關(guān)鍵詞短頸劍線蟲(chóng)；寄主；無(wú)花果；形態(tài)特征；系統(tǒng)發(fā)育分析；鑒定

短頸劍線蟲(chóng)是一種寄生于植物根部的線蟲(chóng)，寄主廣泛、適應(yīng)力強(qiáng)，可危害羅漢松、雞蛋花、秋楓、大葉相思、羊蹄甲、冬青、棕櫚、咖啡、番茄、櫻桃、草莓、懸鉤子、柑橘、龍眼、蘋(píng)果、梨、腰果、石榴等。該線蟲(chóng)為外寄生線蟲(chóng)，通過(guò)直接取食為害植物根系，造成植物根部組織變黑、皮層增厚、側(cè)根增生，影響根系長(zhǎng)勢(shì)，甚至造成根部腫大或壞死，同時(shí)它能傳播檢疫性病毒——番茄環(huán)斑病毒（tomato ringspot virus，ToRSV）。短頸劍線蟲(chóng)不僅可以寄生植物，有記載表明該線蟲(chóng)還可以在人體寄生并造成嚴(yán)重的腹痛、腹瀉。短頸劍線蟲(chóng)主要分布于歐洲、美洲、亞洲部分國(guó)家和地區(qū)，通過(guò)帶根苗木、土壤及栽培介質(zhì)傳播擴(kuò)散，為我國(guó)重要的檢疫性線蟲(chóng)。目前尚無(wú)公開(kāi)文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)花果為該線蟲(chóng)自然寄主。

1961年，Lordello等在巴西咖啡樹(shù)根際首次發(fā)現(xiàn)短頸劍線蟲(chóng)，并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行了較為簡(jiǎn)單的描述；隨著劍線蟲(chóng)屬內(nèi)有效種數(shù)量逐漸增多，該線蟲(chóng)原始種群的形態(tài)學(xué)描述已不足以對(duì)其進(jìn)行有效區(qū)分；Lamberti等于1991年對(duì)短頸劍線蟲(chóng)巴西咖啡種群進(jìn)行了更為詳細(xì)的描述。2011年，Sakai等首次在日本千葉縣冬青上發(fā)現(xiàn)短頸劍線蟲(chóng)，2012年趙立榮等在日本進(jìn)境羅漢松中檢出短頸劍線蟲(chóng)。2023年5月，青島海關(guān)從日本進(jìn)境無(wú)花果苗中分離獲得一種劍線蟲(chóng)，通過(guò)形態(tài)特征觀察和測(cè)計(jì)，并對(duì)18S rDNA、ITSI、28S-D2D3、線粒體coxI基因進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析，鑒定為短頸劍線蟲(chóng)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1樣品的采集和線蟲(chóng)的分離

采集無(wú)花果苗根部及根際附著土壤，用改進(jìn)的貝爾曼漏斗法分離線蟲(chóng)。

1.2線蟲(chóng)形態(tài)鑒定

分離獲得的線蟲(chóng)經(jīng)60～62℃水浴處理2～3min殺死后，用FG固定液固定。采用甘油一乙醇快速脫水法對(duì)線蟲(chóng)脫水，將脫水線蟲(chóng)挑人甘油滴中，用石蠟封片，做成永久玻片。在光學(xué)顯微鏡（Zeiss Imager M2）下進(jìn)行形態(tài)觀察、拍照（Zeiss AxioCam 506 color CCDcamera）及測(cè)量（Zeiss ZEN 2.3 blue edition）。采用De Man公式進(jìn)行形態(tài)特征測(cè)計(jì)。

1.3分子生物學(xué)鑒定

1.3.1線蟲(chóng)DNA提取

單條線蟲(chóng)DNA提取參照王江嶺等的方法并有所改進(jìn)。挑取單條線蟲(chóng)用適量無(wú)菌水清洗后，放入預(yù)先滴加了的PCR管中，加入4PCR緩沖液（Mg2+ free）后用滅菌的移液槍槍頭將蟲(chóng)體壓成段，于-70℃下冷凍30min以上，85℃加熱2min后加入2uL的蛋白酶K，混勻后置于PCR儀中56℃孵育2h，95℃ 10min，即獲得線蟲(chóng)DNA粗提液，可直接用于PCR擴(kuò)增，或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2靶標(biāo)片段擴(kuò)增和測(cè)序

使用1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，在120V的恒壓條件下電泳約30min，電泳結(jié)果在紫外凝膠成像儀下觀察并照相。將片段割膠純化、回收，連接到pESI-T載體后轉(zhuǎn)人大腸桿菌（DH5a）中培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3.3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

