摘要：

目的" 探討麝香含藥血清對體外骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）遷移的作用及機制。方法" 將60只SD大鼠隨機分為麝香高、中、低劑量組，制備含藥血清，另設空白對照組。15只SD大鼠，分離培養(yǎng)BMSCs，將第3代BMSCs通過形態(tài)學、表型鑒定、成骨及成脂誘導后鑒定。采用高、中、低組（16.8、8.4、4.2 μL/100 g）麝香含藥血清干預BMSCs，培養(yǎng)不同時間，MTT法檢測細胞增殖情況；Transwell實驗檢測麝香含藥血清及蛋白激酶C（PKC）信號通路阻斷劑（GF109203X）干預對BMSCs體外遷移的影響。結果" 大鼠BMSCs貼壁生長，排列整齊規(guī)則，細胞活力好；表型鑒定顯示CD44、CD90陽性表達，CD45、CD34陰性表達；可分化為成骨、成脂細胞。不同濃度麝香組在不同時間點的BMSCs增殖率均高于空白對照組（Plt;0.05）；低濃度麝香組（4.2 μL/100 g）在24、48、72 h的BMSCs遷移數量較對照組明顯增加（Plt;0.05），低濃度麝香組+阻斷劑（GF109203X）組的不同時間點的遷移數量明顯減少，但各時間點的組間比較無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。結論" 麝香含藥血清可能通過活化PKC信號通路促進BMSCs遷移。

關鍵詞：麝香；骨髓間充質干細胞（BMSCs）；信號通路；增殖；機制

中圖分類號：R332""" 文獻標志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202403019

收稿日期：2023-09-17" 修回日期：2024-02-25

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No. 81460735，81860864，82160911）；甘肅省拔尖人才（科學技術領域）培養(yǎng)扶持資金項目（省委人才小組函［2021］2號）

Supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 81460735， 81860864， 82160911） and Project of Training and Supporting Top-notch Talents （Science and Technology） of Gansu Province （letter from the Provincial Party Committee on Talents ［2021］No. 2）

通信作者：謝興文，主任醫(yī)師，博士研究生導師. E-mail：827925272@qq.com

網絡出版地址：https：//link.cnki.net/urlid/61.1399.R.20240329.1317.002 （2024-03-29）

Mechanism of musk-containing serum in promoting the migration

of bone marrow mesenchymal stem cells

LI Yingfu1， XIE Xingwen2， LI Ning2， Shi Yanlong1

（1. Department of Trauma Orthopedics， Gansu Provincial Hospital of Traditional

Chinese Medicine， Lanzhou 730050; 2. Geriatrics Department， Affiliated Hospital of

Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

ABSTRACT：

Objective" To investigate the effect and mechanism of musk-containing serum on the migration of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）. Methods" Sixty SD rats were randomly divided into four groups： musk-high-， medium- and low-dose groups and blank control group; medicated serum was prepared. Fifteen SD rats were isolated and cultured with BMSCs， and the third generation of BMSCs were identified by morphology， phenotype， osteogenic and adipogenic induction. BMSCs received medicinal healing intervention with high-， medium- and low- （16.8， 8.4， and 4.2 μL/100 g） musk， and the cell proliferation rate was detected by MTT assay. Under the intervention of the protein kinase C （PKC） signaling pathway （GF109203X）， the effect of musk with pharmacition on the migration of BMSCSs was detected with the Transwell test. Results" The rat BMSCs were attached to the wall， with orderly arrangement and good cell viability. Phenotypic identification revealed that the expressions of CD44 and CD90 were positive， while the expressions of CD45 and CD34 were negative， and the cells could differentiate into osteoblasts and adipocytes. The proliferation rates of BMSCSs with different concentrations at different time periods were higher than those in the blank control group （Plt;0.05）. The number of BMSCs in the low-concentration musk group （4.2 μL/100 g） was significantly increased at 24 h， 48 h and 72 h after the addition of the blocking agent GF109203X （Plt;0.05）. The migration quantity of the low-concentration musk group + blocker group （GF109203X） significantly decreased at different time periods， and there was no significant difference between different time groups （Pgt;0.05）. Conclusion" The mechanism of musk-containing serum in promoting BMSCs migration may be related to the activation of PKC signaling pathway.

