摘要：目的" 探究針灸百會(huì)、足三里穴對(duì)慢性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）誘發(fā)抑郁樣行為小鼠的抗抑郁效應(yīng)及其與腸道菌群變化的關(guān)聯(lián)。方法" 60只小鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組、對(duì)照+針灸組、CUMS組和CUMS+針灸組。CUMS和CUMS+針灸組進(jìn)行為期6周的CUMS處理，CUMS處理的后3周對(duì)對(duì)照+針灸組和CUMS+針灸組小鼠每天進(jìn)行20 min的百會(huì)和足三里穴針灸；使用糖水偏愛和懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠的抑郁樣行為；行為結(jié)束后取小鼠糞便使用16S rRNA基因測(cè)序檢測(cè)腸道菌群組成。結(jié)果" 單純針灸對(duì)小鼠糖水偏愛和懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間無(wú)影響（P＞0.05）；CUMS導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，糖水偏愛率降低（P＜0.001）和懸尾不動(dòng)時(shí)間增長(zhǎng)（P＝0.003）；針灸百會(huì)和足三里穴使得CUMS+針灸組小鼠相比于CUMS組小鼠糖水偏愛率升高（P＝0.035）和懸尾不動(dòng)時(shí)間減少（P＝0.045）；針灸和CUMS并未導(dǎo)致小鼠腸道菌群豐富度發(fā)生變化（P＞0.05），但導(dǎo)致腸道菌群組成發(fā)生顯著變化（P＝0.002）；CUMS導(dǎo)致腸道Patulibacter等6個(gè)菌屬豐度升高，F(xiàn)aecalibacterium等26個(gè)菌屬豐度降低（P＜0.05）；CUMS+針灸組相比于CUMS組Faecalibacterium等10個(gè)菌屬豐度升高，Patulibacter等4個(gè)菌屬豐度降低（P＜0.05）；四組小鼠有其各自的特征性腸道菌群；CUMS組相比于對(duì)照組視黃醇代謝、泛素系統(tǒng)、N-聚糖生物合成和類固醇荷爾蒙生物合成、細(xì)胞凋亡和產(chǎn)熱作用等基因功能顯著富集（P＜0.05），而針灸導(dǎo)致CUMS+針灸組小鼠以上腸道菌群基因功能富集程度降低（P＜0.05）。結(jié)論" 針灸百會(huì)和足三里穴具有抗抑郁效應(yīng)，且可使抑郁導(dǎo)致的腸道菌群紊亂部分恢復(fù)；針灸百會(huì)和足三里穴可能通過(guò)影響腸道菌群組成及視黃醇、泛素、N-聚糖和類固醇等代謝功能從而發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：抑郁癥；針灸；腸道菌群；百會(huì)穴；足三里穴

中圖分類號(hào)：R74""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202403020

收稿日期：2023-09-25" 修回日期：2024-03-24

基金項(xiàng)目：陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No.2021GXLH-Z-083）

Supported by the Key Research and Development Program of Shaanxi Province （No. 2021GXLH-Z-083）

通信作者：朱峰，教授. E-mail：zhufeng1982@xjtu.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240405.1524.004.html （2024-04-08）

Acupuncture of Baihui and Zusanli acupoints alleviates depressive-like

behavior in mice and its association with gut microbiota

TIAN Jiarong1，2， SUN Dunbao2， SUN Dunhua3， ZHU Feng1

（1. Department of Psychiatry and Psychology， The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong

University， Xi’an 710061; 2. Department of Psychiatry， Ankang Central Hospital， Ankang 725000;

