摘要：目的 分析ARHGAP8對中低位局部進(jìn)展期直腸癌新輔助化療療效預(yù)測的敏感性，為進(jìn)展期直腸癌的治療提供精準(zhǔn)依據(jù)。方法 通過生物信息學(xué)分析篩選，獲得差異基因ARHGAP8。選取68例原發(fā)性直腸癌患者的直腸癌組織及直腸組織標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)方法分別對ARHGAP8的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行驗(yàn)證，并收集患者性別、年齡、分期、腫瘤大小、分化程度、病理類型等臨床病理特征進(jìn)行功能驗(yàn)證；選取44例行新輔助化療的中低位局部進(jìn)展期直腸癌患者，采用免疫組織化學(xué)方法檢測新輔助化療前后ARHGAP8的表達(dá)情況，分析ARHGAP8在新輔助化療前后、不同療效組之間的表達(dá)情況。結(jié)果 生物信息學(xué)結(jié)果顯示，ARHGAP8在癌組織及直腸組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且ARHGAP8的表達(dá)水平與腫瘤分期（P=0.024）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.007）、年齡（P=0.005）等臨床特征相關(guān)。 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，ARHGAP8 mRNA在癌組織中的表達(dá)顯著高于直腸組織（P＜0.001）；Western blot和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，ARHGAP8蛋白在癌組織中的表達(dá)顯著高于直腸組織（P=0.011）；ARHGAP8的表達(dá)與腫瘤大?。≒=0.010）、病理分期（P=0.005）密切相關(guān)，而與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、Ki-67、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的表達(dá)程度無相關(guān)性。44例接受新輔助化療的患者中TRG 0級13例、1級8例、2級8例、3級15例，其中65.91%（29/44）的患者新輔助化療有效，新輔助化療有效患者治療后ARHGAP8的表達(dá)顯著下降（P＜0.001），ARHGAP8蛋白低表達(dá)患者的有效率為92.86％，顯著高于ARHGAP8蛋白高表達(dá)者（53.33％）（P=0.033）。結(jié)論 ARHGAP8在直腸癌組織中高表達(dá)，ARHGAP8低表達(dá)的中低位局部進(jìn)展期直腸癌患者對XELOX方案新輔助化療更為敏感，ARHGAP8可作為直腸癌發(fā)生發(fā)展的潛在生物學(xué)指標(biāo)，同時可作為中低位局部進(jìn)展期直腸癌XELOX方案新輔助化療療效評估的重要參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：中低位局部進(jìn)展期直腸癌；ARHGAP8；新輔助化療；療效評估；腫瘤退縮分級

中圖分類號： R735.3+7" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A" 文章編號：1000-503X（2024）04-0528-11

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15899

Application of ARHGAP8 in Predicting the Efficacy of Neoadjuvant Chemotherapy for Locally Advanced Mid-Low Rectal Cancer

XI Yuning1，XUE Jun1，2，WU Xueliang1，2，QU Ming1，SUN Guangyuan1，HAN Lei1，GUO Fei1，ZHANG Chunze3，WANG Yifei1，LIANG Weizheng4

1Department of General Surgery，2Institute of Tumor，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China

3Department of Anus and Intestine Surgery，People’s Hospital of Tianjin，Tianjin 300000，China

