［摘要］ 目的

探討瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道6（TRPC6）對(duì)糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）小鼠腎小管間質(zhì)炎癥的影響及其機(jī)制。

方法 將6周齡雄性C57BL/6J小鼠36只隨機(jī)分為6組，每組6只。對(duì)照組（A組）和DKD組（B組）分別腹腔注射0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液和10 g/L鏈脲佐菌素（后簡(jiǎn)稱給藥）；DKD＋生理鹽水干預(yù)組（C組）和DKD＋線粒體自噬激活劑干預(yù)組（D組）在B組基礎(chǔ)上分別灌胃生理鹽水和10 mmol/L尿石素A；DKD＋陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染組（E組）和DKD＋TRPC6敲降慢病毒轉(zhuǎn)染組（F組）在B組基礎(chǔ)上分別尾靜脈注射陰性對(duì)照慢病毒和TRPC6敲降慢病毒。測(cè)定各組小鼠給藥后第12周時(shí)的全血空腹血糖（FBG）水平、尿微量白蛋白肌酐比（ACR）和血尿素氮（BUN）水平，PAS染色觀察小鼠腎小管損傷情況并進(jìn)行評(píng)分，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)小鼠腎組織中炎性因子（IL-1β、MCP-1、TNF-α）mRNA水平，免疫組織化學(xué)染色觀察小鼠腎組織中TRPC6蛋白表達(dá)水平，蛋白免疫印跡檢測(cè)小鼠腎組織中TRPC6、LC3B、P62、PINK1、Parkin相對(duì)表達(dá)量，透射電鏡觀察小鼠腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量變化。將HK-2細(xì)胞分為高糖＋TRPC6 siRNA＋DMSO干預(yù)組（G組，TRPC6 siRNA轉(zhuǎn)染＋35.0 mmol/L葡萄糖＋0.06%DMSO）和高糖＋TRPC6 siRNA＋線粒體自噬抑制劑干預(yù)組（H組，TRPC6 siRNA轉(zhuǎn)染＋35.0 mmol/L葡萄糖＋12 μmol/L千層紙素A），RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中炎性因子（IL-1β、MCP-1、TNF-α）mRNA的水平。

結(jié)果 給藥后第12周時(shí)，B組小鼠全血FBG水平、ACR、BUN水平、腎小管損傷評(píng)分、腎組織炎性因子mRNA水平及TRPC6、P62蛋白表達(dá)水平均顯著高于A組（t=2.77～13.61，P＜0.05），腎組織LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平顯著低于A組（t=3.33～14.63，P＜0.05），腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量減少；D組小鼠ACR、BUN水平、腎小管損傷評(píng)分、腎組織炎性因子mRNA水平及P62蛋白表達(dá)水平顯著低于C組（t=2.40～23.50，P＜0.05），腎組織LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平顯著高于C組（t=5.74～12.50，P＜0.05），腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量增多；F組小鼠ACR、BUN水平、腎小管損傷評(píng)分、腎組織炎性因子mRNA水平及TRPC6、P62蛋白表達(dá)水平均顯著低于E組（t=2.45～7.09，P＜0.05），腎組織LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及PINK1、Parkin蛋白表達(dá)水平顯著高于E組（t=7.91～13.18，P＜0.05），腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量增多；H組細(xì)胞的炎性因子mRNA水平顯著高于G組（t=5.40～7.27，P＜0.05）。

結(jié)論

TRPC6可通過(guò)上調(diào)自身表達(dá)，抑制腎小管細(xì)胞線粒體自噬，從而加重DKD小鼠的腎小管間質(zhì)炎癥。TRPC6抑制藥物有希望用于DKD治療。

［關(guān)鍵詞］ 糖尿病腎??；TRPC陽(yáng)離子通道；線粒體自噬；腎炎，間質(zhì)性；疾病模型，動(dòng)物；小鼠，近交C57BL

［中圖分類號(hào)］ R587.24；R692.33

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

Influence of transient receptor potential cation channel 6 on renal tubulointerstitial inflammation in mice with diabetic kidney disease and its mechanism

LIU Congcong， ZHANG Xingjian， DING Lin， ZHANG Yao， ZHANG Dongjie， MA Ruixia

（Department of Nephrology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the influence of transient receptor potential cation channel 6 （TRPC6） on renal tubulointerstitial inflammation in mice with diabetic kidney disease （DKD） and its mechanism.

