顧江新， 侯錫苗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)a.資源環(huán)境學(xué)院；b.生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

0 引言

生物大分子指生物體內(nèi)的多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等。生物大分子在生命過程中的功能與其結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化密切相關(guān)，“結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)”是現(xiàn)代生命科學(xué)得以快速發(fā)展的思想基礎(chǔ)［1］。以單個分子作為研究對象，對其行為（包括構(gòu)象變化、相互作用和相互識別等）進(jìn)行實時、動態(tài)檢測以及在此基礎(chǔ)上的操縱、調(diào)控等，有利于揭示生物大分子的作用機(jī)制［2-4］。生物大分子的空間尺度在幾十納米量級，無法使用傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡檢測其結(jié)構(gòu)變化。單分子熒光顯微鏡利用熒光分子能量共振轉(zhuǎn)移進(jìn)行相對位置的測量，具有納米級別的超高分辨率，可用于單分子研究［5-7］。

在人類基因組DNA的高級結(jié)構(gòu)中，通過半質(zhì)子化的胞嘧啶配對構(gòu)成非典型四鏈體結(jié)構(gòu)i 基序（intercalated motif，i-motif）受到廣泛關(guān)注。i-motif結(jié)構(gòu)多存在于端粒及癌基因的啟動子區(qū)，對調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá)具有重要作用，已經(jīng)成為抗癌治療的新靶點［8-9］，i-motif結(jié)構(gòu)的多變性和敏感的pH 依賴性使其在納米機(jī)械及藥物遞送系統(tǒng)中獲得應(yīng)用［10-11］，環(huán)境pH 值的變化對i-motif結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接影響，但對于i-motif 的折疊狀態(tài)及性質(zhì)仍缺乏系統(tǒng)的研究。本文實驗通過在含有i-motif結(jié)構(gòu)的DNA 底物上標(biāo)記熒光對，記錄不同pH值條件下的熒光能量轉(zhuǎn)移效率，旨在闡明i-motif結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化過程和作用機(jī)制。

1 實驗原理與方法

1.1 實驗原理

圖1 所示為單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基本原理。如圖所示，在某一雙鏈DNA分子的兩端進(jìn)行熒光標(biāo)記時，供體（D）熒光分子受激發(fā)所發(fā)出的熒光通過誘導(dǎo)偶極，會部分被受體（A）熒光分子吸收，然后受體熒光分子被點亮的過程。在該過程中，能量轉(zhuǎn)移效率與熒光分子間的距離有關(guān)，其關(guān)系表達(dá)式［12］為

圖1 單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論示意圖

式中：FRET為熒光能量轉(zhuǎn)移效率；R和R0分別為2 個熒光分子的相對位置和特征距離，與光譜重疊面積、溶液離子環(huán)境等有關(guān)。通過測量反應(yīng)過程中能量轉(zhuǎn)移效率即可獲得相對位置變化。

1.2 實驗設(shè)備

圖2所示為單分子熒光顯微鏡的光路及實物圖。主要硬件為IX71 倒置顯微鏡（OLYPUS公司），所有器件均固定于其上；LC-605A固態(tài)激光器（Cohrent公司）產(chǎn)生特定波長的激光，經(jīng)過光纖輸入顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)；通過電動千分尺調(diào)節(jié)激光的入射角度，使激光經(jīng)過二色鏡反射在P-545 載物臺（Physik Instrumente公司）上固定的反應(yīng)槽內(nèi)部下表面形成全內(nèi)反射；熒光分子受激發(fā)的熒光，經(jīng)反射系統(tǒng)進(jìn)入分色箱中，通過DU-897U-CS0-＃BV 電荷耦合器件（Andor Technology 公司）轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號輸出。

圖2 單分子熒光顯微鏡

實驗通過MetaMorph圖像工作站對硬件進(jìn)行管理和控制，可選擇激光波長和強(qiáng)度，利用AutoShutter 功能實現(xiàn)錄像和激光的同步打開、關(guān)閉及自動對焦，最終輸出的數(shù)字信號也由圖像工作站記錄并進(jìn)行可視化處理。

1.3 實驗材料

實驗使用PB 緩沖體系。分別將磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀試劑溶解于雙蒸水（1 mol／L），調(diào)至不同的pH值（5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，8.0），配制出PB 反應(yīng)溶液（50 mmol／L），加入防止熒光淬滅或發(fā)生光漂白的除氧體系，除氧體系由奎諾二甲基丙烯酸酯（4 mmol／L）、D-葡萄糖（0.8%）、葡萄糖氧化酶（1 mg／mL）和過氧化氫酶（0.4 mg／mL）組成。

