摘要 目的：觀察參芪益心方對異丙腎上腺素（ISO）誘導心肌損傷內質網應激的影響。方法：將40只SD大鼠分為對照組、異丙腎上腺素組、曲美他嗪組、參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組。異丙腎上腺素組皮下注射異丙腎上腺素2 mg/（kg·d），對照組皮下注射等量生理鹽水，共4周；第3周開始曲美他嗪組給予曲美他嗪混懸液5 mg/（kg·d）灌胃，參芪益心方低劑量組給予參芪益心方10 g/（kg·d）灌胃，參芪益心方高劑量組給予參芪益心方20 g/（kg·d）灌胃，對照組和異丙腎上腺素組灌胃等量生理鹽水。實驗4周末測定心電圖、超聲心動圖；計算心臟質量指數；Masson染色；免疫組化檢測肌醇需求酶1（IRE1）、Cleaved Caspase-3蛋白表達。結果：與對照組比較，異丙腎上腺素組心臟質量指數增高（P＜0.05），心肌結構紊亂，纖維化增強（P＜0.001），IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表達增強（P＜0.05），對照組心肌組織IRE1、Cleaved Caspase-3呈低表達；異丙腎上腺素組呈中強度表達。參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組蛋白表達較異丙腎上腺素組程度降低，且參芪益心方高劑量組較參芪益心方低劑量組效果明顯。結論：內質網應激參與ISO誘導心肌損傷，參芪益心方可降低IRE1、Cleaved Caspase-3表達，改善心肌損傷，且高劑量效果顯著。

關鍵詞 心肌損傷；參芪益心方；內質網應激；肌醇需求酶1；Cleaved Caspase-3；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.05.013

心肌損傷是多種心血管疾病的共同病理基礎，包括心肌細胞缺失、心肌細胞肥大、心肌間質中膠原纖維組織含量增高等［1］。心肌細胞肥大、凋亡引起心室重構，最終導致心力衰竭發(fā)生。內質網應激是細胞對外界信號刺激產生的一種應激響應機制，內質網應激與心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展關系密切。強烈或持續(xù)的刺激進一步激活凋亡信號通路，從而引起細胞凋亡［2-3］。抑制內質網應激可有效保護心肌，是預防和治療心血管疾病主要靶點之一［4］。參芪益心方是劉莉教授總結多年臨床經驗，制定治療心力衰竭的協(xié)定處方。本研究應用異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導SD大鼠心肌損傷，并給予不同劑量參芪益心方治療，測定內質網中信號分子及其蛋白酶在心肌損傷中的變化，探討參芪益心方對心肌損傷的保護機制與該方抑制內質網應激的關聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及試劑 參芪益心方（仙鶴草30 g，人參20 g，淫羊藿20 g，黃芪20 g，茯苓20 g，葶藶子15 g，白術15 g，丹參15 g，益母草 15 g，桂枝10 g，甘草10 g，濃煎至含生藥5 g/mL）；異丙腎上腺素（上海源葉生物科技有限公司）；蘇木素（北京索萊寶生物科技有限公司）；鹽酸曲美他嗪片（施維雅天津制藥有限公司）；Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）； QuickBlockTM免疫染色封閉液；二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）辣根過氧化物酶（HRP）顯色試劑盒；β-actin Rabbit Monoclonal Antibody、肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme1，IRE1）Antibody、Cleaved-Caspase 3 Antibody（Affinity Biosciences）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（碧云天生物技術公司）。

1.2 實驗儀器 RM6240多通道生理記錄儀（成都儀器廠）；佳能東芝Aplio i700超聲儀（日本佳能）；脫水機、包埋機、切片機（德國萊卡公司）；恒溫水浴鍋（上海藍伊科學儀器廠） 。

1.3 實驗動物 SD雄性大鼠40只，6～8周齡，無特定病原體（SPF）級，購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部，許可證號SCXK（黑）2019-001，批次No.230729211100021921，體質量（200±20）g。飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心動物飼養(yǎng)室，動物飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22 ℃，濕度60%。本研究動物實驗設施的使用許可證號：SYXK（黑）2019-003。本研究通過牡丹江醫(yī)學院關于實驗動物使用的倫理委員會審核。

1.4 模型建立 40只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機選取8只作為對照組，其余32只給予頸背部皮下注射異丙腎上腺素造模，誘導心肌損傷，劑量每日2 mg/kg，對照組皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)2周，對照組和造模組隨機選取8只大鼠進行心電圖、心率、超聲心動圖檢測。