3. Department of Psychiatry， Xunyang City Caring Federation Boai Hospital， Ankang 725700， China）

ABSTRACT： Objective" To explore the antidepressant effects of acupuncture at Baihui and Zusanli acupoints on mice with chronic unpredictable mild stress （CUMS）-induced depressive-like behavior and its association with changes in gut microbiota. Methods" Sixty mice were randomly divided into four groups： control group （Ctrl）， control+acupuncture group （Ctrl+AP）， CUMS group， and CUMS+acupuncture group （CUMS+AP）. The CUMS and CUMS+AP groups underwent 6-week CUMS treatment. During the last three weeks of CUMS， mice in the Ctrl+AP and CUMS+AP groups received 20 minutes of acupuncture at Baihui and Zusanli acupoints daily. Sucrose preference test and tail suspension test were used to assess the depressive-like behavior in mice. After the behavioral tests， fecal samples were collected from the mice， and the gut microbiota composition was analyzed using 16S rRNA gene sequencing. Results" Acupuncture alone had no effect on sucrose preference or tail suspension test results in mice （P＞0.05）. CUMS induced depressive-like behavior in mice， as evidenced by decreased sucrose preference （P＜0.001） and increased immobility time in the tail suspension test （P＝0.003）. The CUMS+AP group showed increased sucrose preference （P＝0.035） and decreased immobility time in the tail suspension test （P＝0.045） compared to the CUMS group. Acupuncture and CUMS did not alter the richness of gut microbiota in mice （P＞0.05）， but they caused significant changes in gut microbiota composition （P＝0.002）. CUMS increased the abundance of six bacterial genera， including Patulibacter， and decreased the abundance of 26 bacterial genera， including Faecalibacterium （P＜0.05）. The CUMS+AP group showed increased abundance of 10 bacterial genera， including Faecalibacterium， and decreased abundance of four bacterial genera， including Patulibacter， compared to the CUMS group （P＜0.05）. Each group of mice had specific gut microbiota. The CUMS group showed significant enrichment of gene functions related to retinol metabolism， ubiquitin system， N-glycan biosynthesis， steroid hormone biosynthesis， apoptosis， and thermogenesis compared to the control group （P＜0.05）， while acupuncture reduced the enrichment of these gene functions in the CUMS+AP mice （P＜0.05）. Conclusion" Acupuncture at Baihui and Zusanli acupoints has antidepressant effects and can partially restore the depression-induced dysbiosis of gut microbiota. Acupuncture at Baihui and Zusanli acupoints may exert antidepressant effects by influencing gut microbiota composition and metabolism functions of retinol， ubiquitin， N-glycan， and steroids.

KEY WORDS： depression; acupuncture; gut microbiota; Baihui acupoint; Zusanli acupoint

抑郁癥是一種以負(fù)性情緒為主要特征，致殘、致死率高的慢性精神障礙。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球超過(guò)3.5億人患有抑郁癥［1-2］，我國(guó)抑郁癥發(fā)病率約6.8%［3］，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)，是世界范圍的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。抑郁癥發(fā)病受遺傳和環(huán)境等因素共同調(diào)節(jié)，其機(jī)制目前仍不完全清楚，給抑郁癥有效防治帶來(lái)重大挑戰(zhàn)。近來(lái)證據(jù)表明，腸道菌群可通過(guò)代謝物、免疫信號(hào)和神經(jīng)內(nèi)分泌等直接和間接途徑與大腦實(shí)現(xiàn)雙向交流，腸道菌群參與了包括抑郁癥在內(nèi)的多種精神疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［4］。益生菌療法可通過(guò)其代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗抑郁效果［5］，因此，腸道菌群有望成為治療和改善抑郁等精神障礙的新靶點(diǎn)。此外，研究發(fā)現(xiàn)針灸可以通過(guò)影響腸道菌群組成從而改善抑郁樣癥狀，針灸上星和大陵穴可通過(guò)影響腸道菌群和神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)［6］；電針刺激百會(huì)和素髎穴改善抑郁樣行為與乳酸菌和葡萄球菌豐度相關(guān)［7］。然而，針灸不同穴位的抗抑郁效應(yīng)及其腸-腦軸機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究擬使用慢性溫和刺激（chronic unpredic-table mild stress，CUMS）建立小鼠抑郁模型，首先明確針灸百會(huì)和足三里穴對(duì)抑郁樣行為的改善效應(yīng)，進(jìn)而分析抑郁樣行為導(dǎo)致的腸道菌群組成變化及針灸對(duì)其的干預(yù)作用，最后探究與抑郁樣行為及針灸緩解抑郁樣癥狀相關(guān)的腸道菌群基因功能，初步揭示腸道菌群紊亂與抑郁樣行為的關(guān)聯(lián)及針灸通過(guò)調(diào)控腸道菌群改善抑郁樣行為的潛在機(jī)制。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步揭示針灸改善抑郁癥療效的潛在機(jī)制，從中醫(yī)針灸和腸道菌群角度開發(fā)抗抑郁新療法具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只無(wú)特殊病原微生物（specific pathogen free，SPF）C57BL/6J小鼠（8周齡，體質(zhì)量23～28 g）購(gòu)買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中，每籠5只，飼養(yǎng)環(huán)境維持在溫度（21±2）℃，濕度（50±10）%，早7點(diǎn)至晚19點(diǎn)給予照明，動(dòng)物可自由攝入無(wú)菌飲水和飼料。在飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)2周后將動(dòng)物隨機(jī)分為：對(duì)照組、對(duì)照+針灸組、CUMS組和CUMS+針灸組，每組15只。本研究所有實(shí)驗(yàn)操作均符合西安交通大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定并得到許可。

