaSeq平臺(tái)對(duì)通過質(zhì)檢的文庫進(jìn)行測(cè)序，最終獲得250 bp配對(duì)的末端讀碼。

1.5.3" 微生物多樣性及組成分析" 去除下機(jī)的原始讀數(shù)的標(biāo)簽序列（Barcode）和引物序列并進(jìn)行質(zhì)量控制，得到可用于后續(xù)分析的有效序列，用FLASH軟件拼接兩端測(cè)序數(shù)據(jù)。用USEARCH軟件中的Unoise3方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，隨后對(duì)序列進(jìn)行去噪操作，設(shè)置參數(shù)相似度大于99%。得到特征序列（ASVs）后，將每條特征序列與Silva數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，可信閾值設(shè)置為0.8，從而完成對(duì)每條ASVs的微生物類別信息注釋。得到其在各個(gè)分類水平（界、門、綱、目、科和屬）的絕對(duì)豐度信息，再整理并生成相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果表。用R的vegan包的adonis函數(shù)對(duì)微生物群落的α多樣性、β多樣性進(jìn)行置換多元方差分析（PERMANOVA），使用的距離矩陣、置換檢驗(yàn)次數(shù)分別是Bray-curtis、999。

1.6" 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件統(tǒng)計(jì)體外發(fā)酵體系中呼倫貝爾羊瘤胃對(duì)RPMet的生物利用率并制成折線圖，α多樣性指數(shù)、β多樣性指數(shù)使用R的vegan包計(jì)算并制圖。用SPSS 27軟件對(duì)微生物門、屬水平的相對(duì)豐度進(jìn)行單因素方差分析，并用Excel 2021制圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 體外發(fā)酵條件下瘤胃對(duì)RPMet的消化率

如圖1所示，在呼倫貝爾羊瘤胃液進(jìn)行體外發(fā)酵的過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加RPMet逐漸被消化。發(fā)酵4 h、6 h、8 h，RPMet分別被消化12.6%、21.3%、29.4%。發(fā)酵24 h后，有70.0%的RPMet在體外發(fā)酵體系中被消化。

2.2" 體外發(fā)酵條件下瘤胃中微生物群落的α多樣性分析

如圖2所示，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、基于豐度的覆蓋率估計(jì)指數(shù)（ACE指數(shù)）在呼倫貝爾羊瘤胃液體外發(fā)酵的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)間均無顯著差異（Pgt;0.05）。而呼倫貝爾羊瘤胃液進(jìn)行體外發(fā)酵24 h的Simpson指數(shù)顯著高于發(fā)酵12 h的Simpson指數(shù)（Plt;0.05），其余時(shí)間點(diǎn)間的Simpson指數(shù)無顯著差異（Pgt;0.05）。

2.3" 體外發(fā)酵條件下瘤胃中微生物群落的β多樣性分析

基于Bray-Curtis距離矩陣的主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果（圖3）表明，在呼倫貝爾羊瘤胃液進(jìn)行體外發(fā)酵的過程中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都有其獨(dú)特的微生物組成。主坐標(biāo)分析1（PCoA1）和主坐標(biāo)分析2（PCoA2）分別可以解釋差異的31.49%和22.28%。在發(fā)酵起始階段至發(fā)酵后24 h間存在顯著的聚類差異（Plt;0.05），其中以發(fā)酵起始階段與發(fā)酵24 h間的聚類差異最大（Plt;0.05），但發(fā)酵6 h與發(fā)酵2 h、4 h、8 h間的聚類差異不顯著（Pgt;0.05）。