Methods A total of 36 male C57/BL6J mice， aged 6 weeks， were randomly divided into control group （group A）， DKD model group （group B）， DKD+normal saline intervention group （group C）， DKD+mitophagy activator intervention group （group D）， DKD+negative control lentivirus transfection group （group E）， and DKD+TRPC6 knockdown lentivirus transfection group （group F）， with 6 mice in each group. The mice in groups A and B were respectively given intraperitoneal injection of 0.1 mmol/L citrate buffer and 10 g/L streptozotocin （hereinafter referred to as administration）; the mice in groups C and D were respectively given normal saline and 10 mmol/L urolithin A by gavage in addition to the treatment in group B; the mice in groups

E and F were respectively injected with negative control lentivirus and TRPC6 knockdown lentivirus via the tail vein in addition to the treatment in group B. The levels of fasting blood glucose （FBG）， urinary albumin-to-creatinine ratio （ACR）， and blood urea nitrogen （BUN） were measured at week 12 after administration; PAS staining was used for the observation and scoring of renal tubular injury; RT-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of inflammatory factors ［interleukin-1β （IL-1β）， monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α）］ in renal tissue; immunohistochemical staining was used to measure the protein expression level of TRPC6 in renal tissue， and Western blotting was used to measure the relative expression levels of TRPC6， LC3B， P62， PINK1， and Parkin in renal tissue; transmission electron microscopy was used to observe the change in the number of mitophagosomes in renal tubular cells of mice. HK-2 cells were divided into high glucose+TRPC6 siRNA transfection+DMSO intervention group （group G， treated with TRPC6 siRNA+35.0 mmol/L glucose+0.06% DMSO） and high glucose+TRPC6 siRNA transfection+mitophagy inhibitor intervention group （group H， treated with TRPC6 siRNA+35.0 mmol/L glucose+12 μmol/L oroxylin A）， and then RT-qPCR was used to measure the mRNA expression levels of inflammatory factors （IL-1β， MCP-1， and TNF-α） in cells.

Results At week 12 after administration， compared with group A， group B had significantly higher whole blood FBG， ACR， BUN， renal tubular injury score， mRNA expression levels of inflammatory factors， and protein expression levels of TRPC6 and P62 in renal tissue （t=2.77-13.61，Plt;0.05） and significantly lower protein expression levels of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ， PINK1， and Parkin in renal tissue （t=3.33-14.63，Plt;0.05）， with a reduction in the number of mitophagosomes in renal tubular cells. Compared with group C， group D had significantly lower levels of ACR and BUN， renal tubular injury score， mRNA expression levels of inflammatory factors， and protein expression level of P62 in renal tissue （t=2.40-23.50，Plt;0.05） and significantly higher protein expression levels of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ， PINK1， and Parkin in renal tissue （t=5.74-12.50，Plt;0.05）， with an increase in the number of mitophagosomes in renal tubular cells. Compared with group E， group F had significantly lower levels of ACR and BUN， renal tubular injury score， mRNA expression levels of inflammatory factors， and protein expression levels of TRPC6 and P62 in renal tissue （t=2.45-7.09，Plt;0.05） and significantly higher protein expression levels of LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ， PINK1， and Parkin in renal tissue （t=7.91-13.18，Plt;0.05）， with an increase in the number of mitophagosomes in renal tubular cells. Group H had significantly higher mRNA expression levels of inflammatory factors than group G （t=5.40-7.27，Plt;0.05）.

Conclusion TRPC6 can aggravate renal tubulointerstitial inflammation by upregula-

ting its expression and inhibiting mitophagy in renal tubular cells. Therefore TRPC6 inhibitors are promising for the treatment of DKD disease.

［KEY WORDS］ Diabetic nephropathies; TRPC cation channels; Mitophagy; Nephritis， interstitial; Disease models， auimal; Mice， inbred C57BL

