【摘要】 目的：探討結(jié)直腸癌組織微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）狀態(tài)與病理特征的關(guān)系。方法：納入江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2017年1月-2022年1月收治的結(jié)直腸癌患者89例開展回顧性研究，經(jīng)多重?zé)晒饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法對(duì)結(jié)直腸癌組織的微衛(wèi)星狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，記錄MSI、微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）狀態(tài)的檢出情況，分析MSI與患者病理特征的關(guān)系。結(jié)果：在89例患者中，錯(cuò)配修復(fù)（MMR）蛋白表達(dá)缺失率為38.20%（34/89），未缺失率為61.80%（55/89），MSI占比為39.33%（35/89），MSS占比為60.67%（54/89），患者微衛(wèi)星狀態(tài)與MMR蛋白表達(dá)有相關(guān)性（Plt;0.05）?；颊進(jìn)SI與年齡、腫瘤部位、分化程度、腫瘤最大徑、癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（Plt;0.05）。結(jié)論：結(jié)直腸癌患者M(jìn)SI除與年齡有關(guān)外，還具備獨(dú)特的病理特征，以右半結(jié)腸、中低分化、腫塊大及無癌結(jié)節(jié)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者居多，能為該病評(píng)估提供參考。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)直腸癌 微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài) 病理特征 多重?zé)晒饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)

The Relationship between Microsatellite Instability and Clinicopathological Features in Colorectal Cancer Tissue/CHEN Minyang. //Medical Innovation of China， 2023， 20（17）： -140

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between microsatellite instability （MSI） status and pathological features in colorectal cancer tissues. Method： A retrospective study was carried out on 89 patients with colorectal cancer admitted to Jiangxi Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine from January 2017 to January 2022. The microsatellite status of colorectal cancer tissue was detected by multiplex fluorescence polymerase chain reaction （PCR） method， the detection of MSI and microsatellite stable （MSS） status was detected， and the relationship between MSI and pathological characteristics of patients was analyzed. Result： Among 89 patients， MMR protein expression deletion rate was 38.20% （34/89）， non-deletion rate was 61.80% （55/89）， MSI accounted for 39.33% （35/89）， and MSS accounted for 60.67% （54/89）， Microsatellite status was correlated with the expression of MMR protein （Plt;0.05）. MSI was correlated with age， tumor location， degree of differentiation， maximum tumor diameter， cancer nodules， lymph node metastasis and distant metastasis （Plt;0.05）. Conclusion： MSI in colorectal cancer patients is not only related to age， but also has unique pathological characteristics， such as right colon， medium and low differentiation， large mass， no cancer nodules， no lymph node metastasis， no most patients with distant metastasis can provide reference for the evaluation of the disease.

[Key words] Colorectal cancer Microsatellite instability Pathological features Multiplex fluorescence polymerase chain reaction

First-author's address： Jiangxi Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanchang 330003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.17.032