1.2" 慢性溫和刺激模型

CUMS組和CUMS+針灸組小鼠進(jìn)行為期6周的CUMS。CUMS包括：禁食24 h、束縛2 h、晝夜顛倒24 h、潮濕墊料24 h、冷水（4 ℃）游泳5 min、鼠籠傾斜（45°）24 h、夾尾3 min，每天隨機(jī)選擇上述3種處理方式刺激小鼠。對(duì)照組和對(duì)照+針灸組動(dòng)物正常飼養(yǎng)（飼養(yǎng)條件包括溫度、濕度、照明、飲食等如1.1項(xiàng)中所述），所有動(dòng)物不做任何刺激處理。

1.3" 針灸百會(huì)和足三里穴

CUMS造模的后3周，對(duì)照+針灸組、CUMS+針灸組每天給予百會(huì)和足三里穴位針灸20 min，每5 min順時(shí)針或逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)針頭180°以增強(qiáng)針刺效果；針灸療程為3周，每日1次（參考既往研究并稍作調(diào)整）［7-8］。百會(huì)（GV20）穴位置為頂骨正中；足三里穴（ST36）位置為膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約2 mm，雙側(cè)針刺。下針角度與皮膚平面垂直，深度為2～3 mm。對(duì)照組和CUMS組動(dòng)物不做任何針灸處理。

1.4" 行為學(xué)檢測(cè)

本研究采用糖水偏愛和懸尾實(shí)驗(yàn)評(píng)估四組所有小鼠的抑郁樣行為。糖水偏愛實(shí)驗(yàn)小鼠單籠飼養(yǎng)，第1天給予兩瓶10 g/L的蔗糖溶液；第2天給予1瓶10 g/L的蔗糖溶液和1瓶正常飲水雙瓶自由選擇，隔12 h將糖水和正常水更換位置以防形成位置偏愛；第3天禁水不禁食12 h后進(jìn)行為期24 h的糖水偏愛測(cè)試，測(cè)試期間12 h后更換糖水和正常水位置，記錄小鼠24 h內(nèi)的糖水消耗量和液體總消耗量，糖水偏愛率＝糖水消耗量/（糖水消耗量+正常水消耗量）×100%。懸尾實(shí)驗(yàn)將小鼠尾部朝上頭部朝下尾尖部固定在懸尾裝置上6 min（第1分鐘為適應(yīng)期），視頻記錄小鼠5 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間，Anymaze軟件輔以人工記錄小鼠的不動(dòng)時(shí)間。