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一。DKD的發(fā)病機(jī)制包括腎臟基底膜增厚、足細(xì)胞丟失、系膜擴(kuò)張、腎小管萎縮、間質(zhì)炎癥和纖維化等［1］。有研究表明，腎小管損傷及其繼發(fā)的腎小管間質(zhì)炎癥是DKD進(jìn)展的特征性病理改變［2-3］。瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道6（TRPC6）是一類Ca2＋通透的非選擇性陽(yáng)離子通道，在各種刺激下介導(dǎo)腎臟細(xì)胞中Ca2＋水平的增加［4］。據(jù)報(bào)道，TRPC6在腎小管上皮細(xì)胞（TECs）的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)［5］，并通過(guò)抑制TECs中NFAT信號(hào)通路促進(jìn)TECs炎癥和纖維化［6-7］。TRPC6敲降可以通過(guò)激活TECs自噬來(lái)抑制氧化應(yīng)激所致的TECs凋亡［8］。TECs作為線粒體最豐富的細(xì)胞之一，易受線粒體功能障礙的影響，線粒體自噬功能障礙是導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)紊亂的重要原因之一。線粒體自噬在細(xì)胞炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，線粒體自噬調(diào)節(jié)基因表達(dá)的減少會(huì)導(dǎo)致線粒體質(zhì)量控制缺陷，從而導(dǎo)致細(xì)胞炎癥［9］。越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，線粒體自噬對(duì)DKD的發(fā)生和發(fā)展具有顯著促進(jìn)作用，DKD患者及DKD模型小鼠均存在腎臟細(xì)胞線粒體自噬功能障礙情況［10-11］。本研究擬探討TRPC6對(duì)DKD小鼠腎小管間質(zhì)炎癥的影響及其機(jī)制，旨在為DKD的治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

6周齡雄性健康C57BL/6J小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，HK-2細(xì)胞由東南大學(xué)腎臟病研究所惠贈(zèng)。鏈脲佐菌素、P62抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，慢病毒購(gòu)買于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，尿石素A、千層紙素A均購(gòu)買于美國(guó)MedChemExpress生物科技公司，肌酐、尿素氮試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，小鼠尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，生理鹽水、DMSO、組織線粒體分離試劑盒購(gòu)買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRPC6、PINK1、COX-Ⅳ抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Parkin抗體購(gòu)買于美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，LC3B抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠和抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體購(gòu)自上海泊灣生物技術(shù)有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自北京Biosharp公司，PCR引物購(gòu)買于上海捷瑞生物工程有限公司，RNA isolater總RNA提取試劑、HiScript Ⅲ RT SuperMix試劑、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，血糖儀與血糖試紙購(gòu)自德國(guó)貝朗公司，逆轉(zhuǎn)錄儀購(gòu)自德國(guó)艾本德股份公司，7300 Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 小鼠的分組及處理

將36只6周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、DKD組（B組）、DKD＋生理鹽水灌胃組（C組）、DKD＋線粒體自噬激活劑灌胃組（D組）、DKD＋陰性對(duì)照慢病毒組（E組）、DKD＋TRPC6敲降慢病毒組（F組）共6組，每組6只。B～F組連續(xù)5 d每天腹腔注射（后簡(jiǎn)稱給藥）10 g/L的鏈脲佐菌素50 mg/kg，A組則連續(xù)每天給予等體積檸檬酸鹽緩沖液。給藥后第4周開(kāi)始，D組每天灌胃濃度為10 mmol/L的尿石素A 50 mg/kg，C組每天灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)處理8周。給藥后第8周開(kāi)始，F(xiàn)組每只小鼠每周

通過(guò)尾靜脈注射滴度為1×

109的TRPC6敲降慢病毒50 μL，E組每只小鼠每周通過(guò)尾靜脈注射等量陰性對(duì)照慢病毒，連續(xù)4周。所有小鼠均于給藥后第12周脫頸處死。

1.3 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮（HK-2）細(xì)胞的分組及處理

將復(fù)蘇后的HK-2細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.1的胎牛血清、10 g/L青-鏈霉素混合液的DMEM/F12培養(yǎng)基中，隨機(jī)分為高糖＋TRPC6 siRNA轉(zhuǎn)染＋線粒體自噬抑制劑干預(yù)組（H組）及高糖＋TRPC6 siRNA轉(zhuǎn)染＋DMSO干預(yù)組（G組）。H組將HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6 siRNA后，置于含35.0 mmol/L葡萄糖及12 μmol/L千層紙素A的DMEM/F12培養(yǎng)基中，G組將HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染TRPC6 siRNA后，置于含35.0 mmol/L葡萄糖及0.06% DMSO的DMEM/F12培養(yǎng)基中，兩組細(xì)胞均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4 各組小鼠全血空腹血糖（FBG）水平、尿微量白蛋白肌酐比（ACR）和血尿素氮（BUN）水平測(cè)定