4Central Laboratory，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China

Corresponding author：XUE Jun Tel：0313-8046911，E-mail：yfyxuejun@163.com

ABSTRACT：Objective To analyze the sensitivity of ARHGAP8 in predicting the efficacy of neoadjuvant chemotherapy in the patients with locally advanced mid-low colorectal cancer and provide accurate evidence for the treatment of advanced colorectal cancer.Methods The differentially expressed gene ARHGAP8 was screened out by bioinformatics analysis.Cancer tissue and rectal tissue of 68 patients with primary rectal cancer were selected.The rectal cancer tissue samples and the rectal tissue samples were collected for clinical validation of ARHGAP8 expression by quantitative real-time PCR，Western blotting，and immunohistochemistry.The clinical and pathological features such as gender，age，tumor stage，differentiation degree，and pathological type of the patients were collected for functional validation.Forty-four patients with locally advanced mid-low rectal cancer who received neoadjuvant chemotherapy were selected for immunohistochemical examination of ARHGAP8 expression.The expression level of ARHGAP8 was compared between before and after chemotherapy and among different efficacy groups.Results The bioinformatics analysis revealed differences in the expression level of ARHGAP8 between the cancer tissue and rectal tissue （Plt;0.001）.The expression level of ARHGAP8 was correlated with tumor stage （P=0.024），lymph node metastasis （P=0.007），and age （P=0.005）.Quantitative real-time PCR results showed that the mRNA level of ARHGAP8 in the cancer tissue was higher than that in the rectal tissue （Plt;0.001）.Western blotting and immunohistochemistry results demonstrated that the protein level of ARHGAP8 in the cancer tissue was higher than that in the rectal tissue （P=0.011）.The expression of ARHGAP8 was correlated with tumor size （P=0.010） and pathological stage （P=0.005），while it showed no significant association with tumor differentiation degree，lymph node metastasis，liver metastasis，Ki-67，or microsatellite instability expression level.The 44 patients receiving neoadjuvant chemotherapy included 13，8，8，and 15 patients of tumor regression grades 0，1，2，and 3，respectively.Among them，65.91% （29/44） patients showed responses to the treatment.After neoadjuvant chemotherapy，the expression of ARHGAP8 in the cancer tissue was down-regulated in the patients who responded to the chemotherapy （Plt;0.001）.The response rate in the patients with low protein level of ARHGAP8 was 92.86%，which was higher than that （53.33%） in the patients with high protein level of ARHGAP8 （P=0.033）.Conclusions ARHGAP8 is highly expressed in the rectal cancer tissue.The patients with locally advanced mid-low rectal cancer and low ARHGAP8 expression are more sensitive to neoadjuvant chemotherapy with the XELOX protocol.ARHGAP8 can serve as a potential biomarker for the occurrence and development of rectal cancer and an important index for evaluating the efficacy of neoadjuvant chemotherapy with the XELOX protocol in the patients with locally advanced mid-low rectal cancer.

Key words：locally advanced mid-low rectal cancer；ARHGAP8；neoadjuvant chemotherapy；efficacy evaluation；tumor regression grade

Acta Acad Med Sin，2024，46（4）：528-538

近年來，全球結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)逐年上升趨勢［1］。據(jù)最新研究數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率、病死率在惡性腫瘤中高居第2位［2］。局部進(jìn)展期直腸癌（locally advanced rectal cancer，LARC）因其較高的復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率引起了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注［3］。新輔助化療［4］即新輔助化療+全直腸系膜切除術(shù)+術(shù)后輔助化療的“夾心餅”療法近年被普遍運(yùn)用于低位進(jìn)展期直腸癌的治療中［5］。有臨床研究證實(shí)，新輔助化療模式可顯著提高進(jìn)展期直腸癌的R0切除率，降低局部復(fù)發(fā)率［6］，是LARC治療的重要手段［4］，其對于病變的治療有重要作用。腫瘤退縮分級（tumor regression grade，TRG）作為評估新輔助化療療效的標(biāo)準(zhǔn)目前被學(xué)界廣泛認(rèn)可。然而，目前對預(yù)測直腸癌新輔助化療療效及預(yù)后影響的研究較少，且無明確的指南共識［4］。近年來，對于LARC患者新輔助化療后反應(yīng)的預(yù)測，逐步傾向于生物學(xué)標(biāo)志物的檢測，且在最新版的美國臨床腫瘤學(xué)會指南中將分子生物學(xué)指標(biāo)的檢測作為LARC療效的重要評估方式，從而為LARC治療提供更為精準(zhǔn)的依據(jù)［7］。

ARHGAP8是近年新發(fā)現(xiàn)的RHOGAP家族的新成員，它通過對結(jié)合了GTP的三聚體G蛋白及RHO家族蛋白發(fā)揮加速解離、抑制GTP結(jié)合的功能，從而發(fā)揮改變細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，其在乳腺癌與結(jié)直腸癌中有較高的表達(dá)，但具體的臨床意義及相關(guān)作用機(jī)制尚不明確［8-10］。本研究旨在檢測ARHGAP8在直腸癌組織中表達(dá)的特異性，分析其臨床意義，并探討ARHGAP8的表達(dá)與直腸癌新輔助化療療效的預(yù)測價值，從而為進(jìn)展期直腸癌臨床新輔助化療療效預(yù)測提供精準(zhǔn)的參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 臨床病例收集