利用Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果的峰圖質(zhì)量進(jìn)行檢查，確保該序列可用于后續(xù)分析。下載Gen-Bank中相關(guān)線蟲(chóng)屬種的28S-D2/D3、ITSI、18S rD-NA以及coxI序列信息，用MAFFT v7. 505軟件進(jìn)行多序列聯(lián)配比對(duì)，去除前后端多余的引物序列后，即可得到用于后續(xù)系統(tǒng)進(jìn)化分析的序列比對(duì)文件。使用jModeITest V.2.1.7軟件中的Akaike information criterion（AIC）程序計(jì)算獲得序列比對(duì)文件的最佳核苷酸替換模型、各種核苷酸頻率、不變位點(diǎn)比例以及伽馬分布的形態(tài)參數(shù)等。使用MrBayes 3.2.7軟件，在貝葉斯框架下通過(guò)馬爾科夫鏈蒙特卡洛方法（MCMC）構(gòu)建最佳核苷酸替換模型下的50%多數(shù)原則一致性系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，用于后續(xù)的物種系統(tǒng)發(fā)育分析。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中顯示后驗(yàn)概率大于50%的進(jìn)化分支，本研究所獲得的新序列在進(jìn)化樹(shù)中均用粗體表示。

2結(jié)果與分析

2.1短頸劍線蟲(chóng)的形態(tài)鑒定

本研究在分離到的劍線蟲(chóng)中選取發(fā)育成熟、特征清晰的10條線蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)特征描述和測(cè)計(jì)。

雌蟲(chóng)形態(tài)特征：熱殺死后蟲(chóng)體向腹面彎曲呈開(kāi)螺旋“C”形，兩端漸細(xì)（圖1A）。唇區(qū)圓，縊縮明顯（圖1C），側(cè)器囊漏斗狀（圖1D）。齒尖針細(xì)長(zhǎng)、針狀、高度硬化，齒尖針基部呈叉狀，齒托基部呈顯著的凸緣狀；齒針導(dǎo)環(huán)為雙環(huán)，后環(huán)高度骨化，導(dǎo)環(huán)位于齒尖針后部靠近齒尖針與齒托相連接處（圖1B、1E）。生殖管對(duì)生，均發(fā)育完全，生殖管較短，卵巢先端回折（圖1F）。陰門(mén)位于蟲(chóng)體中部，橫裂，占陰門(mén)處體寬的1/3左右，子宮內(nèi)無(wú)特殊分化（圖1G）。尾短圓錐形，背面彎曲，腹面直，尾長(zhǎng)等于或略長(zhǎng)于肛門(mén)處體寬（圖1H）。

雄蟲(chóng)：未見(jiàn)。

短頸劍線蟲(chóng)形態(tài)測(cè)計(jì)值見(jiàn)表2。根據(jù)Lamberti等的多歧檢索表，短頸劍線蟲(chóng)主要鑒定特征為：唇區(qū)與體壁是否縊縮（代碼A）、體長(zhǎng)（代碼B）、齒尖針長(zhǎng)度（代碼C）、c'值（代碼D）、V值（代碼E）、a值（代碼F）、c值（代碼G）、體前端至基部導(dǎo)環(huán)距離（代碼H）、尾長(zhǎng)（代碼I）、尾末端形狀（代碼J），巴西咖啡種群的鑒定代碼依次為A2-B3/2-C3/2-DI-E2/3/1-F1-G2-H3-12/1-J2，日本冬青種群的鑒定代碼依次為A2-B2/3-C2-D1-E1/2-F1-G2-H2/3-I2/3-J2，截獲的日本無(wú)花果種群代碼依次為A2-B2-C2-D1/2-E1/2-F1-G2-H2/3-I1/2-J2。對(duì)比鑒定代碼發(fā)現(xiàn)，本研究種群的鑒定代碼與巴西咖啡種群、日本冬青種群基本一致。對(duì)比巴西咖啡種群，本研究種群在體長(zhǎng)、齒尖針長(zhǎng)度、V值、體前端至基部導(dǎo)環(huán)距離略小，但總體在覆蓋范圍內(nèi)，這可能是由于不同地區(qū)分布的種群間存在差異所致；對(duì)比日本冬青種群，除了齒尖針長(zhǎng)度略短之外，其他鑒定特征描述和測(cè)計(jì)值更為接近，初步判斷該日本無(wú)花果種群為短頸劍線蟲(chóng)。