結(jié)直腸癌是臨床常見的消化道腫瘤，在我國(guó)惡性腫瘤中發(fā)病率位居第3位，死亡率居于第5位[1]。目前，臨床對(duì)于該病仍采用手術(shù)治療為主，放療、化療為輔的方式，雖然有一定應(yīng)用價(jià)值，但部分患者術(shù)后仍然存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的情況，療效欠佳[2]。因此，臨床還需為該病的個(gè)體化治療提供新方向。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，例如抑癌基因表達(dá)缺失或者突變，癌基因表達(dá)過度或激活，均可促進(jìn)腫瘤發(fā)生[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)DNA錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）蛋白表達(dá)缺失或編碼基因突變所致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）狀態(tài)與腫瘤病情變化有關(guān)，MMR蛋白包括PMS2、MSH2、MLH1及MSH6蛋白，若編碼上述蛋白的相關(guān)基因出現(xiàn)突變，或者M(jìn)MR蛋白缺失，則無法對(duì)DNA復(fù)制時(shí)造成的錯(cuò)配進(jìn)行修復(fù)，引起MSI[4]。所謂MSI，即與正常組織比較，腫瘤病灶組織內(nèi)某微衛(wèi)星因復(fù)制差錯(cuò)，致使簡(jiǎn)單重復(fù)序列缺失或插入，改變微衛(wèi)星長(zhǎng)度，可見結(jié)構(gòu)性等位基因大小改變，有新微衛(wèi)星等位基因出現(xiàn)[5]。而既往研究指出，約15%結(jié)直腸癌發(fā)病與MSI相關(guān)[6]。通過分析MSI狀態(tài)與結(jié)直腸癌病理特征的關(guān)系，能進(jìn)一步掌握該病的特點(diǎn)，為臨床干預(yù)提供新的治療方向。本研究則納入89例結(jié)直腸癌患者對(duì)此進(jìn)行探討，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科2017年1月-2022年1月收治的結(jié)直腸癌患者89例開展回顧性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；一般資料與病理資料齊全；首診。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前有放療史、化療史；同時(shí)患其他原發(fā)性腫瘤；既往有腦血管、心血管疾病病史；患自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病；凝血功能異常。在89例患者中，男48例，女41例，年齡30～95歲，平均（59.63±10.72）歲。研究方案獲醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)方法 通過手術(shù)獲取癌組織及癌旁正常腸黏膜組織，經(jīng)多重?zé)晒饩酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法測(cè)定MSI狀態(tài)，經(jīng)免疫組化S-P法測(cè)定癌組織中MMR蛋白表達(dá)情況。

1.2.1 主要試劑與儀器 主要試劑包括DNA提取試劑、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑，購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，DAB顯色試劑、抗原修復(fù)液、蘇木素染色液及PMS2、MSH2、MLH1與MSH6單克隆抗體，購(gòu)自福州邁新生物工程公司。主要儀器包括YT-7FB型組織攤烤片機(jī)（湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、YB-8LF型包埋機(jī)（湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）、LEICA ASP300S型全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

1.2.2 MMR蛋白表達(dá)檢測(cè) 獲取樣本組織后，通過10%甲醛予以固定，脫水，行石蠟包埋，切片，厚度約4 μm。將切片置于涂膠玻片，常規(guī)烤片、脫蠟，行高壓抗原修復(fù)，將切片放置于耐高溫染片架，然后放入高壓鍋（裝有抗原修復(fù)液）內(nèi)加熱，直至沸騰，冒氣5～10 min后，自然冷卻10 min，利用自來水對(duì)不銹鋼鍋外壁進(jìn)行沖淋，直至冷卻，將切片取出，流水洗3 min，經(jīng)PBS溶液洗3次，

3 min/次。取內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑100 μL加入，室溫孵育10 min，經(jīng)PBS溶液洗3次，3 min/次。加一抗100 μL，室溫孵育1 h，經(jīng)PBS溶液洗3次，3 min/次。加酶標(biāo)聚合物100 μL，室溫孵育

15 min，PBS溶液清洗同上。加DAB顯色液100 μL，室溫孵育5 min。經(jīng)自來水清洗，行蘇木素復(fù)染，時(shí)間為20 min，經(jīng)自來水返藍(lán)。常規(guī)脫水、透明、封片。結(jié)果判定：若胞核內(nèi)呈棕黃、黃褐色顆粒，則提示PMS2、MSH2、MLH1及MSH6陽性。根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色、淡黃、棕黃、棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分。按陽性細(xì)胞占比計(jì)分：陽性細(xì)胞占比≤10%、11%～50%、51%～75%、gt;75%分別計(jì)1、2、3、4分。兩項(xiàng)乘積≥2提示陽性，否則為陰性。四種蛋白表達(dá)均為陽性，則為MMR陽性（無表達(dá)缺失），任意一種蛋白表達(dá)為陰性，則為MMR陰性（表達(dá)缺失）[7]。