選取2021年8月至2023年5月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科行直腸癌切除術(shù)的68例患者，分別取癌灶中心組織及距腫瘤10 cm以上的直腸組織各2～5 g，并統(tǒng)計(jì)患者的臨床資料（腫瘤分期、浸潤深度、分化程度、Ki-67表達(dá)程度等）。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審查編號：K2022058），且患者知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)病理證實(shí)為直腸腺癌；（2）術(shù)前未行放化療、生物、免疫等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他原發(fā)惡性腫瘤病史；（2）病例資料不完整；（3）拒絕參與本研究。

選取同期行新輔助化療+手術(shù)治療的44例中低位局部進(jìn)展期直腸癌患者，并收集腸鏡活檢癌組織及術(shù)后癌組織病理蠟塊，病理圖片及化療前后的腸鏡、MRI影像學(xué)圖片等資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理證實(shí)為直腸腺癌；（2）術(shù)前評估為中低位局部進(jìn)展期；（3）均為術(shù)前行XELOX方案新輔助化療+根治性切除+術(shù)后行輔助化療；（4）無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（5）病史資料齊全；（6）依從性好，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（2）無法耐受化療而中斷。

1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）是一個交互式門戶網(wǎng)站，用于對TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)的37種腫瘤進(jìn)行深入分析，本研究用于比較ARHGAP8在直腸癌中的差異表達(dá)及ARHGAP8與直腸癌部分臨床表型的關(guān)系。R語言maftools（版本 4.2.3）用于對腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）等數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與實(shí)驗(yàn)試劑

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)時熒光定量PCR儀（TL988）為西安天隆科技有限公司產(chǎn)品；恒溫鼓風(fēng)電熱干燥箱（101-1AB）為天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2）、實(shí)驗(yàn)室高壓蒸汽滅菌器（BKO-B50II）、液氮罐（YDS-10-125-F）均為山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司產(chǎn)品；醫(yī)用純水機(jī)（SCSJ-II-60L）、臺式高速冷凍離心機(jī)（TGL-16M）均為濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；自動切片機(jī)（KD-2258）、生物組織攤烤片機(jī)（目錄號KD-T）均為浙江省科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；移液槍為美國TERMO公司產(chǎn)品；免疫組織化學(xué)濕盒為武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；包埋機(jī)（目錄號KD-BL111）、切片機(jī)（目錄號KD-2258）均購自浙江省科迪儀器設(shè)備有限公司；LED熒光顯微鏡（目錄號DM 2500）購自徠卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司；Mini AmpTM熱循環(huán)儀（目錄號A37834）、7500實(shí)時熒光定量PCR分析儀（目錄號4351104）均購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DAB顯色液（目錄號GB/T 601-2020）、DAB顯色液（ZLI-9017）、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗山羊IgG（目錄號ZB-2306）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；10%中性緩沖福爾馬林溶液（目錄號BLC-01）為北京九州柏林生物科技有限公司產(chǎn)品；二甲苯（目錄號X821391）、無水乙醇（目錄號E809061）均為上海麥克林生化科技股份有限公司產(chǎn)品；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（目錄號C1031）、封閉山羊血清（目錄號SL038）、抗原修復(fù)液（目錄號C1031）、脫脂奶粉（目錄號LP0033B）均購自北京索萊寶科技有限公司；1×PBS緩沖液（目錄號P1020）、中性樹膠（目錄號ZLI-9555）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；兔二步法試劑盒（目錄號PV-6001）試劑1：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、試劑2：酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木精（目錄號BS915）為Biosharp生物科技有限公司產(chǎn)品；ARHGAP8抗體購自Atlas antibodies公司；Hifair Ⅲ第1鏈cDNA 預(yù)混液（含gDNA 去除）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（目錄號11139ES60）、實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增預(yù)混合液試劑盒（目錄號11202ES50）均購自翌圣生物科技股份有限公司；細(xì)胞組織快速裂解液（目錄號R0278）購自上海北諾生物科技公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（目錄號（P2120）購自美國默克集團(tuán)；Trizol試劑（目錄號15596026）、PierceTM BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（目錄號23225）均購自賽默飛世爾科技有限公司；ARHGAP8 一抗（PA5-67065）購自英杰生命技術(shù)有限公司。

