摘要：

目的" 為解決聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）/β-TCP骨組織工程支架表面親水性不足的問(wèn)題，通過(guò)NaOH蝕刻法改善3D打印PCL/β-TCP支架表面微形貌，進(jìn)一步影響其親水性和細(xì)胞反應(yīng)。方法" 采用3D 打印熔融沉積成型（fused deposition modeling，F(xiàn)DM）技術(shù)制備PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架，通過(guò)NaOH蝕刻法進(jìn)行支架表面粗糙化改性，觀察NaOH濃度、時(shí)間2項(xiàng)反應(yīng)參數(shù)對(duì)支架改性前、后在微觀形貌、能譜元素、接觸角、壓縮強(qiáng)度、細(xì)胞黏附等性能方面的影響。結(jié)果" 經(jīng)NaOH蝕刻后成功制備PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架表面微孔結(jié)構(gòu)。隨著NaOH濃度、時(shí)間任一種參數(shù)的增加均會(huì)導(dǎo)致支架表面微孔增大、材料表面接觸角減小，但NaOH處理參數(shù)為1 mol/L（24 h）或10 mol/L（6 h）的蝕刻支架，其壓縮強(qiáng)度與未處理組對(duì)比，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.071）；蝕刻支架上細(xì)胞數(shù)目增多，單個(gè)細(xì)胞鋪展面積大，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）黏附增殖上更具優(yōu)勢(shì)。結(jié)論" 采用NaOH蝕刻法改善3D打印PCL/β-TCP骨組織工程支架親水性的方法是一種低成本的有效策略，可有效改善支架濕潤(rùn)性和細(xì)胞黏附。

關(guān)鍵詞：聚己內(nèi)酯（PCL）/β-TCP；3D打??；骨組織工程支架；NaOH；親水性

中圖分類號(hào)：TQ323.4；R318.08""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202403023

收稿日期：2023-12-15" 修回日期：2024-01-26

基金項(xiàng)目：陜西省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目（No. 2024SF-YBXM-271）；西安醫(yī)學(xué)院科研能力提升計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2022NLTS085）；陜西省教育廳青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 22JP078）；口頜系統(tǒng)疾病機(jī)制及防治創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（No. 2022TD-54）

Supported by the Key Ramp;D Program General Project of Shaanxi Provincial Department of Science and Technology （No. 2024SF-YBXM-271）， Research Ability Enhancement Program of Xi’an Medical University （No. 2022NLTS085）， Youth Innovation Team Project of Shaanxi Provincial Department of Education （No. 22JP078） and Innovation Team for Mechanism and Prevention of Oral and Maxillofacial System Diseases （No. 2022TD-54）

通信作者：劉昌奎，教授. E-mail：liuchangkui@xiyi.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240325.1126.004.html （2024-04-16）

Improving the surface hydrophilicity and performance of 3D printed PCL/β-TCP

mesh support by sodium hydroxide alkali etching method

GUO Fang1， ZENG Hui1， HUANG Shuo1， LIU Ning1，

GUO Yayuan1， ZHANG Yuqi2， LIU Changkui1

（1. Research Center of Tooth and Maxillofacial Tissue Regeneration and Restoration，

School of Stomatology of Xi’an Medical College， Xi’an 710021;

2. School of Stomatology， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China）

ABSTRACT：

Objective" To solve the problem of insufficient hydrophilicity on the surface of polycaprolactone （PCL）/β-TCP bone tissue engineering scaffolds， NaOH etching method was used to improve the surface microstructure of 3D printed PCL/β-TCP scaffolds， further affecting their hydrophilicity and cell response. Methods" PCL/β-TCP mesh scaffolds were prepared using 3D printing melt deposition molding technology， and the surface roughness of the scaffolds was modified by NaOH etching. The effects of two reaction parameters， NaOH concentration and time， on the microstructure， spectral elements， contact angle， compressive strength， and cell adhesion of the scaffolds before and after modification were observed. Results" After NaOH etching， the surface microporous structure of the mesh scaffold was successfully prepared. With the increase of either NaOH concentration or time， the surface micropores of the scaffold increased while the contact angle of the material surface decreased. However， the compression strength of the etched scaffold treated with NaOH for 1 mol/L （24 h） or 10 mol/L （6 h） was not statistically significant compared to the untreated group （Pgt;0.05）. The number of cells on the etched scaffold increased， with a larger spreading area of individual cells， making it more advantageous in the adhesion and proliferation of BMSCs. Conclusion" The use of NaOH etching to improve the hydrophilicity of 3D printed PCL/β-TCP bone tissue engineering scaffolds is a low-cost and effective strategy which can effectively improve the wettability and cell adhesion of the scaffolds.