于給藥后第12周時(shí)，檢測(cè)各組小鼠全血FBG水平；收集各組小鼠24 h的尿液，按小鼠尿微量白蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒和肌酐試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)尿液中微量白蛋白、肌酐水平，并計(jì)算ACR；另取各組小鼠眼球血分離血清，按尿素氮測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)BUN水平。上述檢測(cè)均重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.5 過(guò)碘酸希夫（PAS）染色觀察各組小鼠腎小管損傷情況

所有小鼠均于給藥后第12周時(shí)脫頸處死，分離取出雙側(cè)腎臟。取各組小鼠部分腎組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，進(jìn)行PAS染色之后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察然后拍照。隨機(jī)選取每組小鼠的腎組織切片中20處皮質(zhì)區(qū)域的PAS染色圖像，由觀察者采用盲法對(duì)小鼠腎小管損傷情況進(jìn)行評(píng)分［12］。

1.6 免疫組化染色觀察A、B、E、F組小鼠腎組織中胞漿蛋白TRPC6表達(dá)

取1.5中A、B、E、F組小鼠腎組織切片，抗原修復(fù)后滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑和正常非免疫動(dòng)物血清，在4 ℃下與TRPC6一抗（1∶200）孵育過(guò)夜。復(fù)溫后滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠/兔IgG二抗，室溫下孵育2 h。將配制的DAB顯色液滴加在組織上，顯微鏡下顯色觀察，蘇木素滴染后使用體積分?jǐn)?shù)0.80、0.85、0.95、1.00的乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。置于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照并保存圖片。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)小鼠腎組織胞漿蛋白TRPC6及線粒體蛋白相對(duì)表達(dá)水平

取1.5中A、B、E、F組小鼠腎組織標(biāo)本，檢測(cè)腎組織中胞漿蛋白TRPC6相對(duì)表達(dá)水平；取所有組小鼠腎組織標(biāo)本，分離腎組織線粒體，同時(shí)檢測(cè)腎組織線粒體中各種蛋白［微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）、泛素結(jié)合蛋白P62、PTEN誘導(dǎo)假定激酶1（PINK1）、E3連接酶Parkin］相對(duì)表達(dá)水平。采用組織線粒體分離試劑盒分離各組小鼠腎組織線粒體，RIPA裂解腎組織及線粒體，并用二喹啉甲酸測(cè)定蛋白濃度。在提取的總蛋白中加入上樣緩沖液和雙蒸水，制成等濃度等體積的蛋白樣本，充分混勻，于100 ℃水浴加熱5 min。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳加載處理后的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。然后將膜置于NcmBlot封閉緩沖液中封閉20 min，并在4 ℃下與TRPC6（1∶1 000）、胞漿蛋白內(nèi)參β-actin（1∶10 000）、LC3B（1∶1 000）、P62（1∶1 000）、PINK1（1∶1 000）、Parkin（1∶1 000）和線粒體蛋白內(nèi)參COX-Ⅳ（1∶5 000）的一抗孵育過(guò)夜。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠或抗兔IgG（1∶3 000）在室溫下孵育1 h后，化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)系統(tǒng)顯影上述蛋白印跡并拍照。使用Image J軟件分析TRPC6、β-actin、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、P62、PINK1、Parkin、COX-Ⅳ蛋白條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量以蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值計(jì)算，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的均值。

1.8 RT-qPCR檢測(cè)各組小鼠腎組織及各組HK-2細(xì)胞中炎性因子（IL-1β、MCP-1、TNF-α）mRNA表達(dá)水平

使用RNA isolater總RNA提取試劑提取A～F組小鼠腎組織中以及G、H組HK-2細(xì)胞中的總RNA，使用HiScript Ⅲ RT SuperMix試劑在逆轉(zhuǎn)錄儀當(dāng)中逆轉(zhuǎn)錄mRNA，然后用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑在7300 Real-time PCR儀中檢測(cè)IL-1β、MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參，采用2－△△CT方法計(jì)算

以上各mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。所使用的引物名稱及其序列見(jiàn)表1。

1.9 透射電鏡觀察各組小鼠腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量

取各組小鼠部分腎組織標(biāo)本，使用2.5%戊二醛固定后浸泡在1%四氧化鋨中，用體積分?jǐn)?shù)0.5、0.7、0.8、0.9的丙酮梯度脫水，包埋后制作超薄（50～70 nm）切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛對(duì)其進(jìn)行染色，最后在透射電鏡下觀察并拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x-±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 各組小鼠給藥后第12周時(shí)全血FBG、BUN水平及ACR比較