1.5" 糞便DNA提取及16S rRNA基因測(cè)序

使用糞便DNA提取試劑盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit）按照說(shuō)明書提取小鼠的糞便DNA，Qubit 3.0儀器進(jìn)行溶度測(cè)定并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA的質(zhì)量。使用341F（CCTACGGG NGGCWGCAG）和806R（GGACTACHVGGG TATCTAAT）引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)域，再用磁珠分選純化相應(yīng)長(zhǎng)度的擴(kuò)增子片段，隨后給擴(kuò)增子片段加上測(cè)序引物，經(jīng)過(guò)純化和文庫(kù)合并后，使用DNBSEQ-T7測(cè)序儀進(jìn)行擴(kuò)增子片段測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)使用FLASH 2、Trimmomatic和UCHIME v4.2等軟件將序列拼接并去除低質(zhì)量和冗雜序列，使用QIIME 2軟件將相似性大于97%的序列聚類獲得操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT），將OUT與微生物參考基因組比對(duì)進(jìn)行物種（界、門、綱、目、科、屬）注釋。采用Mothur軟件獲得α多樣性指標(biāo)，QIIME 2軟件進(jìn)行β多樣性分析。

1.6" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

行為學(xué)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行分析和作圖，糖水偏愛率和懸尾時(shí)間使用方差分析結(jié)合多重比較進(jìn)行組間差異分析。對(duì)于16S數(shù)據(jù)通過(guò)R語(yǔ)言進(jìn)行分析，使用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)分析α多樣性及物種豐度的組間差異；β多樣性使用相似性分析和多變量方差置換分析（permutational multivariate analysis of variance， PERMANOVA）進(jìn)行比較；各組的特征性腸道菌群使用線性判別分析效應(yīng)大?。╨inear discriminant analysis Effect Size， LEfSe）來(lái)確定［線性判別分析效應(yīng)值linear discriminant analysis （LDA）＞4］；使用PICRUSt軟件將組間豐度差異的OUT序列與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)獲得組間差異富集的腸道菌群基因功能。Plt;0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的閾值。

2" 結(jié)" 果

2.1" 針灸百會(huì)和足三里穴對(duì)小鼠抑郁樣行為的影響

2.2" CUMS及針灸百會(huì)和足三里穴對(duì)小鼠腸道菌群組成的影響

2.3" 各組小鼠的特征性腸道菌群

2.4" CUMS及針灸百會(huì)和足三里穴導(dǎo)致小鼠的腸道菌群基因功能變化

3" 討" 論

腸道菌群紊亂與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)［4］，中醫(yī)針灸可通過(guò)腸-腦軸機(jī)制改善抑郁狀態(tài)［7，9］。然而，不同穴位配伍的抗抑郁效果及其對(duì)腸道菌群的影響、不同穴位針灸抗抑郁的作用機(jī)制目前所知尚少。本研究發(fā)現(xiàn)，針灸百會(huì)和足三里穴可顯著改善小鼠CUMS導(dǎo)致的抑郁樣行為，包括糖水偏愛率降低和懸尾實(shí)驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)；CUMS導(dǎo)致腸道菌群組成發(fā)生變化，針灸可使CUMS導(dǎo)致的腸道菌群紊亂部分恢復(fù)；對(duì)照、對(duì)照+針灸、CUMS和CUMS+針灸組均有其各自特異的腸道微生物種類；視黃醇代謝、泛素系統(tǒng)和N-聚糖生物合成等腸道菌群基因功能與抑郁發(fā)生相關(guān)，針灸改善抑郁樣癥狀與細(xì)胞凋亡、視黃醇代謝和N-聚糖生物合成等腸道菌群基因功能相關(guān)。本研究為針灸百會(huì)和足三里穴可能通過(guò)影響腸道菌群和代謝從而發(fā)揮抗抑郁效果提供了初步證據(jù)。

針灸發(fā)揮抗抑郁效果已有大量研究報(bào)道［10］。前期研究發(fā)現(xiàn)，針灸上星和大陵穴可改善CUMS導(dǎo)致的大鼠抑郁樣行為［6］，電針刺激百會(huì)和素髎穴可通過(guò)影響腸道菌群改善CUMS小鼠的抑郁樣癥狀［7］。本研究的結(jié)果表明針灸百會(huì)和足三里穴同樣可以發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)，且該效應(yīng)與腸道菌群組成變化相關(guān)。