KEY WORDS： polycaprolactone （PCL）/β-tricalcium; 3D printing; bone tissue engineering scaffold; NaOH; hydrophilicity

由于腫瘤、創(chuàng)傷或感染等造成的骨缺損患者數(shù)量在不斷增加［1］。盡管重建方法很多，但均有一定缺點(diǎn)，如自體骨移植增加二次創(chuàng)傷，異體骨移植存在免疫排斥反應(yīng)、成骨速度慢等［2］。隨著人工骨和3D打印技術(shù)的相繼出現(xiàn)，骨移植替代物的研制被更多的臨床醫(yī)師及科研人員關(guān)注［3-4］。

聚己內(nèi)酯（PCL）是一種聚合物支架材料，具有優(yōu)良的生物相容性和可降解性，與3D打印技術(shù)，尤其是與熔融沉積成型（FDM）技術(shù)結(jié)合時(shí)，具有極強(qiáng)的可塑性，適合作為骨組織工程支架的主體材料［5］。為了改善其本身生物活性差的缺點(diǎn)，常在PCL中添加諸如磷酸三鈣等生物陶瓷材料，以增強(qiáng)材料的誘導(dǎo)成骨性或生物力學(xué)強(qiáng)度。PCL和10% β-TCP 結(jié)合的方式已在體內(nèi)外廣泛研究并用于骨組織工程［6］。然而，與其他脂肪族聚合物一樣，該類支架仍然顯示出較高的疏水性，從而導(dǎo)致支架表面缺乏細(xì)胞附著的識(shí)別位點(diǎn)。研究表明，改變支架表面形貌，可直接影響附著于支架表面細(xì)胞的增殖和分化行為，增加支架表面的粗糙度對(duì)細(xì)胞的成骨分化具有促進(jìn)作用［7］。已有學(xué)者通過(guò)蛋白質(zhì)涂層、等離子體技術(shù)等改善骨組織工程親水性的策略［8］。然而綜合時(shí)間成本、技術(shù)復(fù)雜程度、設(shè)備經(jīng)費(fèi)等問(wèn)題，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單的、能夠有效改善PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架親水性的方法是十分必要的。

本研究設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單有效的NaOH蝕刻方法，通過(guò)調(diào)整NaOH處理時(shí)間、濃度2個(gè)參數(shù)系統(tǒng)研究NaOH對(duì)PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架表面微孔生成、親水性及壓縮強(qiáng)度的影響，獲得較理想的NaOH反應(yīng)參數(shù)，即可增加支架表面粗糙度、顯著改善其親水性，機(jī)械強(qiáng)度損失又小，并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在蝕刻支架表面微結(jié)構(gòu)上的黏附數(shù)量及黏附形態(tài)，為改善3D打印PCL/β-TCP骨組織工程支架表面親水性提供一種簡(jiǎn)單、低成本的有效策略。

1" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)材料

PCL（吉林省科瑞斯生物科技有限公司，中國(guó)）；β-TCP（南京埃普瑞納米材料有限公司，中國(guó)）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；青霉素（Hyclone，美國(guó)）；鏈霉素（Hyclone，美國(guó)）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）；NaOH（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）。

1.2" 實(shí)驗(yàn)儀器

3D打印機(jī)（Professor 300，中國(guó)）；掃描電子顯微鏡（SEM）（Sigma 300，ZEISS，德國(guó)）；光學(xué)顯微鏡（TS100，尼康，日本）；電動(dòng)液壓伺服機(jī)械測(cè)試機(jī)（SANS CMT4304，MTS公司，美國(guó)）；接觸角測(cè)量?jī)x（OCA20，Dataphysics公司，德國(guó)）。

1.3" 3D打印PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架的制備

1.4" NaOH蝕刻及分組

3D打印PCL/β-TCP支架用去離子水清洗后加入不同濃度（mol/L）的NaOH溶液，將樣件固定，在室溫下進(jìn)行不同時(shí)間（h）的處理。NaOH處理參數(shù)為濃度（mol/L）［時(shí)間（h）］，分別為：0 mol/L（0 h）、0.5 mol/L（24 h）、1 mol/L（24 h）、5 mol/L（24 h）、10 mol/L（6 h）、10 mol/L（12 h）、10 mol/L（24 h）。處理完成后取出支架，流水徹底沖洗，再用去離子水離心清洗3次，于37 ℃烘箱內(nèi)烘干。

1.5" 復(fù)合支架的形貌表征檢測(cè)

通過(guò)SEM和能色散光譜（EDS）檢測(cè)支架表面的形貌和元素。使用Oxford Quorum SC7620濺射鍍膜儀噴金，使用SEM觀察不同處理?xiàng)l件下支架的表面形貌特征，同時(shí)利用EDS對(duì)樣品表面元素進(jìn)行分析。形貌拍攝時(shí)加速電壓為3 kV，能譜拍攝時(shí)加速電壓為15 kV。

