◎ 佀勝利，吳超群，申 娜，彭明引

（凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州 凱里 556011）

關(guān)鍵字：產(chǎn)乙醇酵母；分離鑒定；生物學(xué)特性；枇杷果實(shí)

枇杷是亞熱帶特色水果，果肉酸甜多汁，含有大量的碳水化合物、維生素及多種礦物質(zhì)[1]。由于出果期短，枇杷鮮果難以長(zhǎng)期保存[2]。枇杷酒是以枇杷為原料，采用酵母菌發(fā)酵而成的一種低度飲料酒[3-4]。其中，酵母的種類對(duì)枇杷酒的口感、香氣和質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生一定的影響[5]。因此，本研究從枇杷果實(shí)中分離篩選乙醇產(chǎn)量高的酵母菌，并進(jìn)行生物學(xué)特性研究，旨在為選育用于枇杷酒釀造的專用酵母提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

枇杷產(chǎn)地為貴州省凱里市。

YPD 培養(yǎng)基：酵母膏10 g·L-1、蛋白胨20 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1，115 ℃滅菌30 min；制備固體培養(yǎng)基再加入20 g·L-1瓊脂。紅四氮唑（TTC）上層培養(yǎng)基：葡萄糖5 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，121 ℃滅菌20 min。TTC 配成濃度為0.05 g·mL-1的母液，過濾除菌后避光低溫保存。使用時(shí)，待溶解的葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溫度降至40～50 ℃時(shí)，向培養(yǎng)基中加入1%TTC 母液，混合均勻后制成TTC 上層培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

立式高壓蒸汽滅菌器（LDZF-75L，上海申安）；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州安泰）；霉菌培養(yǎng)箱（MJ-150-I，上海一恒）；液相色譜（LC20，島津）。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)乙醇酵母的分離與純化

將新鮮采集的枇杷果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室后，用純凈水沖洗果實(shí)表面，破碎后稱取5 g，加入裝有45 mL 無菌水的三角瓶中，28 ℃下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，得到天然酵母菌懸液。將菌懸液依次稀釋至10-7，取稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液200 μL 均勻涂布于YPD 平板上，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h。挑選與酵母菌菌落形態(tài)相似的單菌落，以平板劃線的方式接種在新的YPD 平板上，純化后編號(hào)菌株，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產(chǎn)乙醇酵母的篩選

（1）初篩。在YPD 平板上培養(yǎng)菌株1～2 d，待長(zhǎng)出明顯的菌落，將融化并配制好的TTC 上層培養(yǎng)基緩慢傾倒其上，避光培養(yǎng)3 h，選取菌落顏色為深紅色的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

（2）復(fù)篩。將初篩得到的菌株制作菌懸液，按5%接種量接種到裝有杜氏小管的YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃靜置發(fā)酵48 h，每隔4 h 加以觀察，并記錄杜氏小管的充氣情況。發(fā)酵結(jié)束后，取一定體積的發(fā)酵液，用液相色譜測(cè)定發(fā)酵液中殘留葡萄糖濃度和發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇濃度。

1.3.3 產(chǎn)乙醇酵母的分子生物學(xué)鑒定

將復(fù)篩得到的酵母菌株送往上海生物工程公司進(jìn)行26S rDNA D1/D2 區(qū)域序列純化擴(kuò)增和測(cè)序，將得到的測(cè)序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出與其相似性較高的菌株及代表菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹圖譜，確定菌株的分類地位。

1.3.4 產(chǎn)乙醇酵母的生物學(xué)特性試驗(yàn)

（1）種子培養(yǎng)液的制備。將復(fù)篩得到的菌株接種在YPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃下150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，將菌液的酵母細(xì)胞數(shù)調(diào)整到105·mL-1，制得種子培養(yǎng)液。

（2）溫度對(duì)酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。按照5%的接種量，將種子培養(yǎng)基分別接種至含有杜氏小管的YPD 液體培養(yǎng)基中，在23、28、33、38 ℃溫度下靜置培養(yǎng)48 h，每隔4 h 觀察杜氏小管的充氣情況。每個(gè)溫度下接種3 個(gè)平行。

（3）初始pH 對(duì)酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。按照5%的接種量，將種子培養(yǎng)基分別接種至初始pH 為4.0、6.0、8.0、10.0 的含有杜氏小管的YPD 液體培養(yǎng)基中，在各菌株的最適生長(zhǎng)溫度下靜置培養(yǎng)48 h，每隔4 h 觀察杜氏小管的充氣情況。每個(gè)pH 下接種3 個(gè)平行。