1.4 新輔助化療流程

術(shù)前給予4周期XELOX方案化療［11］（化療日靜脈滴注奧沙利鉑130 mg/m2，化療后1～14 d口服卡培他濱2000 mg/m2，15～21 d間歇）［12-14］，后行根治性手術(shù)，術(shù)后輔助治療，期間密切隨訪患者生存期［13］。

1.5 手術(shù)方式及標(biāo)本采集

均由專業(yè)的外科團(tuán)隊(duì)行全直腸系膜切除術(shù)［15］，在手術(shù)標(biāo)本離體30 min內(nèi)，取癌灶中心癌組織及距腫瘤10 cm以上的直腸組織各200 mg，用PBS溶液將組織表面的血液及污物沖洗干凈，剔除壞死組織，用吸水紙吸干殘留PBS液，裝入無菌凍存管后放入液氮速凍，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存，一份標(biāo)本用于實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)；另取一份同樣的標(biāo)本由組織液浸泡固定后行病理取材和蠟塊制備。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR分析ARHGAP8 mRNA在癌組織和直腸組織中的表達(dá)

選取68例直腸癌患者的直腸癌組織和直腸組織進(jìn)行ARHGAP8表達(dá)程度檢測。使用Trizol 試劑方法提取直腸癌及直腸組織的總RNA。使用Hifair Ⅲ第1鏈cDNA 預(yù)混液（含gDNA 去除）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為第1鏈cDNA，此步驟應(yīng)全程均在冰上操作。在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//nih.gov）查得引物序列：人類GAPDH上游引物：5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’，下游引物：5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’；人類ARHGAP8上游引物：5’-GTGCTGAGGTTCACAGTGACGT-3’，下游引物：5’-GGTTGTAGAGCCTCTGGATCTC-3’，由北京擎科生物科技有限公司合成。實(shí)時熒光定量PCR程序的測定按照實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增預(yù)混合液試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn)分析ARHGAP8在直腸癌組織和直腸組織中的表達(dá)

選取16例直腸癌患者的直腸癌和直腸組織，用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的放射免疫沉淀測定裂解緩沖液裂解組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)。使用PierceTM BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。將10%的SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠放入裝有1×電泳液的電泳槽中，加入蛋白質(zhì)，連接電源，待溴酚藍(lán)指示劑到分離膠底部時停止。將10% SDS-PAGE分離膠蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印槽調(diào)整電壓至110 V，轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜完畢后，用5%脫脂奶粉將PVDF膜在室溫下封閉1 h。將PVDF膜放在抗體稀釋液中，4 ℃冰箱過夜。然后，將PVDF膜與二抗在室溫下孵育90 min。使用全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測ARHGAP8在癌組織與直腸組織中的表達(dá)。

1.8 免疫組織化學(xué)分析ARHGAP8在直腸癌組織與直腸組織及化療前后組織中的表達(dá)

選取68例術(shù)后直腸癌及直腸組織、44例新輔助化療患者治療前和手術(shù)切除的直腸癌標(biāo)本，取適量大小放入組織包埋盒，10%中性緩沖福爾馬林溶液固定，用石蠟對固定的組織進(jìn)行包埋，使用切片機(jī)將石蠟組織切成4 μm的組織切片，組織切片用二甲苯和乙醇脫蠟，使用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液對組織進(jìn)行抗原修復(fù)。在組織表面滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，然后用5%封閉用正常山羊血清封閉。切片與ERp57 Rabbit mAb在4 ℃下孵育過夜，隨后與過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物室溫孵育20 min。將配好的DAB顯色液滴加到組織上且需覆蓋全部組織，反應(yīng)呈棕黃色時終止染色。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞，鹽酸酒精分化，以飽和磷酸氫二鈉溶液浸泡藍(lán)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