1.6" 支架的力學(xué)性能測(cè)試

單軸壓縮實(shí)驗(yàn)參照GB/T1041-2008進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試25%應(yīng)變對(duì)應(yīng)的壓縮強(qiáng)度，測(cè)試速度１ mm/min。使用電動(dòng)液壓伺服機(jī)械測(cè)試機(jī)對(duì)7組支架進(jìn)行壓縮性能測(cè)試，每組測(cè)試3個(gè)樣本。

1.7" 支架的親水性測(cè)試

將7組材料置于JY-82接觸角測(cè)試平臺(tái)，利用設(shè)備自動(dòng)滴定系統(tǒng)滴上水滴，每次滴液量為2 μL，拍攝獲得靜態(tài)圖像，用量角法量取接觸角角度。每組設(shè)置3個(gè)平行樣本。

1.8" 支架表面細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將7組3D打印PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架在PBS中超聲沖洗、干燥、60Co輻照滅菌。SD大鼠BMSCs為本實(shí)驗(yàn)室凍存，本研究采用3～5代BMSCs用于體外評(píng)估。將BMSCs細(xì)胞以5×104cells/mL的密度滴種于網(wǎng)狀支架表面，

2 h后再向孔板中加入500 μL 100mL/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h、24 h，PBS清洗后用25mL/L戊二醛固定細(xì)胞1 h，然后無(wú)水乙醇梯度脫水。SEM拍照并觀察支架表面黏附細(xì)胞情況。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.9" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。測(cè)量值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Shapiro-Wilk法和F檢驗(yàn)分別檢測(cè)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。各組PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架親水性和力學(xué)差異應(yīng)用單因素方差分析法（One-way ANOVE）進(jìn)行均數(shù)比較，若任一項(xiàng)不符合則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 支架成分分析

2.2" 支架形貌分析

2.3" 親疏水性分析

1 mol/L（24 h）、5 mol/L（24 h）、10 mol/L（6 h）、10 mol/L（12 h）組水接觸角在40°～80°之間，當(dāng)高濃度長(zhǎng)時(shí)間蝕刻［10 mol/L（24 h）］時(shí)則會(huì)導(dǎo)致水接觸角為（37.13±1.63）°，水接觸角＜40°。

與0 mol/L（0 h）組相比，*Plt;0.05；***Plt;0.001。

2.4" 抗壓強(qiáng)度測(cè)試

各組支架的抗壓強(qiáng)度如表1所示。由表可知，隨著NaOH處理強(qiáng)度的增大，支架的抗壓強(qiáng)度減小。當(dāng)NaOH處理時(shí)間為24 h，處理濃度在1 mol/L內(nèi)，對(duì)支架的抗壓強(qiáng)度未產(chǎn)生顯著影響（Pgt;0.05）；處理濃度大于5 mol/L，支架的抗壓強(qiáng)度則顯著減?。≒lt;0.05）。當(dāng)NaOH處理濃度均為10 mol/L時(shí)，短時(shí)間處理（6 h）未對(duì)支架的抗壓強(qiáng)度產(chǎn)生顯著影響（P=0.071），但長(zhǎng)時(shí)間處理后，支架的抗壓強(qiáng)度顯著下降（Plt;0.05）。

2.5" 支架表面細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

3" 討" 論

盡管3D打印技術(shù)在實(shí)現(xiàn)骨移植物制造的復(fù)雜幾何形狀方面取得了成功，但在植入物-生物表面方面仍不夠理想。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，同時(shí)存在宏觀孔隙和微觀孔隙的支架更有利于組織長(zhǎng)入、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及血管化［9］。本研究采用3D打印熔融沉積的方式成功制備出具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的PCL/β-TCP 骨組織工程支架，其雖有預(yù)先設(shè)計(jì)的宏觀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)也相互連通，但缺乏微觀孔隙。NaOH預(yù)處理是一種改善支架表面微結(jié)構(gòu)、調(diào)整支架物理和生物性能的有效方法［10］。該方法遵循表面水解機(jī)制，與本體水解相比，NaOH擴(kuò)散到聚合物中的速率低于表面水解速率［11］，可以避免批量水解而導(dǎo)致的羧酸和低聚物的快速釋放，從而降低了機(jī)體突發(fā)炎癥等不良反應(yīng)的概率［12］。同時(shí)，通過(guò)表面水解方式，材料的整體性質(zhì)（如分子量）可保持不變。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)NaOH處理后的PCL/β-TCP支架表面上出現(xiàn)了明顯的微觀孔洞。此外，EDS結(jié)果表明，固相NaOH晶體戳入聚合物表面，從而在表面產(chǎn)生凹坑和孔洞。SEM結(jié)果表明，隨著處理濃度或處理時(shí)間的增加，聚合物表面不僅表現(xiàn)出孔隙數(shù)量增加，還表現(xiàn)為孔隙的體積增大。推測(cè)可能是因?yàn)榈蜐舛萅aOH處理時(shí)，僅存在聚合物鏈斷裂而導(dǎo)致的表面粗糙、多孔，但隨著NaOH濃度增加或處理時(shí)間延長(zhǎng)，PCL主鏈的水解斷裂與固相NaOH晶體的作用相結(jié)合，甚至?xí)霈F(xiàn)β-TCP的析出，從而導(dǎo)致聚合物表面形成更大更深的孔。NaOH濃度較低時(shí)，NaOH針狀結(jié)構(gòu)在表面均勻分散，高濃度時(shí)，NaOH針狀結(jié)構(gòu)聚集成簇，形成較大的孔隙。由于NaOH晶體粘在聚合物表面，因此在進(jìn)行任何表征方法之前，徹底清洗支架是十分必要的。