2.4" 體外發(fā)酵條件下門水平的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)分析

如圖4所示，在呼倫貝爾羊瘤胃液進(jìn)行體外發(fā)酵的過程中，擬桿菌門、厚壁菌門是優(yōu)勢(shì)菌門，二者相加的占比超過80.0%。擬桿菌門（Bacteroidetes）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為52.5%，至發(fā)酵8 h時(shí)，相對(duì)豐度顯著增加至57.7%（Plt;0.05），但之后相對(duì)豐度顯著降低（Plt;0.05）。厚壁菌門（Firmicutes）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為39.9%，至發(fā)酵6 h時(shí)，相對(duì)豐度顯著降至34.1%（Plt;0.05），之后相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。變形菌門（Proteobacteria）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為1.9%，至發(fā)酵6 h時(shí)，相對(duì)豐度顯著增加到2.9%（Plt;0.05），之后相對(duì)豐度降低?；ヰB(yǎng)菌門（Synergistetes）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為2.6%，至發(fā)酵2 h時(shí)，相對(duì)豐度顯著降低至1.9%（Plt;0.05），之后在發(fā)酵4 h時(shí)，相對(duì)豐度上升至2.5%并保持穩(wěn)定。廣古菌門（Euryarchaeota）在發(fā)酵后8 h內(nèi)的相對(duì)豐度相對(duì)穩(wěn)定，均低于1.0%，在發(fā)酵后12 h顯著上升了4倍，達(dá)2.0%，在發(fā)酵后24 h，相對(duì)豐度顯著增加了29倍，達(dá)13.2%（Plt;0.05）。未定名糖化菌門（Candidatus_Saccharibacteria）、螺旋體菌門（Spirochaetes）和綠彎菌門（Chloroflexi）的相對(duì)豐度均未超過0.5%，且在發(fā)酵過程中的變化不顯著（Pgt;0.05）。

2.5" 體外發(fā)酵條件下屬水平的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)分析

如圖5所示，普雷沃氏菌屬（Prevotella）、解琥珀酸菌屬的相對(duì)豐度較大，是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌屬。普雷沃氏菌屬在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為18.4%，至發(fā)酵6 h時(shí)，其相對(duì)豐度顯著提高到25.2%（Plt;0.05），之后呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵24 h時(shí)，其相對(duì)豐度顯著降低到12.3%（Plt;0.05）。解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為3.1%，至發(fā)酵4 h時(shí)顯著降低至2.7%（Plt;0.05），之后其相對(duì)豐度回升并與發(fā)酵起始階段相近且保持穩(wěn)定。甲烷桿菌屬（Methanobrevibacter）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為0.4%，在發(fā)酵2 h時(shí)下降到0.2%，但在發(fā)酵24 h時(shí)較發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度顯著增加了32倍，達(dá)到13.1%（Plt;0.05）。微動(dòng)桿菌屬（Fretibacterium）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為2.5%，在發(fā)酵2 h時(shí)顯著降低至1.8%（Plt;0.05），之后其相對(duì)豐度與發(fā)酵起始階段相近。丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為1.5%，在發(fā)酵8 h時(shí)顯著降低至1.0%（Plt;0.05）。瘤胃球菌屬（Ruminococcus）在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度為0.9%，至發(fā)酵6 h時(shí)，其相對(duì)豐度顯著提高至1.3%（Plt;0.05），之后回升并與發(fā)酵起始階段相近。巴恩斯氏菌屬（Barnesiella）、顫螺菌屬（Oscillibacter）及擬桿菌屬（Bacteroides）的相對(duì)豐度均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)（Plt;0.05）。

3" 討論與結(jié)論

3.1" 體外發(fā)酵條件下瘤胃中RPMet的降解率

在飼喂混合日糧的條件下，育肥羊的固相食糜在瘤胃中的流通率近1 h 7%，即在飼喂后8 h會(huì)有約50%的瘤胃食糜進(jìn)入后腸道。有研究發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)任何保護(hù)的蛋氨酸在進(jìn)入瘤胃后2～4 h將被瘤胃中的微生物完全降解。在本研究中，由玉米淀粉和棕櫚油包被的過瘤胃蛋氨酸在體外瘤胃液發(fā)酵體系中發(fā)酵4 h的降解率為12.6%，發(fā)酵8 h的降解率為29.4%，這與Rossi等的研究結(jié)果相近，說明該P(yáng)RMet能達(dá)到較好的過瘤胃效果。