使用徠卡顯微成像系統(tǒng)對組織切片進(jìn)行圖像拍攝。使用Image J-Fiji（美國國立衛(wèi)生研究院）軟件對免疫組織化學(xué)圖片進(jìn)行識別分析，得出平均光密度值，然后使用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行圖表顯著性分析，用以判斷ARHGAP8在癌組織與直腸組織、不同分期、不同療效癌組織中表達(dá)程度。

ARHGAP8表達(dá)程度判定由有資質(zhì)的病理醫(yī)生對染色后的組織切片在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀察，該蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，陽性者細(xì)胞質(zhì)染色為棕黃色或褐色，分別評估染色細(xì)胞比例以及細(xì)胞的染色程度。評估標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）染色。無染色：0分；淡黃染：1分；棕黃色：2分；深黃色：3分。（2）染色細(xì)胞比。染色細(xì)胞≤5%：0分；5%＜染色細(xì)胞≤25%：1分；25%＜染色細(xì)胞≤50%：2分；染色細(xì)胞＞50%：3分。兩項(xiàng)得分相乘，低表達(dá)≤3分，高表達(dá)＞3分。

1.9 病理學(xué)TRG分級

由2名副高以上的病理醫(yī)生對切片在顯微鏡下進(jìn)行TRG分期判讀［3］。TRG標(biāo)準(zhǔn)參照美國癌癥聯(lián)合委員會TRG進(jìn)行評估［16-17］。TRG 0級：完全退縮，鏡下無可見的腫瘤細(xì)胞；TRG 1級：鏡下僅見單個或小灶腫瘤細(xì)胞；TRG 2級：退縮明顯但明顯可見殘余腫瘤多于單個或小灶腫瘤細(xì)胞；TRG 3級：可見大面積殘余腫瘤組織，少量退縮或無退縮［3］。TRG 0～1級為療效良好，TRG 2～3級為療效較差；TRG 0～2級為治療有效，TRG 3級為治療無效。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，多組獨(dú)立非正態(tài)分布的連續(xù)變量選擇Kruskai-Wallis H檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)與百分率表示，n≥40且理論頻數(shù)＜5的格子數(shù)在50%以下時使用Pearson卡方；n＜40且理論頻數(shù)小于5的格子數(shù)在50%以上時使用Fisher確切概率法分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析檢測ARHGAP8在直腸癌組織與直腸組織的表達(dá)

基于UALCAN網(wǎng)站比較直腸癌樣本中ARHGAP8基因在mRNA表達(dá)水平的差異，結(jié)果顯示ARHGAP8在癌組織及直腸組織中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖1A）；進(jìn)一步分析ARHGAP8表達(dá)在直腸組織及直腸癌組織中的臨床數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示ARHGAP8與腫瘤分期（P=0.024）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.007）、年齡（P=0.005）等臨床特征密切相關(guān)（圖1B～1D），而與MSI（P=0.143）、TMB（P=0.175）無相關(guān)性（圖1E、1F）。

2.2 ARHGAP8 mRNA 在直腸癌組織和直腸組織中的表達(dá)

將實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果表達(dá)量繪制表達(dá)分布圖，結(jié)果顯示ARHGAP8在癌組織中的表達(dá)顯著高于直腸組織（P＜0.001）（圖2）。

2.3 ARHGAP8 蛋白在直腸癌組織和直腸組織中的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示ARHGAP8在癌組織中的表達(dá)顯著高于直腸組織（P=0.011）（圖3）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示ARHGAP8蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，直腸組織直腸腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)整，未見異型性，ARHGAP8不表達(dá)或輕微表達(dá)；癌組織中細(xì)胞異型性和組織結(jié)構(gòu)異型性明顯，細(xì)胞核可見核分裂象。ARHGAP8在直腸組織中不表達(dá)或輕微表達(dá)（圖4A），在高分化癌組織腺泡結(jié)構(gòu)清晰，ARHGAP8表達(dá)較直腸組織明顯升高（圖4B），在中分化癌組織表達(dá)程度與高分化相似（圖4C），在低分化癌組織細(xì)胞異型性、組織異型性明顯，ARHGAP8表達(dá)程度較中、高分化組織升高（圖4D）。將免疫組織化學(xué)圖片經(jīng)Image J程序處理，將數(shù)據(jù)帶入GraphPad程序，結(jié)果顯示ARHGAP8在癌組織中的表達(dá)顯著高于直腸組織（P＜0.001）。