1.2.3 MSI狀態(tài)檢測(cè) 獲取樣本組織后，通過DNA提取試劑對(duì)癌組織、癌旁組織DNA進(jìn)行提取，參考美國(guó)國(guó)家癌癥研究所用藥協(xié)議小組推薦的指南，選取微衛(wèi)星位點(diǎn)，正向、反向引物序列如下：D2S123為5'-ACACAGAGCCTTAGTA-3'、5'-GGATTAGAAAGACAAGT-3'；D17S250為5'-GCTAATTGTTAAACTGGAT-3'、5'-ACTGGATATTCTAGTTAGT-3'；D5S346為5'-ACTCTTCATTATGGGTCAAG-3'、5'-AGAGTCAAGTATTATGGTT-3'；Bat-25為5'-TGGTAGTAATGCTGCCGAT-3'、5'-GGATAGTTGTCACTGTT-3'；Bat-26

為5'-TGACTACTTTGACTTCAGCC-3'、5'-AACCATTCAACATTTTTAACCT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min（預(yù)變性）；94 ℃ 60 s（變性），56 ℃ 60 s（退火），56 ℃ 60 s（延伸），30個(gè)循環(huán)。待微衛(wèi)星片段擴(kuò)增完畢，經(jīng)95 ℃ 5 min變性，行毛細(xì)血管電泳，將數(shù)據(jù)輸入配套軟件進(jìn)行處理。結(jié)果判定：與正常組織相比，癌組織所測(cè)定的位點(diǎn)未見等位基因異常與移動(dòng)，則為微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS），癌組織測(cè)定的位點(diǎn)可見數(shù)目改變或波峰移動(dòng)，視為MSI，在所檢測(cè)的5個(gè)位點(diǎn)中，不穩(wěn)定位點(diǎn)≥2個(gè)，視為高度不穩(wěn)定（microsatellite stable-high，MSI-H），僅1個(gè)位點(diǎn)不穩(wěn)定，則為低度不穩(wěn)定（microsatellite stable-low，MSI-L）[8]。根據(jù)患者的微衛(wèi)星狀態(tài)分成MSS組與MSI組（包含MSI-H與MSI-L）。

1.2.4 一般資料與病理資料收集 一般資料包括性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、飲酒史、家族史，病理資料包括腫瘤部位、分化程度、腫瘤大小、病理形態(tài)、脈管侵犯、癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS20.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，行字2檢驗(yàn)。經(jīng)字2檢驗(yàn)分析微衛(wèi)星狀態(tài)與MMR蛋白表達(dá)的相關(guān)性。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 89例患者的MMR蛋白表達(dá)分析 在89例患者中，有34例（38.20%）存在MMR蛋白表達(dá)缺失，55例（61.80%）未見表達(dá)缺失，具體表達(dá)缺失情況，見表1。

2.2 89例患者微衛(wèi)星狀態(tài)與MMR蛋白表達(dá)的相關(guān)性 在89例患者中，MSI 35例（39.33%），MSS 54例（60.67%）。在35例MSI患者中，MSI-L 1例，MSI-H 34例，僅1例MMR蛋白表達(dá)未缺失，54例

MSS患者的MMR蛋白表達(dá)均未缺失。采用字2檢驗(yàn)分析微衛(wèi)星狀態(tài)與MMR蛋白表達(dá)有相關(guān)性（字2=84.885，Plt;0.001），見表2。

2.3 患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與一般資料的關(guān)系 在89例患者中，MSI組年齡lt;60歲占比高于MSS組（Plt;0.05），其余一般資料兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表3。

2.4 患者微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與病理特征的關(guān)系 MSI

組腫瘤部位位于右半結(jié)腸、中低分化、腫瘤最大徑≥5 cm占比均高于MSS組，癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移占比均低于MSS組（Plt;0.05）。兩組病理形態(tài)、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯及病理類型比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。見表4。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制主要為染色體不穩(wěn)定（chromosomal instability，CIN）與MSI兩種通路，其中MSI與MMR基因存在密切關(guān)聯(lián)，在MMR系統(tǒng)正常的情況下，其能對(duì)DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)配、插入、缺失進(jìn)行修復(fù)，確保人類遺傳物質(zhì)的保真性及穩(wěn)定性，一旦MMR系統(tǒng)功能下降或喪失，則會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)配修復(fù)缺陷，引起MSI[9]。近年來，已有大量研究證實(shí)MSI與多種腫瘤疾病相關(guān)，如子宮內(nèi)膜癌、胃癌、膽囊癌等[10-12]。有研究指出在出現(xiàn)MSI的惡性腫瘤患者中，DAN錯(cuò)義突變與移碼發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高100～1 000倍，基因組內(nèi)短串聯(lián)重復(fù)序列異常，出現(xiàn)減少或增加的現(xiàn)象，大量抑癌基因或者原癌基因突變，致細(xì)胞調(diào)控處于失衡狀態(tài)[13]。因此，臨床有必要掌握MSI與結(jié)直腸癌病理特征的關(guān)系，為該病診治提供依據(jù)。

