王 俊，馬玉心，崔大練，范彩彩

(浙江海洋學(xué)院海洋科學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316000)

微藻作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中的主要初級生產(chǎn)力，具有生長迅速和對生態(tài)環(huán)境因子敏感等特點(diǎn)，是研究環(huán)境因子對生物脅迫影響的理想模式生物。杜氏鹽藻Dunaliella salina是鹽藻屬的模式種，有較強(qiáng)的抗鹽性，是重要的餌料和經(jīng)濟(jì)微藻，具有較好的研究和開發(fā)利用價值[1]，其營養(yǎng)代謝及生理研究受到越來越多生理生態(tài)學(xué)家的關(guān)注。它們通過光合作用把攝取的無機(jī)碳轉(zhuǎn)化為有機(jī)物供自身生長需要，也為海洋中其它的魚類等生物提供了食物[2]。N、P是影響和限制單細(xì)胞微藻生長的主要營養(yǎng)鹽元素，也是水體富營養(yǎng)化的重要來源[3]。有專家認(rèn)為c(N)/c(P)=16:1是單細(xì)胞藻類維持正常生長和生理平衡最適c(N)/c(P)[4-5]，但由于各種浮游單細(xì)胞藻類對營養(yǎng)鹽的需求不相同，所需c(N)/c(P)也會受培養(yǎng)環(huán)境條件的影響而不同[6]。多種藻類聚集會造成水體富營養(yǎng)化水華或赤潮等現(xiàn)象，促使其異常增殖積累的前提條件是充分的N、P等營養(yǎng)鹽[7]，過多的N、P不僅影響藻類的生長還影響水體中養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動物。關(guān)于不同N、P營養(yǎng)鹽濃度對杜氏鹽藻生長影響的研究，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。通過對不同N、P營養(yǎng)鹽濃度對杜氏鹽藻生長影響的研究，探討杜氏鹽藻細(xì)胞的適宜生長條件，為養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境的保護(hù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

杜氏鹽藻由中國海洋大學(xué)藻種室提供，試驗(yàn)時取指數(shù)生長期的藻液，按1:3進(jìn)行接種。實(shí)驗(yàn)所用海水取自東海沿岸(鹽度33，pH 7.5)，經(jīng)沉淀砂濾、煮沸消毒、靜置1 d后備用。實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基為：f/2海水海水培養(yǎng)基，其中的N、P濃度按實(shí)驗(yàn)要求添加。

1.2 培養(yǎng)條件

藻種培養(yǎng)用250 mL的錐形瓶，取處于對數(shù)生長期的藻種接種，置于光照搖床進(jìn)行一次性培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，搖床轉(zhuǎn)速100 r/min，培養(yǎng)箱設(shè)置光照強(qiáng)度為3 000 lx，光暗比L:D為12 h:12 h。實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基為：f/2海水海水培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以f/2培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，N、P濃度按試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求添加，N、P濃度分別設(shè)置5個水平，每水平2組重復(fù)(表1)。添加的氮源為：NaNO3，添加的磷源為：KH2PO4。

表1 氮、磷濃度梯度設(shè)置Tab.1 The established gradient of nitrogen and phosphorus concentrations

1.4 生長曲線的測定

每天定時在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每瓶計(jì)數(shù)3次，取平均值，記錄13 d，以時間為橫坐標(biāo)，每1 mL藻液中的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.5 生長率曲線

生長率的計(jì)算公式為：u=(lnN2-lnN1)/(t2-t1)，其中t1、t2是培養(yǎng)時間；N1和N2分別是培養(yǎng)t1和t2時間的細(xì)胞密度[8]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同N濃度下杜氏鹽藻的生長曲線

由不同N質(zhì)量濃度下杜氏鹽藻的生長曲線(圖1)和生長率可以看出，高質(zhì)量濃度氮對杜氏鹽藻生長的影響最大，對各個N濃度梯度下杜氏鹽藻的最大細(xì)胞密度均值的統(tǒng)計(jì)分析表明，N濃度為0.8、1.0、1.2 g/L時的最大細(xì)胞密度與對照組差異極顯著(P＜0.01)，而N濃度為0.1、0.4 g/L時兩組的最大細(xì)胞密度與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。由低到高濃度N實(shí)驗(yàn)組中杜氏鹽藻指數(shù)生長回歸曲線方程見表2。不同N質(zhì)量濃度下杜氏鹽藻的生長率K曲線(圖2)和生長率K回歸指數(shù)表明：當(dāng)N濃度為1.2 g/L時，生長率K下降最快，但各N濃度杜氏鹽藻生長率K之間無顯著性差異(P＞0.05)。由低到高N濃度中杜氏鹽藻生長率K的回歸曲線方程見表3。

表2 不同N濃度下杜氏鹽藻的生長回歸曲線方程Tab.2 The growth regression curve equation of Dunaliella salina under different concentrations of nitrogen