KEY WORDS： musk; bone marrow mesenchymal stem cell （BMSCs）; signal pathway; proliferation; mechanism

在交通運輸業(yè)快速發(fā)展過程中，意外事故引起的高能量肢體創(chuàng)傷的發(fā)生率增高，造成嚴重骨折、骨缺損、骨不愈合及骨感染等。雖然中醫(yī)藥關于促進骨折、骨缺損方面的研究眾多，但應用單體中藥或提取物對創(chuàng)面及周圍生長因子表達相關機制的研究鮮少。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）是組織工程研究領域中最有潛力的種子細胞，具有多向分化潛能和自我復制能力，能促進骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪等間充質組織的再生［1-2］。前期研究發(fā)現，麝香酮可促BMSCs在體內遷移至骨缺損處，并縮短缺損修復時間［3］。本研究通過體外細胞遷移實驗，觀察麝香促BMSCs體外遷移而加速骨缺損愈合的作用及其機制，為進一步了解BMSCs遷移調控途徑提供實驗依據，并為麝香應用于臨床治療骨科相關疾病提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 試劑及設備

麝香（蘭州安泰堂天順行藥業(yè)公司，批號：20151001）由甘肅中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室鑒定。氯胺酮（西安力邦制藥有限公司，國藥準字H20054749）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司，批號：17423078），DMEM/F12培養(yǎng)基（HyClone公司，批號：AAL208968），成骨誘導分化培養(yǎng)基試劑盒（Cyagen公司，批號：T160608G001），成脂誘導分化培養(yǎng)基試劑盒（Cyagen公司，批號：T160104G001）；堿性磷酸酶染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20160625）；茜素紅染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20160703）；

蛋白激酶C（PKC）信號通路阻斷劑GF109203X（Selleck公司，批號：S720801）。二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱（MCO-5AC型，日本三洋電機公司），超純水系統(tǒng)（NW型，北京Heal Force公司），自動攝像倒置相差顯微鏡（PW-30型，日本OLYMPUS公司），流式細胞檢測儀（COULTER EPICS XL，美國Beckman FAScan公司），Transwell小室（CORNING，美國Coring Costar）。

1.2" 實驗動物分組和含藥血清制備

SD大鼠60只，雌雄各30只，體質量（200±20）g，購于甘肅中醫(yī)藥大學SPF實驗中心。實驗動物質量合格證號：SCXK甘2015-0002。

60只SD大鼠隨機分組，每組15只，分別為麝香高、中、低（16.8、8.4、4.2 μL/100 g）劑量組及空白對照組（生理鹽水）。各組SD大鼠分別灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃8 d。高、中、低劑量麝香組分別灌胃相應濃度的麝香混懸液，將麝香充分研磨并加入生理鹽水稀釋至2.5 mL的混懸液灌胃，空白對照組灌服相同體積的生理鹽水。各組第8天灌胃2 h后，行腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，56 ℃水浴滅活過濾滅菌，獲得麝香含藥血清。分裝后―20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3" BMSCs體外分離、培養(yǎng)及鑒定

SD雄性大鼠15只，體質量（170±20）g，購于甘肅中醫(yī)藥大學SPF實驗中心。參照謝興文等［4］全骨髓貼壁篩選法，SD大鼠脫頸處死，無菌分離雙側股骨、脛骨，利用無菌紗布塊剝離附著于股骨、脛骨的軟組織與肌肉，剪去股骨、脛骨干骺端并顯露骨髓腔，用5 mL無菌注射器抽取含100 mL/L FBS、100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，將沖出的骨髓制成單細胞混懸液，過濾并按4 mL/皿接種于無菌的60 mm細胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。原代細胞隔天半量換液，連續(xù)更換2次，以后每3 d換液1次。待細胞達80%融合度時，用含0.2 g/L EDTA的2.5 g/L胰酶消化細胞并進行首次傳代，依次傳至P3代時可用于實驗。

細胞接種后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化情況。P3代細胞達到80%融合時，用胰酶消化細胞，將細胞懸液經過離心處理后加入一抗（CD34、CD45、CD90、CD44）及其同型對照各10 μL，37 ℃避光30 min，最后加入400 μL PBS，總體積為500 μL，上流式細胞儀進行檢測。