本次結(jié)果顯示，在89例患者中，MMR缺失率為38.20%，MSI比例為39.33%。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在141例結(jié)直腸癌患者中，MSI-H占比為17.7%，MSI-L占比為12.1%，MSI共計(jì)占比為29.8%[14]，略低于本次結(jié)論，分析原因，考慮到主要與患者的個(gè)體差異相關(guān)，由于個(gè)體的疾病特征不同，微衛(wèi)星狀態(tài)可能會(huì)出現(xiàn)差異。本次還發(fā)現(xiàn)MMR與微衛(wèi)星狀態(tài)之間存在相關(guān)性，進(jìn)一步提示MMR與MSI存在相關(guān)性。在MMR蛋白中，MLH1、MLH2是參與錯(cuò)配修復(fù)的主要組成部分，二者能結(jié)合于其同源錯(cuò)配修復(fù)蛋白，合成二聚體，從而發(fā)揮相關(guān)作用[15]。MSH6是MLH2的配對(duì)蛋白，PMS2是MLH1的配對(duì)蛋白，一旦二者產(chǎn)生突變，則會(huì)降解其對(duì)應(yīng)的二聚體蛋白，引起主導(dǎo)蛋白及其配對(duì)蛋白缺失，而MMR蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致MSI[16]。該機(jī)制能夠?yàn)楸敬谓Y(jié)論提供解釋。本研究發(fā)現(xiàn)在35例MSI患者中，有1例MMR蛋白并未缺失，這可能與某些未知的錯(cuò)義突變導(dǎo)致MMR抗原性保留，但其功能卻喪失有關(guān)，未來還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

結(jié)直腸癌患者的病理特征多樣，病理特征不同，對(duì)疾病進(jìn)展與預(yù)后的影響也不同[17-18]。本次結(jié)果提示，結(jié)直腸癌患者的微衛(wèi)星狀態(tài)與多種病理特征存在關(guān)聯(lián)，其中MSI患者的主要特征為年齡lt;60歲、右半結(jié)腸、中低分化、腫塊較大，且癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率更低。本研究顯示發(fā)生MSI患者的年齡相對(duì)較小，但關(guān)于其機(jī)制尚未徹底明確。研究發(fā)現(xiàn)與MLH1超甲基化患者相比，MMR基因胚系突變患者相對(duì)年輕[19]，這可能是MSI與年齡產(chǎn)生關(guān)聯(lián)的原因。MSI以右半結(jié)腸癌患者多見，表明不同腫瘤部位患者的基因水平存在差異，這類結(jié)直腸癌發(fā)生可能主要與DNA復(fù)制錯(cuò)誤所致的腫瘤基因突變有關(guān)，而其他部位結(jié)直腸癌的發(fā)生則可能與雜合性缺失所致的抑癌基因、促癌基因突變有關(guān)。本研究顯示與MSI相關(guān)的病理特征既包括正面特征，也包括負(fù)面特征，正面特征為癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率低，負(fù)面特征為分化程度相對(duì)低、腫塊大。研究表明MSI患者容易出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞突變，這種突變可增加腫瘤新抗原，有利于CD8+T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別并殺傷[20]。因此，從理論上而言，即便MSI患者分化程度較低、腫塊大，但仍然大多不伴有癌結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者M(jìn)SI與多種病理特征有關(guān)，其中既包括有利特征，也包括不利特征，臨床需引起重視。但本研究也有不足，如選取的樣本較少，受研究時(shí)間限制，未能進(jìn)一步隨訪分析預(yù)后，未來將增加樣本量觀察患者的預(yù)后情況。

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（收稿日期：2022-09-20） （本文編輯：田婧）