第12周時(shí)，B組小鼠給藥后全血FBG、BUN水平以及ACR均顯著高于A組（t=2.77～5.71，P＜0.05）；D組小鼠ACR及BUN水平顯著低于C組（t=2.40、3.50，P＜0.05）；F組小鼠ACR及BUN水平顯著低于E組（t=2.45、3.81，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 各組小鼠腎組織PAS染色及腎小管損傷情況比較

A～F組腎小管損傷評(píng)分分別為（1.10±0.57）、（2.90±0.74）、（3.00±0.67）、（2.00±0.67）、（3.00±0.47）、（2.30±0.67）分。與A組相比，B組小鼠腎小管萎縮、TECs脫落和刷狀緣缺失，腎小管損傷評(píng)分值顯著升高（t=6.11，P＜0.05）；與C組相比，D組小鼠腎小管萎縮、TECs脫落和刷狀緣缺失的情況得到明顯改善，腎小管損傷評(píng)分值顯著降低（t=3.35，P＜0.05）；與E組相比，F(xiàn)組小鼠腎小管萎縮、TECs脫落和刷狀緣缺失的情況得到明顯改善，腎小管損傷評(píng)分值顯著降低（t=2.69，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.3 各組小鼠腎組織中及各組細(xì)胞中炎性因子mRNA表達(dá)水平比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，B組小鼠腎組織當(dāng)中IL-1β、MCP-1、TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著高于A組（t=5.49～7.79，P＜0.05）；D組小鼠腎組織中以上炎性因子mRNA表達(dá)水平顯著低于C組（t=4.29～8.80，P＜0.05）；F組小鼠腎組織中以上炎性因子mRNA表達(dá)水平顯著低于E組（t=4.44～6.11，P＜0.05）；H組細(xì)胞中以上炎性因子mRNA表達(dá)水平顯著高于G組（t=5.40～7.27，P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組小鼠腎組織胞漿蛋白TRPC6免疫組化染色以及胞漿蛋白TRPC6、線粒體蛋白（LC3B、P62、PINK1、Parkin）表達(dá)水平比較

免疫組化染色結(jié)合蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，B組腎組織中胞漿蛋白TRPC6表達(dá)水平顯著高于A組（t=13.61，P＜0.05），F(xiàn)組小鼠腎組織TRPC6表

達(dá)顯著低于E組（t=6.08，P＜0.05）。見(jiàn)圖2～3、

表4。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠腎組織線粒體蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及PINK1、Parkin相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，P62相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（t=3.33～14.63，P＜0.05）；與C組相比，D組小鼠腎組織線粒體蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及PINK1、Parkin相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，P62相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（t=5.74～23.50，P＜0.05）；與E組相比，F(xiàn)組小鼠腎組織中線粒體蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及PINK1、Parkin相對(duì)表達(dá)水平均顯著升高，P62相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（t=7.09～13.18，P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表4。

2.5 各組小鼠腎小管細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果比較

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，B組小鼠腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量少于A組，C組小鼠腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量多于D組，E組小鼠腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量多于F組。見(jiàn)圖5。

3 討" 論

DKD是DM患者最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是一種慢性進(jìn)行性疾病。腎小管間質(zhì)炎癥是DKD的重要病理特征之一，其進(jìn)展最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化。既往認(rèn)為DKD是一種腎小球疾病，腎小管損傷被認(rèn)為繼發(fā)于腎小球損傷。然而，越來(lái)越多的證據(jù)支持DKD的腎小管間質(zhì)損傷也可能始于原發(fā)性腎小管損傷［13］。本研究結(jié)果顯示，給藥后第12周時(shí)B組小鼠全血FBG水平、ACR、BUN水平、腎小管損傷評(píng)分及腎組織炎性因子mRNA水平均明顯高于A組，提示DKD小鼠出現(xiàn)腎小管損傷，腎小管間質(zhì)炎癥加重。