2.2分子生物學(xué)特征

從短頸劍線蟲(chóng)的18S rDNA擴(kuò)增出1750 bp的片段（GenBank登錄號(hào)：OR267443、OR277456、OR277459）。在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，本研究獲得的序列與短頸劍線蟲(chóng)日本冬青種群（登錄號(hào)為AB604340）、巴西種群（登錄號(hào)為MH248799）、捷克種群（登錄號(hào)為HM163212）序列相似性為100%，與短頸劍線蟲(chóng)巴西種群（登錄號(hào)為AY297822）、（登錄號(hào)為AF036610）、（登錄號(hào)分別為AY297832、AM086674）、（登錄號(hào)為AY297835）序列相似性為99.54%～99.94%。序列相似性分析結(jié)果表明：本研究無(wú)花果種群與短頸劍線蟲(chóng)親緣關(guān)系相對(duì)較近，但與上述非短頸劍線蟲(chóng)種群差異并不明顯。從基于18SrDNA序列構(gòu)建的短頸劍線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）中可以看出：本研究無(wú)花果種群與短頸劍線蟲(chóng)2個(gè)巴西種群、捷克種群、日本種群聚類在1個(gè)單獨(dú)分支，后驗(yàn)概率值為95。

COXI區(qū)擴(kuò)增出441 bp的片段（GenBank登錄號(hào)：OR144368、OR742039、OR742053）。本研究獲得的序列與5個(gè)日本種群（登錄號(hào)分別為AB675672、AB675673、AB675669、AB604337、AB675670）序列相似性為91.60%～93. 64%，與彌散劍線蟲(chóng)澳大利亞種群（登錄號(hào)為AM086700）序列相似性為92.27%。序列相似性分析結(jié)果表示：本研究無(wú)花果種群與短頸劍線蟲(chóng)、彌散劍線蟲(chóng)親緣關(guān)系較近。從基于COXI序列構(gòu)建的短頸劍線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）中可以看出：本研究無(wú)花果種群與短頸劍線蟲(chóng)（5個(gè)日本種群）、彌散劍線蟲(chóng)（澳大利亞種群）聚類在1個(gè)單獨(dú)分支，后驗(yàn)概率值為100。

綜合形態(tài)學(xué)鑒定和分子特征分析結(jié)果，本研究中日本無(wú)花果線蟲(chóng)種群鑒定為短頸劍線蟲(chóng)。

3結(jié)論與討論

我國(guó)《進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》規(guī)定劍線蟲(chóng)屬（傳毒種類）為檢疫性線蟲(chóng)，其中包含短頸劍線蟲(chóng)等11種可傳播植物病毒的線蟲(chóng)。本研究采用形態(tài)學(xué)鑒定和18SrDNA、ITSI、28S-D2/D3、線粒體COXI基因擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析，在一定水平上展示了美洲劍線蟲(chóng)組內(nèi)各種群間的親緣關(guān)系。形態(tài)學(xué)測(cè)計(jì)結(jié)果表明，本研究種群與日本冬青種群更為接近，但二者在體長(zhǎng)、齒尖針長(zhǎng)度、V值、體前端至基部導(dǎo)環(huán)距離均略小于模式種群，這可能是由于地理分布差異造成的，其他形態(tài)特征均與模式種群的描述基本相符。綜合形態(tài)特征與系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，本研究中在無(wú)花果苗根際分離到的線蟲(chóng)為短頸劍線蟲(chóng)，并首次確認(rèn)了無(wú)花果為短頸劍線蟲(chóng)自然寄主。因此在進(jìn)境無(wú)花果苗檢疫時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注此類線蟲(chóng)的傳人風(fēng)險(xiǎn)。

劍線蟲(chóng)屬有效種數(shù)量多，種內(nèi)差異較小，鑒定特征有限且部分種形態(tài)測(cè)計(jì)值重疊，口岸檢疫鑒定難度較大，需要綜合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。Lazarova等認(rèn)為劍線蟲(chóng)屬內(nèi)18S rDNA和28S-D2/D3序列差異太小，難以區(qū)分短頸劍線蟲(chóng)及近似種，本研究序列相似性比對(duì)結(jié)果也印證了這一觀點(diǎn)，即18S rDNA和28S-D2/D3序列無(wú)法有效區(qū)分短頸劍線蟲(chóng)及其近似種。線粒體cox工序列分析可以較為準(zhǔn)確區(qū)分劍線蟲(chóng)屬內(nèi)各種，但該基因序列不夠豐富，需進(jìn)一步累積和完善。在口岸檢疫工作中，使用多種引物對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行物種鑒定的方法相對(duì)繁瑣和費(fèi)時(shí)，為提高檢疫時(shí)效性，針對(duì)劍線蟲(chóng)屬線蟲(chóng)的鑒定需要更加高效、靈敏、準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，這也是口岸檢疫鑒定中迫切需要解決的技術(shù)難題。