1.3.5 發(fā)酵液中葡萄糖和乙醇濃度測(cè)定方法

采用液相色譜法分析發(fā)酵液中的物質(zhì)濃度，色譜柱為Shedox Sugar SH1011，流動(dòng)相為5 mmol·L-1的硫酸溶液，洗脫方式為等梯度洗脫，流動(dòng)相流速為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為60 ℃，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)乙醇酵母的分離純化與篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)和稀釋涂布，從枇杷果實(shí)中分離純化得到類似酵母菌的菌株30 株，編號(hào)為L(zhǎng)Y1-LY30。對(duì)30 株酵母菌進(jìn)行TTC 顯色反應(yīng)，LY3、LY5、LY13、LY15、LY18 共5 株酵母菌株呈紅色，其余無明顯變化。將這5 株菌株進(jìn)行靜置發(fā)酵，定期觀察杜氏小管產(chǎn)氣情況，結(jié)果如表1 所示。由表1 可知，LY3、LY5、LY15 起酵較快；16 h 內(nèi)，杜氏小管充滿氣體，LY13 和LY18 產(chǎn)氣較慢。

表1 天然酵母菌株發(fā)酵杜氏小管滿氣所需時(shí)間表

靜置發(fā)酵48 h 后，測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇和葡萄糖濃度，結(jié)果如圖1 所示，LY3、LY5、LY15 的乙醇濃度較高且均超過5 g·L-1。同時(shí)，以上菌株發(fā)酵液中殘留葡萄糖較少，均低于0.01 g·L-1。因此，結(jié)合發(fā)酵產(chǎn)氣情況，將LY3、LY5 和LY15 共3 個(gè)菌株作后續(xù)研究。

圖1 酵母菌發(fā)酵液中葡萄糖濃度（A）和乙醇濃度圖（B）

2.2 產(chǎn)乙醇酵母的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)產(chǎn)乙醇酵母的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列在Gene Bank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對(duì)，LY3 與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）的相似度較高，在99.66%～100%之間；LY5 和LY15 與罕見有孢漢遜酵母（H.occidentalis）的相似度較高，在99.31%～100%之間。對(duì)3 株酵母菌株與有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）中代表種的模式菌株進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，如圖2 所示。LY3 與葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）關(guān)系較近，可以認(rèn)為是同一個(gè)種；LY5、LY15 與罕見有孢漢遜酵母（H.occidentalis）關(guān)系較近，可以認(rèn)為是同一個(gè)種。

圖2 產(chǎn)乙醇酵母菌株的26S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹圖

2.3 產(chǎn)乙醇酵母的生物學(xué)特性

2.3.1 不同溫度下酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇情況

觀察酵母發(fā)酵過程中杜氏小管的充氣情況，以研究溫度對(duì)酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，結(jié)果如圖3 所示。其中，3 株菌株杜氏小管充滿最快的發(fā)酵溫度都是28 ℃；LY3在33 ℃和38 ℃下杜氏小管沒有充氣，LY5 和LY15 在38 ℃時(shí)杜氏小管沒有充氣，說明相應(yīng)溫度下沒有CO2和乙醇的生成，LY5 和LY15 產(chǎn)乙醇性能對(duì)溫度的耐受性更強(qiáng)；LY5 在33 ℃時(shí)，杜氏小管充滿氣體的時(shí)間比23 ℃時(shí)早8 h，說明LY5 在33 ℃的條件下，發(fā)酵乙醇的速度更快，即對(duì)溫度脅迫的耐受性最強(qiáng)。

圖3 溫度對(duì)酵母菌株LY3（A）、LY5（B）、LY15（C）發(fā)酵產(chǎn)氣的影響圖

2.3.2 不同初始pH 條件下酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇情況

觀察不同pH 下各產(chǎn)乙醇酵母發(fā)酵過程中杜氏小管的充氣情況，研究初始pH對(duì)酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響，結(jié)果如圖4 所示。LY3 在初始pH 6.0 時(shí)產(chǎn)氣速度最快，LY5 和LY15 在初始pH 4.0 時(shí)最快，說明pH 條件對(duì)酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響具有菌株個(gè)體差異性。隨著堿性條件的增強(qiáng)，4 個(gè)菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇速度都呈現(xiàn)一定的延滯；初始pH 為10.0 時(shí)，LY3 的產(chǎn)氣延滯期最短，說明LY3 對(duì)pH 的耐受性較好。

圖4 初始pH 對(duì)酵母菌株LY3（A）、LY5（B）、LY15（C）發(fā)酵產(chǎn)氣的影響圖

3 結(jié)語

本研究從枇杷果實(shí)中分離得到30 株菌落形態(tài)類似酵母菌的菌株，通過TTC 顯色反應(yīng)初篩和液體發(fā)酵產(chǎn)物測(cè)定結(jié)合產(chǎn)氣能力評(píng)價(jià)復(fù)篩，得到3 株發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力較強(qiáng)的酵母菌株。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，LY3 為葡萄汁有孢漢遜酵母，LY5、LY15 為罕見有孢漢遜酵母；溫度對(duì)各菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇性能的影響表明，LY5對(duì)溫度的耐受性較好；初始pH 對(duì)各菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇性能的影響表明，LY3 對(duì)初始pH 的耐受性較好。