1.4" BMSCs的細胞成骨、成脂誘導

P3代細胞長至80%融合時，用胰酶消化細胞，調整細胞為2×104/cm2，接種在包被1 g/L明膠的6孔板中，同時按2 mL/每孔加入完全培養(yǎng)基，置入37 ℃，含50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當細胞達60%～70%融合度時，加入成骨誘導完全培養(yǎng)基，每3 d換液1次。誘導17 d后，用茜素紅染色法對鈣化結節(jié)染色，倒置相差顯微鏡下觀察；當細胞融合度達90%或以上時，加入成脂誘導完全培養(yǎng)基A液，誘導3 d后，吸棄A液，加入成脂誘導完全培養(yǎng)基B液，24 h后吸棄B液，換A液誘導，A液和B液交替作用18 d后，用B液培養(yǎng)7 d，共誘導25 d，進行油紅O染色，倒置相差顯微鏡下觀察。

1.5" MTT法檢測不同濃度麝香含藥血清對BMSCs增殖的影響

P3代BMSCs達80%融合度時，胰酶消化細胞，制備單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清并加入完全培養(yǎng)基，調整細胞密度按每孔2×104個接種至96孔板，分為空白對照組和高、中、低劑量（16.8、8.4、4.2 μL/100 g）麝香組，每組10個孔，各組每孔加入200 μL相應完全培養(yǎng)液，24 h后加入20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，搖床震蕩10 min，檢測各孔波長490 nm時吸光度（A490）值。結果以A490值表示細胞增殖情況。檢測7 d，實驗重復2次。

1.6" Transwell小室檢測麝香含藥血清對BMSCs遷移的影響

P3代BMSCs融合度達80%時，胰酶消化細胞，加入無血清培養(yǎng)基，調整細胞并按照1×105/cm2的密度接種于24孔Transwell孔板上層培養(yǎng)小室中，分為麝香含藥血清組、空白對照組、麝香含藥血清+GF干預組（另加20 μmol/L GF109203X），每組6個復孔，200 μL/孔。在Transwell孔板下層培養(yǎng)小室中分別加入含50 mL/L的含藥血清和空白組血清完全培養(yǎng)液，置于37 ℃，含50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在24、48、72 h觀察細胞遷移變化，即在各時間點取出24孔培養(yǎng)板，吸棄Transwell小室上層培養(yǎng)基，將小室轉移至新孔中，PBS沖洗小室2次，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS沖洗小室2次，適當風干后加10 g/L結晶紫溶液，避光染色15 min，PBS沖洗小室2次，輕輕用棉球擦去Transwell小室上室細胞，PBS沖洗小室2次。每個小室隨機選取6個視野，拍照計數，紫色細胞為遷移的細胞。倒置相差顯微鏡下（×20）拍照，細胞計數后取其平均值。實驗重復2次。

1.7" 統(tǒng)計學處理

所有數據均輸入計算機，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以±s表示，數據進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD）-t 檢驗；方差不齊采用非參數秩和檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結" 果

2.1" 細胞形態(tài)學觀察

2.2" BMSCs細胞表型鑒定結果

2.3" BMSCs成骨、成脂分化情況

2.4" 麝香含藥血清對BMSCs增殖、遷移的影響

MTT結果（表1）顯示，與對照組相比，第1天和第2天麝香低、中、高劑量組細胞增殖變化有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），低劑量組差異更明顯（Plt;0.01），第3天低、中劑量組差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），低劑量組差異更明顯（Plt;0.01），第4天、第5天麝香低劑量組有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），第6天麝香低、中劑量組有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），低劑量組差異更明顯（Plt;0.01），第7天麝香低、高劑量組有差異（Plt;0.05），給藥組不同時間點組內比較，差異無統(tǒng)計學意義 （Pgt;0.05）。提示不同時間段麝香低劑量組促BMSCs增殖效果最好。

2.5" 含藥血清在信號通路阻斷劑干預時對BMSCs遷移影響

3" 討" 論

近年來，骨組織工程的研究不斷深入與發(fā)展為修復愈合時間慢及不愈合的各種骨組織缺損提供了新思路。BMSCs作為骨組織工程領域重要的種子細胞，在骨再生與重建方面起著越來越重要的作用。研究發(fā)現中藥促進骨組織缺損愈合的機制主要有改善損傷區(qū)血液循環(huán)、血腫的吸收，增強骨痂的力學性能，增加鈣鹽沉積及合成基質膠原，提高成骨細胞活性，刺激相關生長因子及細胞因子的合成與分泌，促BMSCs向成骨細胞分化并遷移。前期體內實驗研究發(fā)現，中藥麝香可通過增加基質細胞衍生因子、肝細胞生長因子表達，促進BMSCs遷移至骨缺損處［5-6］。表明中藥可通過調控相關因子促BMSCs遷移從而促進骨組織缺損的修復，但其具體機制、終末效應及安全性尚不明確。因此，在中醫(yī)“引經理論”指導下，以麝香作為促進BMSCs增殖、成骨分化、遷移的載體并探討其作用機制的研究具有重要意義。