3.2" 體外發(fā)酵條件下瘤胃中RPMet對(duì)發(fā)酵體系微生物多樣性的影響

α多樣性能夠反映微生物群落的豐富程度，其中Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)顯示微生物的豐度，二者與微生物豐度之間的關(guān)系為正相關(guān)；而Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)是評(píng)價(jià)微生物類群多樣性的指數(shù)，其中Simpson指數(shù)與微生物類群多樣性呈負(fù)相關(guān)，而Shannon指數(shù)與微生物類群多樣性呈正相關(guān)。在本研究中，體外發(fā)酵24 h的瘤胃中微生物菌群的Simpson指數(shù)顯著低于發(fā)酵12 h的，提示在發(fā)酵至24 h時(shí)，微生物多樣性顯著增加，這與李燁青等對(duì)奶牛瘤胃液體外發(fā)酵的研究結(jié)果相似。值得注意的是，β多樣性的分析結(jié)果表明，發(fā)酵開始后，在微生物附著RPMet并降解由玉米淀粉、棕櫚油構(gòu)成的包被層的過程中就出現(xiàn)顯著的聚類差異，說明發(fā)酵體系在降解包被材料時(shí)，微生物區(qū)系就已經(jīng)發(fā)生了改變，且在發(fā)酵后4～12 h繼續(xù)存在顯著差異，發(fā)酵24 h后的微生物菌群與其他各個(gè)時(shí)間段間均存在顯著差異。可能由于在發(fā)酵過程中不同時(shí)間段主要分解的底物不同。結(jié)合體外發(fā)酵的食物降解率及瘤胃內(nèi)食糜的流動(dòng)速率，可以初步將發(fā)酵過程分為3個(gè)階段：以降解玉米淀粉的包被物為主的發(fā)酵前期（發(fā)酵后8 h內(nèi)）、以降解由包被層轉(zhuǎn)為蛋氨酸為主的底物的發(fā)酵中期（9～11 h）和以降解蛋氨酸為主的發(fā)酵后期（發(fā)酵后12～24 h）。

3.3" 體外發(fā)酵條件下瘤胃中RPMet對(duì)發(fā)酵體系微生物組成的影響

對(duì)于體內(nèi)瘤胃和體外發(fā)酵體系而言，二者的微生物組成必然存在差異。在瘤胃體系中，飼糧通常是影響其微生物類群變化的主要因素。因此，本研究選擇無飼糧因素影響、相對(duì)穩(wěn)定且具有代表性的瘤胃液體外發(fā)酵體系進(jìn)行試驗(yàn)，旨在分析綿羊瘤胃中與RPMet精準(zhǔn)釋放相關(guān)的微生物類群。研究發(fā)現(xiàn)，在瘤胃液發(fā)酵體系中，擬桿菌門、厚壁菌門的相對(duì)豐度較大。在本研究中，擬桿菌門與厚壁菌門在發(fā)酵起始階段的相對(duì)豐度之和為92.4%，且在發(fā)酵起始階段普雷沃氏菌屬與解琥珀酸菌屬具有明顯的豐度優(yōu)勢(shì)，這與胡丹丹等對(duì)奶牛的研究結(jié)果相似。發(fā)酵前期的RPMet顆粒較為完整，由玉米淀粉和棕櫚油構(gòu)成的包被層仍能包裹蛋氨酸，因此此時(shí)主要降解包被層。擬桿菌門是瘤胃微生物降解非纖維性碳水化合物過程中占主導(dǎo)地位的菌門，因此其相對(duì)豐度在體外發(fā)酵過程中顯著提高。變形菌門具有較強(qiáng)的抗壓生長(zhǎng)能力，從而使其相對(duì)豐度在發(fā)酵前期仍能小幅提升。瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度在發(fā)酵前期有所提升，可能由于其有產(chǎn)生淀粉酶的能力，從而能分解利用包被層。普雷沃氏菌屬能高效降解蛋白質(zhì)，同時(shí)還能降解利用淀粉，因此可觀測(cè)到普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度在前期顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，解琥珀酸菌屬和顫螺菌屬在瘤胃內(nèi)以分解纖維素為主，因此認(rèn)為解琥珀酸菌屬、顫螺菌屬的相對(duì)豐度在發(fā)酵前期呈下降趨勢(shì)。由此推測(cè)，普雷沃氏菌屬和瘤胃球菌屬在RPMet的精準(zhǔn)釋放中發(fā)揮了重要作用。在發(fā)酵后期，RPMet顆粒呈細(xì)碎狀，包被層大部分被分解，此時(shí)主要的發(fā)酵底物是蛋氨酸。值得注意的是，甲烷桿菌屬的相對(duì)豐度在發(fā)酵后期顯著增加，與發(fā)酵起始階段相比增幅高達(dá)32倍，提示RPMet在瘤胃中的過度降解會(huì)促進(jìn)甲烷的排放。

4" 結(jié)論

過瘤胃蛋氨酸在發(fā)酵后6 h、8 h的體外降解率分別為21.3%、29.4%，包被效果較好。在降解RPMet的過程中，微生物多樣性和種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。在發(fā)酵前期主要是普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬菌降解玉米淀粉包被層，且RPMet的過度降解顯著提高了甲烷桿菌屬的相對(duì)豐度。

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（責(zé)任編輯：徐" 艷）