2.4 ARHGAP8的表達(dá)與直腸癌臨床及病理特征的關(guān)系

68例直腸癌中，Ⅰ期5例（7.4%）、Ⅱ期4例（5.9%）、Ⅲ期32例（47.1%）、Ⅳ期27例（39.7%）。ARHGAP8的表達(dá)與腫瘤大?。≒=0.010）、病理分期（P=0.005）呈正相關(guān)；而與腫瘤分化程度、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67、MSI均無相關(guān)性（P均gt;0.05）（表1）。

2.5 ARHGAP8在癌組織新輔助化療前后的表達(dá)

完成新輔助化療并接受手術(shù)的44例患者中，ARHGAP8蛋白在各TRG分級化療后高表達(dá)率較化療前均呈下降趨勢，且表達(dá)下降率隨TRG分級的增加逐漸遞減（表2）。65.91%（29/44）的患者治療有效。其中高表達(dá)有效率為53.33%（16/30）；低表達(dá)有效率為92.86%（13/14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）。

新輔助化療前后的MRI、腸鏡、病理HE染色、免疫組織化學(xué)可見TRG 0級患者化療后未見癌組織殘留，病理下僅可見纖維細(xì)胞及少量炎癥細(xì)胞，ARHGAP8化療后少量表達(dá)，較化療前表達(dá)明顯下降；TRG 1級患者化療后明顯縮小，病理僅可見少量癌簇殘留，ARHGAP8化療后表達(dá)下降；TRG 2級患者化療后少量退縮，化療后可見明顯癌細(xì)胞殘留，化療后ARHGAP8表達(dá)明顯；TRG 3級患者化療后腫瘤退縮不明顯，可見大量癌細(xì)胞殘留，化療后ARHGAP8大量表達(dá)（圖5～12）；檢測后將圖片經(jīng)Image J程序處理，結(jié)果顯示ARHGAP8的表達(dá)在新輔助化療后顯著降低（P＜0.001）。

2.6 ARHGAP8的表達(dá)與新輔助化療療效的關(guān)系

44例新輔助化療患者中，在TRG 0～2級中，ARHGAP8蛋白在化療后的表達(dá)較化療前顯著降低（P均lt;0.001），而在TRG 3級中，ARHGAP8蛋白在化療前后中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.184）；44例新輔助化療患者中，47.73% （21/44）的患者治療效果良好（TRG 0～1級），65.91%（29/44）的患者治療有效（TRG 0～2級），52.27%（23/44）的患者治療效果不明顯（TRG 2～3級），在TRG 0～1級（腫瘤退縮明顯）、TRG 0～2級（治療有效）、TRG 2～3級（腫瘤退縮不明顯），ARHGAP8的蛋白表達(dá)在化療前后差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，P＜0.001，P=0.031）（圖13）。

3 討論

結(jié)直腸癌是現(xiàn)階段常見的消化道腫瘤，其發(fā)生率呈逐年上升趨勢。結(jié)直腸癌因其較高的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率（29%～39%）受到廣泛關(guān)注［18-19］。中低位直腸癌是指距肛緣5～10 cm以內(nèi)的直腸癌，據(jù)中國結(jié)直腸癌手術(shù)病例登記數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，中低位直腸癌占直腸癌的92.8％，是直腸癌最常見的發(fā)生部位［20］。進(jìn)展期直腸癌是指T3或T4的原發(fā)性腫瘤或存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（T3～4和/或N+）或Ⅱ期（CT3～4，N0）、Ⅲ期（CT1～4，N1～3）的直腸癌［21］。其因較低的5年生存率、較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率受到學(xué)界廣泛關(guān)注，如何有效提高中低位進(jìn)展期直腸癌手術(shù)切除率、改善患者生存質(zhì)量，成為學(xué)界廣泛關(guān)注的話題。

新輔助化療即術(shù)前新輔助化療+全直腸系膜切除術(shù)+術(shù)后輔助化療的“夾心餅”模式，是現(xiàn)階段中低位進(jìn)展期直腸癌常見的治療手段，該模式可通過促使腫瘤回縮、降期，以提高腫瘤的切除率，降低局部復(fù)發(fā)率［4］。但現(xiàn)階段仍缺少可以準(zhǔn)確預(yù)測新輔助化療療效敏感性的指標(biāo)［22-25］，這也是直腸癌新輔助化療的研究熱點(diǎn)。