PKC廣泛存在于各種組織、器官、細胞胞質內，同時調控著多條信號轉導通路，PKC通過其自身的信號通路或與其他信號通路相結合，在細胞生長、細胞分化、細胞程序性死亡、自噬以及包括軟骨細胞在內的多種細胞的新陳代謝等廣泛生物作用中發(fā)揮作用［7-9］。

何笑云等［10］通過觀察高糖高脂環(huán)境中系膜細胞分泌細胞外基質與PKC信號通路之間的關系，發(fā)現PKCβ抑制劑不僅降低PKCβ mRNA表達，而且顯著抑制纖維連接蛋白、Ⅳ型膠原蛋白表達，說明

PKCβ抑制劑可能通過抑制高糖高脂應激環(huán)境下細胞外基質相關因子的分泌與合成。KINEHARA等［11］研究發(fā)現，PKC抑制劑能使多能干細胞中ALP 活性顯著增強，而細胞成骨分化的早期表現是ALP活性增加，推測PKC可能參與早期的細胞成骨分化過程。崔陽陽等［12］研究小鼠BMSCs成骨分化過程中PKC信號通路及其蛋白亞型的作用，發(fā)現在BMSCs成骨分化整個過程中僅有PKCβⅡ活化，通過加入PKC阻斷劑檢測ALP活性及茜素紅染色和Runx2、Ⅰ型骨膠原a1 mRNA表達等，結果顯示各項指標均有增強或增加，這提示PKC亞型PKCβⅡ與小鼠BMSCs成骨分化呈負相關作用。有研究通過TNF-α處理MSCs后加入

PKCα信號通路抑制劑Calphostin C，采用細胞劃痕實驗結果顯示，TNF-α促MSCs遷移數量顯著降低，Transwell實驗結果顯示，TNF-α促MSCs的侵襲能力也被抑制；Western blotting和RT-PCR檢測發(fā)現，Calphostin C還能明顯降低細胞骨架蛋白MYL9（myosin light chain 9，MYL9）、細胞外基質蛋白CYR61（cysteine rich 61，CYR61）、MYL9、CYR61 mRNA的表達，表明TNF-α促MSCs遷移及相關因子表達受抑制可能與加入Calphostin C有關［13］。以上研究均表明，由于PKC組成結構的復雜性決定了其在不同應力刺激下被激活并發(fā)揮不同的生物學調節(jié)效應，在BMSCs成骨分化過程中具有重要作用。

本實驗MTT法檢測發(fā)現，低濃度麝香對細胞的增殖作用影響最顯著，隨著濃度的不斷增加，可能影響B(tài)MSCs細胞周期，高劑量麝香對細胞的增殖有抑制作用，說明隨著麝香濃度的升高，細胞增殖率與時間呈負相關。因此，選用約4.2 μL/100 g麝香含藥血清對BMSCs增殖作用最佳。通過麝香低劑量組、對照組與加入PKC信號通路阻斷劑GF109203X后發(fā)現，麝香低劑量組促BMSCs遷移數量與時間呈正相關，GF109203X干預后隨著時間延長其遷移數量逐漸降低，說明阻斷劑GF109203X對麝香藥效發(fā)揮產生阻斷作用。證實麝香可能通過介導PKC信號通路參與促進BMSCs遷移效應。

綜上所述，PKC信號通路在促BMSCs遷移過程中發(fā)揮著重要作用。近年來研究發(fā)現細胞因子是激活膜受體而通過多條信號通路使BMSCs遷移到受損組織并分化為具有修復功能的細胞實現再生修復、愈合的功能［14］。未來需要進一步研究具體調控細胞因子或生長因子而活化該條信號途徑的相關機制。

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（編輯" 國" 榮）