材料表面粗糙度會(huì)影響細(xì)胞的增殖和分化［13-15］。與親水性聚合物相比，在具有疏水表面的聚合物上，成骨細(xì)胞表現(xiàn)出較低的增殖率和較高的凋亡率［16］。本研究主要觀察了 NaOH 濃度和反應(yīng)時(shí)間兩個(gè)反應(yīng)參數(shù)對(duì)3D打印PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架表面微孔形成及親水性的影響，目的是在機(jī)械強(qiáng)度損失最小的情況下獲得較佳的NaOH反應(yīng)參數(shù)及其體外效果。親水性研究結(jié)果表明，未經(jīng)處理的PCL/β-TCP網(wǎng)狀支架表面呈現(xiàn)一定程度的疏水性，水接觸角gt;90°；經(jīng)不同NaOH反應(yīng)參數(shù)蝕刻后其水接觸角均顯著降低，且隨著處理濃度增加或處理時(shí)間延長(zhǎng)，支架表面水接觸角明顯減小。此外，另一個(gè)參數(shù)的適當(dāng)減小則可以抵消這一效應(yīng)。適度親水的表面（水接觸角為40°～80°）相較于過(guò)度疏水或親水的表面更有利于細(xì)胞黏附及增殖［17］。由測(cè)試結(jié)果可知，NaOH處理參數(shù)為1 mol/L（24 h）、5 mol/L（24 h）、10 mol/L（6 h）、10 mol/L（12 h）接觸角范圍在40°～80°。NaOH處理支架顯著降低了支架表面的接觸角，即增加了支架表面的潤(rùn)濕性。

理想的支架材料力學(xué)強(qiáng)度要適中，能夠承受得住生理壓力，為新生的組織提供較好的力學(xué)支撐［18］。從抗壓強(qiáng)度結(jié)果可以看出，低濃度或短時(shí)間NaOH處理對(duì)支架的力學(xué)性能影響較小，而高濃度或長(zhǎng)時(shí)間處理則會(huì)對(duì)支架的力學(xué)性能產(chǎn)生較大影響，尤其是當(dāng)NaOH濃度為10 mol/L，處理時(shí)間大于12 h時(shí)，支架的抗壓強(qiáng)度則從原來(lái)的（17.67±1.53）MPa下降到10 MPa以下，推測(cè)這時(shí)不僅伴有PCL主鏈的水解斷裂，也有β-TCP從聚合物內(nèi)析出，當(dāng)然，這從之前的SEM掃描結(jié)果中也得到了印證。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，7組支架在壓縮過(guò)程中均沒(méi)有發(fā)生碎裂，顯示出較好的韌性。因此，結(jié)合親水性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)NaOH的處理?xiàng)l件為1 mol/L（24 h）或10 mol/L（6 h）時(shí)，顯示出對(duì)力學(xué)性能影響較小且對(duì)細(xì)胞具有較強(qiáng)親和力的潛力。在之后的細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)也可以看出，與未蝕刻組對(duì)比，經(jīng)適度NaOH處理的支架顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞黏附能力，具有更好的生物相容性，這與支架表面的微孔形成和親水性增加是密不可分的。

綜上所述，通過(guò)FDM打印技術(shù)和NaOH表面處理，制備了相互連通的宏觀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及微觀表面多孔的三維PCL/β-TCP支架。NaOH蝕刻法不僅改善了PCL/β-TCP支架表面親水性，而且為BMSCs在支架上提供了更好的細(xì)胞附著和增殖能力，從而最終可能出現(xiàn)更好的植入物-生物表面。因此，采用NaOH蝕刻法改善3D打印PCL/β-TCP骨組織工程支架親水性的方法是一種低成本的有效策略，可有效改善支架濕潤(rùn)性和細(xì)胞黏附。

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（編輯" 陳" 波）