表3 不同N濃度下杜氏鹽藻的生長率K回歸曲線方程Tab.3 The growth rate regression curve equation of D.salina under different concentrations of nitrogen

圖1 不同N濃度下杜氏鹽藻的生長曲線Fig.1 The growth curves of Dunaliella salina under different concentrations of nitrogen

圖2 不同N濃度下杜氏鹽藻的生長率K的變化Fig.2 The variation of growth rate of D.salina under different nitrogen concentrations

2.2 不同P濃度下杜氏鹽藻的生長

由圖3可知，各實(shí)驗(yàn)組杜氏鹽藻生長曲線走勢相似。當(dāng)P濃度為0.025 g/L和0.030 g/L時，這兩組杜氏鹽藻終培養(yǎng)密度值最高，0 g/L時最低。從第7天開始，各組相繼進(jìn)入生長穩(wěn)定期，當(dāng)P濃度為0.045 g/L時，穩(wěn)定期初期的細(xì)胞密度最大；第10天時當(dāng)P濃度為0.025 g/L時細(xì)胞密度最大；培養(yǎng)末期時，P濃度為0.025 g/L細(xì)胞密度最大。由回歸方程的相對生長常數(shù)及圖3可知，在P濃度為0.025 g/L時，杜氏鹽藻最大細(xì)胞密度與對照組差異顯著(P＜0.05)，在培養(yǎng)末期終細(xì)胞密度最大。由低到高不同P濃度下杜氏鹽藻生長回歸曲線方程見表4。由圖4可知，不同N濃度下杜氏鹽藻生長率K呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)P濃度為0.025 g/L時，杜氏鹽藻平均生長率K高于其他組，并且下降緩慢，當(dāng)P濃度為0 g/L時，杜氏鹽藻的平均生長率K下降最迅速。不同P濃度下，杜氏鹽藻由低到高生長率K的回歸曲線方程見表5。

表4 不同P濃度下杜氏鹽藻的生長回歸曲線方程Tab.4 The growth regression curve equation of D.salina under different concentrations of phosphorus

表5 不同P濃度下杜氏鹽藻的生長率K回歸曲線方程Tab.5 The growth rate regression curve equation of D.salina under different concentrations of phosphorus

圖3 不同P濃度下杜氏鹽藻的生長曲線Fig.3 The growth curves of D.salina under different concentrations of phosphorus

圖4 不同P濃度下杜氏鹽藻的生長率曲線的變化Fig.4 The growth variation rate of D.salina under different phosphorus concentrations

2.3 不同c(N)/c(P)對杜氏鹽藻生長的影響

當(dāng)培養(yǎng)液中其他營養(yǎng)因子一致時，杜氏鹽藻的生長主要受N、P的影響。當(dāng)c(N)/c(P)為40時，杜氏鹽藻的終細(xì)胞濃度和平均生長率K具有最大值，表明c(N)/c(P)=40最適合杜氏鹽藻的生長(圖5)。通過單因素方差分析表明杜氏鹽藻的生長受高N低P或低N高P的影響，其中以低氮濃度高磷濃度最為顯著(P＜0.05)。

3 討論

本試驗(yàn)以f/2營養(yǎng)液為基本配方，設(shè)定不同的N、P濃度水平，通過N、P營養(yǎng)鹽限制下與杜氏鹽藻的生長關(guān)系的研究表明：杜氏鹽藻對N、P依賴性較強(qiáng)，不同N質(zhì)量濃度梯度對杜氏鹽藻生長具有顯著性影響(P＜0.05)，但對杜氏鹽藻生長率 K的影響不顯著(P＞0.05)。添加 N 和P都可以明顯促進(jìn)杜氏鹽藻的生長，營養(yǎng)鹽濃度越高，生長速度越高，在實(shí)驗(yàn)初期生物量增加較快，但隨著培養(yǎng)時間的增加，生物量的增加幅度比實(shí)驗(yàn)初期減小。隨著P濃度的提高杜氏鹽藻增長速度差異比較明顯，添加不同的P濃度對杜氏鹽藻的生長影響比不同N濃度的影響明顯，這說明杜氏鹽藻的生長更易受P濃度變化的影響，這可能是由于綠藻對P的要求比N高的原因所致[9]。

N、P是藻類生長最重要的控制因素，存在著交互作用，若c(N)/c(P)大于16，P起主要作用；當(dāng)c(N)/c(P)小于10時，N起主要作用；當(dāng)c(N)/c(P)為10～20時，限制因子不確定[10]。結(jié)果表明，杜氏鹽藻在低N、P條件下的生長狀況好，最適宜c(N)/c(P)是40，要清楚了解杜氏鹽藻與營養(yǎng)鹽之間的關(guān)系，還需要做進(jìn)一步的深入研究。

圖5 不同c(N)/c(P)對杜氏鹽藻平均生長率的影響Fig.5 The effects of different c(N)/c(P)on the growth of the average growth rate of D.salina

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