腎小管細(xì)胞易受線粒體功能障礙的影響。受損的線粒體無(wú)法供給足夠的ATP，從而導(dǎo)致腎小管細(xì)胞萎縮或去分化［14］。嚴(yán)重的線粒體損傷和線粒體清除功能障礙可導(dǎo)致線粒體DNA（mtDNA）泄漏到細(xì)胞質(zhì)中，而腎小管細(xì)胞中mtDNA的異常包裝導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)中易位，激活環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷-腺苷磷酸合成酶-干擾素基因刺激因子信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞因子表達(dá)和免疫細(xì)胞募集［15］。此外，缺陷線粒體不能維持跨越線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子梯度，因而導(dǎo)致腎小管細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，加重腎小管間質(zhì)炎癥［16］。本研究結(jié)果顯示，與A組相比，B組小鼠腎組織中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ以及PINK1、Parkin蛋白表達(dá)減少，P62蛋白表達(dá)增加，電鏡下B組小鼠腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量減少，提示DKD小鼠腎小管細(xì)胞中PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬受到抑制。使用尿石素A激活線粒體自噬后的D組小鼠腎組織ACR、BUN水平、腎小管損傷評(píng)分及腎組織炎性因子mRNA水平均顯著低于C組，提示激活腎小管細(xì)胞線粒體自噬可減輕DKD小鼠的腎小管損傷和腎小管間質(zhì)炎癥，該結(jié)果與既往研究報(bào)道的結(jié)果相似［17］。但目前DKD腎小管線粒體自噬抑制的具體機(jī)制尚未完全清楚。

TRPC6是一類廣泛存在于各種腎臟細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，能夠介導(dǎo)Ca2＋內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞。DKD中TRPC6通道活性受到血管緊張素Ⅱ、ATP、蛋白酶激活受體激動(dòng)劑和其他內(nèi)源性因素的調(diào)節(jié)，刺激磷脂酶C偶聯(lián)受體可激活TRPC6，從而誘導(dǎo)Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞并刺激鈣調(diào)磷酸酶［18］。本研究中B組小鼠腎組織TRPC6表達(dá)顯著高于A組，F(xiàn)組小鼠腎組織ACR、BUN水平、腎小管損傷分?jǐn)?shù)及腎組織炎性因子mRNA水平均顯著低于E組，提示敲降TRPC6可減輕DKD腎小管損傷和腎小管間質(zhì)炎癥。同時(shí)，與E組相比較，F(xiàn)組小鼠腎組織中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ及PINK1、Parkin蛋白表達(dá)增加，P62蛋白表達(dá)減少，電鏡下腎小管細(xì)胞中線粒體自噬體數(shù)量增多，提示TRPC6敲降的DKD小鼠腎小管細(xì)胞中PINK1/Parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬抑制得到改善。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在敲降TRPC6的基礎(chǔ)上使用線粒體自噬抑制劑干預(yù)后，H組細(xì)胞的炎性因子mRNA水平顯著高于G組，說(shuō)明敲降TRPC6對(duì)腎小管間質(zhì)炎癥的改善作用幾乎被線粒體自噬抑制劑消除，進(jìn)一步說(shuō)明TRPC6通過(guò)抑制線粒體自噬加重了DKD小鼠腎小管間質(zhì)炎癥。

綜上所述，TRPC6表達(dá)上調(diào)可通過(guò)抑制線粒體自噬加劇高糖誘導(dǎo)的小鼠腎小管炎性損傷和DKD。本研究首次闡述了DKD中TRPC6與線粒體自噬的相關(guān)性，但上述結(jié)論還需后續(xù)更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，且需對(duì)TRPC6抑制線粒體自噬的具體機(jī)制進(jìn)行探討。既往研究結(jié)果顯示，包括AMPK、NOX4以及Klotho在內(nèi)的多種信號(hào)通路均能夠抑制腎組織當(dāng)中TRPC6的表達(dá)，miR-26a-5p也可以減弱DKD中TRPC6活化，從而改善DKD中腎小球或腎小管間質(zhì)病變［19-22］。在此背景下，TRPC6抑制藥物有希望用于DKD治療，本研究為延緩DKD腎小管間質(zhì)炎癥進(jìn)展提供了治療策略及理論依據(jù)。

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)青島大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（文件號(hào)QYFYWZLL28812）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》的條例進(jìn)行。

作者聲明：劉叢聰、馬瑞霞、張行健參與了研究設(shè)計(jì)；劉叢聰、張行健、丁琳、張瑤、張棟杰參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 范睿心 厲建強(qiáng)）