腸道菌群紊亂與抑郁存在雙向關(guān)聯(lián)，抑郁發(fā)生導(dǎo)致腸道菌群紊亂，腸道菌群反過(guò)來(lái)也可影響抑郁狀態(tài)。前期研究證據(jù)表明，青壯年重度抑郁患者腸道菌群組成發(fā)生顯著變化［2］，干酪乳桿菌補(bǔ)充可通過(guò)影響腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等表達(dá)緩解大鼠應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁和焦慮［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然CUMS及針灸百會(huì)和足三里穴均未改變腸道菌群的豐富度，但兩者均導(dǎo)致腸道菌群組成發(fā)生顯著變化。CUMS小鼠相比于對(duì)照小鼠Bacteroides豐度升高，Ruminococcaceae UCG-013、Faecalibacterium和Lachnospiraceae UCG-001豐度在CUMS組低于對(duì)照組，這與前期研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者Bacteroides豐度升高［12］、Ruminococcus菌群豐度降低［13］相一致。針灸百會(huì)和足三里穴使得CUMS+針灸組小鼠腸道Ruminococcaceae UCG-013、Faecalibacterium和Lachnospiraceae UCG-001豐度相比于CUMS組上調(diào)。CUMS組相比于對(duì)照組Patulibacter豐度升高，CUMS+針灸組相比于CUMS組Patulibacter豐度降低，CUMS導(dǎo)致的腸道菌群紊亂在針灸百會(huì)和足三里穴治療后得到一定程度的恢復(fù)。

近來(lái)證據(jù)顯示特征性腸道菌群可作為多種疾病的潛在標(biāo)志物，包括阿爾茨海默病和抑郁癥等［14-15］。一項(xiàng)關(guān)于泰國(guó)重度抑郁患者的腸道菌群研究表明，Ruminococcus菌群豐度的減少可作為重度抑郁的潛在標(biāo)志物［13］。本研究同樣表明，CUMS組小鼠Ruminococcaceae UCG-013豐度相比于對(duì)照組降低，Burkholderiales菌目和Clostridium sp A3LF 105b菌種是CUMS組小鼠的特征性腸道菌群；CUMS小鼠針灸后Enterorhabdus和Eggerthella菌屬成為主要的特征性菌群。

腸道菌群可通過(guò)代謝物、炎癥信號(hào)等發(fā)揮對(duì)遠(yuǎn)端器官如腦功能的調(diào)控作用［16］。CUMS組小鼠相比于對(duì)照組視黃醇代謝、泛素系統(tǒng)、N-聚糖生物合成和類固醇荷爾蒙生物合成、細(xì)胞凋亡和產(chǎn)熱作用等基因功能顯著富集，而針灸治療后CUMS小鼠以上腸道菌群基因功能富集程度降低。因此，我們推測(cè)，針灸百會(huì)和足三里穴發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制可能與視黃醇、泛素、N-聚糖和類固醇等代謝功能相關(guān)。

本研究尚存在一些不足之處：首先，使用擴(kuò)增子測(cè)序的方法菌群分辨率只能達(dá)到屬水平，對(duì)種水平的定義不夠準(zhǔn)確進(jìn)而對(duì)菌群基因功能的預(yù)測(cè)也造成一定影響；其次，研究結(jié)果只揭示了CUMS及針灸與腸道菌群的關(guān)聯(lián)，深層次的因果關(guān)系尚需要進(jìn)一步研究確定；再者，關(guān)于針灸百會(huì)和足三里穴改善抑郁樣癥狀的機(jī)制并未深刻闡釋，未來(lái)研究可以從代謝、炎癥信號(hào)、神經(jīng)內(nèi)分泌等腸-腦軸通路結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控等機(jī)制進(jìn)行深入探討。

綜上所述，針灸百會(huì)和足三里穴可改善CUMS導(dǎo)致的抑郁樣行為，并使得CUMS導(dǎo)致的腸道菌群紊亂得到一定程度的恢復(fù)。針灸百會(huì)和足三里穴可能通過(guò)影響腸道菌群組成及視黃醇、泛素、N-聚糖和類固醇等代謝功能從而發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。

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（編輯" 張" 敏）