ARHGAP8是近年發(fā)現(xiàn)的RHOGAP家族的新成員，在乳腺癌與結(jié)直腸癌中的表達(dá)顯著高于直腸組織，其相對分子質(zhì)量為53 500，位于染色體22q13.31上雜合性缺失的關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)，擁有保守的結(jié)構(gòu)域GAP［26-27］。其中的同源區(qū)段存在保守的精氨酸指狀結(jié)構(gòu)，可插入RhoGTPase活性位點(diǎn)，最終使其易與GDP結(jié)合而成失活狀態(tài)［28］，其C端具有SH3結(jié)構(gòu)，能與富含脯氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白相互作用［29-31］，其相應(yīng)的蛋白質(zhì)通過5VCpG島的高甲基化在腫瘤中表觀遺傳失活，隨后轉(zhuǎn)錄［32］。通過對結(jié)合了GTP的三聚體G蛋白及RHO家族蛋白發(fā)揮加速解離的作用，從而發(fā)揮抑制GTP結(jié)合的功能［33］。因此，其可以改變細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。ARHGAP8的活性受磷脂化、磷酸化、蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)水解等多機(jī)制調(diào)控，深度參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂分化、胞吞胞吐、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞癌變以及腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移的過程［32-34］。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析篩選出直腸癌與直腸組織中表達(dá)存在差異的基因ARHGAP8，結(jié)果顯示ARHGAP8與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡等臨床特征密切相關(guān)，與MSI、TMB無相關(guān)性，但隨著ARHGAP8表達(dá)含量的上升，MSI、TMB也呈上升趨勢，提示ARHGAP8在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫浸潤中發(fā)揮作用。采用實(shí)時熒光定量PCR、Western blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)對癌組織和直腸組織中ARHGAP8的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示ARHGAP8在癌組織中的表達(dá)顯著高于直腸組織，ARHGAP8的表達(dá)水平在新輔助化療后顯著低于化療前。免疫組織化學(xué)檢測顯示在TRG 0～2級中，ARHGAP8的表達(dá)在新輔助化療后顯著降低，而在TRG 3級中，新輔助化療前后ARHGAP8的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ARHGAP8表達(dá)的變化與XELOX方案新輔助化療療效趨勢一致，療效好及療效差患者治療后ARHGAP8表達(dá)均降低，提示TRG分級0～2級的化療后表達(dá)明顯降低，TRG分級3級的化療后表達(dá)無差異；治療有效患者治療后ARHGAP8表達(dá)均降低，無效患者治療前后無差異，且ARHGAP8低表達(dá)的直腸癌患者對XELOX方案新輔助化療更為敏感，ARHGAP8低表達(dá)的中低位局部進(jìn)展期直腸癌患者對XELOX方案新輔助化療更為敏感。

綜上，本研究通過生物信息學(xué)分析及臨床驗(yàn)證，為直腸癌發(fā)生進(jìn)展挖掘新的生物學(xué)指標(biāo)，同時為中低位進(jìn)展期直腸癌XELOX方案新輔助化療提供可靠的預(yù)測指標(biāo)，從而精準(zhǔn)指導(dǎo)臨床治療。但本研究僅限于臨床水平，缺少后續(xù)一系列的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)佐證，且樣本數(shù)量相對較少，需要多中心、大樣本的支持，這也是今后的研究方向。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 郗宇寧：參與實(shí)驗(yàn)與論文撰寫；薛軍：論文設(shè)計(jì)指導(dǎo)，總體規(guī)劃；武雪亮：論文設(shè)計(jì)指導(dǎo)及修改；屈明：提供部分?jǐn)?shù)據(jù)，提出實(shí)驗(yàn)思路；孫光源：進(jìn)行部分設(shè)計(jì)，通體修改；韓磊：提供部分?jǐn)?shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；郭飛：進(jìn)行部分統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；張春澤：提出部分修改意見，指導(dǎo)修改；王一飛：參與部分?jǐn)?shù)據(jù)收集整合；梁衛(wèi)政：指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-10-24）