實驗底物由一條含有i-motif 結(jié)構(gòu)的bcl2 基因序列與一條短雙鏈DNA 退火而成，短DNA 鏈的作用是將底物固定在反應(yīng)槽表面，如圖3 所示。以單鏈DNA為對照。底物的修飾選用花青素?zé)晒夥肿覥y3 和Cy5，該熒光對具有熒光效率高、發(fā)光穩(wěn)定和分子量小等優(yōu)勢。將Cy3 連接至bcl2 序列的3'末端和單鏈DNA的末端，將Cy5 連接至短DNA 鏈的第6 個核苷酸處。此時，bcl2 序列和單鏈DNA分別被夾在2 個熒光之間（見圖3），其結(jié)構(gòu)的輕微變化都將改變2 個熒光之間的距離，進(jìn)而影響熒光能量轉(zhuǎn)移效率。

圖3 實驗底物及熒光修飾示意圖

1.4 實驗方法

實驗過程要求室溫恒定為20 ℃，單分子熒光顯微鏡必須提前預(yù)熱至穩(wěn)定狀態(tài)，待電荷耦合器件降溫至-80 ℃后才能正常工作。將注射器和移液槍頭連接至反應(yīng)槽，抽入反應(yīng)緩沖液對反應(yīng)槽進(jìn)行3 次潤洗。將底物稀釋至50 pmol／L，注入反應(yīng)槽內(nèi)孵育10 min，底物即被固定于反應(yīng)槽表面。用反應(yīng)緩沖液沖走游離的底物，抽入含有除氧體系的成像緩沖液。向物鏡表面滴加香柏油，將反應(yīng)槽固定于載物臺上。選擇532 nm的激發(fā)光，挑選連接均勻且密度適中的視野，每個檢測視野內(nèi)找到500 ～600 個熒光信號，于1 min 內(nèi)錄取600 幀數(shù)據(jù)。對獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、分析和可視化處理。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 pH值的影響

圖4 所示為bcl2 基因序列和單鏈DNA在不同pH值條件下的熒光傳遞效率分布（圖中分子數(shù)占比表示具有該FRET值的分子數(shù)與全部分子數(shù)的比例）。由圖可知，當(dāng)pH ＝6.2 時，bcl2 序列的熒光能量轉(zhuǎn)移效率分布在0.95 左右顯示1 個單峰，說明i-motif結(jié)構(gòu)處于均勻、完全的折疊狀態(tài)；隨著pH值增加至8.0，熒光能量轉(zhuǎn)移效率分布逐步向左移動，效率峰最終停留在0.40左右，表明i-motif 結(jié)構(gòu)在高pH 值條件下的部分去折疊過程。單鏈DNA 在不同pH 值條件下的熒光能量轉(zhuǎn)移效率分布均沒有發(fā)生移動，效率峰穩(wěn)定在0.27 左右［見圖4（b）］，說明其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲狀態(tài)。

圖4 在不同pH值下反應(yīng)底物的熒光傳遞效率分布

2.2 折疊狀態(tài)

圖5所示為bcl2 基因序列的動態(tài)熒光傳遞效率曲線及形成的C-發(fā)夾結(jié)構(gòu)。由圖可知，bcl2 序列的熒光能量轉(zhuǎn)移效率動態(tài)分布曲線擬合出6 個峰，表明imotif結(jié)構(gòu)具有6 個折疊狀態(tài)。除了完全折疊的i-motif（最高效率）和無規(guī)則卷曲狀態(tài)（最低效率）之外，至少還存在4 個中間狀態(tài)，分別對應(yīng)于熒光能量轉(zhuǎn)移效率峰在0.8、0.7、0.5 和0.4 處。這些是由部分C：C +堿基配對形成C-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，包括平行發(fā)夾、反平行發(fā)夾和不完全配對發(fā)夾等（見圖5）。由此可見，當(dāng)pH 值發(fā)生改變時，i-motif 可以在多種折疊狀態(tài)間進(jìn)行自發(fā)地變構(gòu)與轉(zhuǎn)換，推測各折疊狀態(tài)可發(fā)揮不同的生理功能。

圖5 反應(yīng)底物熒光傳遞效率動態(tài)分布曲線及形成的C-發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖

3 結(jié)語

本文實驗利用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，對含有i-motif結(jié)構(gòu)的基因序列bcl2 在不同pH值條件下的動態(tài)變化進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：i-motif 結(jié)構(gòu)具有6個折疊狀態(tài)，在低pH值條件下處于均勻、完全的折疊狀態(tài)，而在高pH 值條件下部分去折疊；總之，i-motif結(jié)構(gòu)隨pH值的改變可在多種折疊狀態(tài)間進(jìn)行自發(fā)地變構(gòu)與轉(zhuǎn)換，為進(jìn)一步探索i-motif 的生理功能提供參考。