1.5 分組及給藥 實驗2周后對大鼠進行心電圖檢查，超聲心動圖確定造模成功。將32只造模大鼠隨機分為異丙腎上腺素組、曲美他嗪組、參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組，每組8只，早晨繼續(xù)皮下注射異丙腎上腺素，對照組給予等量生理鹽水；每晚各組分別灌胃1次：曲美他嗪組給予曲美他嗪混懸液每日5 mg/kg，參芪益心方低劑量組給予參芪益心方每日10 g/kg，參芪益心方高劑量組給予參芪益心方每日20 g/kg，對照組和異丙腎上腺素組給予等量生理鹽水灌胃，實驗連續(xù)2周。

1.6 心電圖檢查 SD大鼠在實驗給藥2周末、4周末，采用RM6240系列多道生理信號采集處理系統(tǒng)usb 3.0a（I），進行心電圖檢查并記錄。首先給予大鼠吸入異氟烷麻醉后，按照右上肢綠色、右下肢黑色、左下肢紅色連接導聯(lián)線，導聯(lián)前方鑷夾部，夾針灸針，操作時將針灸針刺入相應肢體皮下，注意不要插入肌肉組織，記錄心電圖。

1.7 超聲心動圖測定 SD大鼠于實驗2周末行超聲心動圖檢查。大鼠吸入麻醉后，取仰臥位，胸前心前區(qū)至劍突備皮，采用佳能東芝Aplio i700超聲儀，選用探頭頻率14 MHz，與胸骨夾角20°～30°，超聲顯示二尖瓣瓣口至心尖的心臟左心室長軸切面，測定左室前壁舒張末厚度（Dist A）、左室舒張末期左心室內徑（Dist B）、左心室后壁舒張末厚度（Dist C）、左室收縮期左心室內徑（Dist D），應用Teichholtz公式計算左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.8 心臟質量、心臟質量指數測定 實驗4周末給予10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，將大鼠麻醉后，記錄體質量后剪開大鼠胸腔取出心臟，稱量心臟質量。心臟質量指數＝心臟質量/體質量。

1.9 心臟組織病理學觀察 選取大鼠心尖組織，置于甲醛中固定48 h，制備心肌病理組織切片，對組織切片進行Masson染色，采用光學顯微鏡觀察心肌組織病理改變。應用圖像分析軟件Image J計算，膠原容積分數＝膠原面積/組織面積。

1.10 免疫組化測定 檢測心肌組織IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白表達。

1.11 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件對實驗數據進行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用常規(guī)單因素方差分析（ordinary one-way ANOVA），兩組間比較用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應用GraphPad Prism 8.0軟件，繪制統(tǒng)計圖。

2 結 果

2.1 心電圖變化 與對照組比較，造模組大鼠心率加快（P＜0.05）。詳見圖1、表1。實驗4周末，異丙腎上腺素組q波振幅加深、ST段抬高，異丙腎上腺素組較對照組心率增快（P＜0.05）；曲美他嗪組心電圖記錄q波，參芪益心方低劑量組ST段弓背向上抬高；相比異丙腎上腺素組，參芪益心方高劑量組心率明顯降低（P＜0.05），ST段無偏移。詳見圖2、表2。

2.2 超聲心動圖變化 實驗2周末，與對照組比較，造模組大鼠Dist A、Dist C增加，心肌肥厚；Dist B、Dist D減?。≒＜0.05），心腔縮小；LVEF、LVFS減低（P＜0.05），心功能下降，造模成功。詳見表3、圖3。

2.3 各組體質量、心臟質量、心臟質量指數比較 異丙腎上腺素組大鼠心臟質量和心臟質量指數較對照組增加，體質量較對照組降低（P＜0.05）；曲美他嗪組、參芪益心方低劑量組心臟質量較異丙腎上腺素組增加（P＜0.05）；參芪益心方高劑量組心臟質量指數較異丙腎上腺素組降低（P＜0.05）。詳見表4。

2.4 免疫組化 免疫組化染色顯示：對照組心肌組織IRE1、Cleaved Caspase-3蛋白呈低表達（淡黃色），異丙腎上腺素組蛋白表達呈中度表達（棕黃色）至強表達（棕黑色）；參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組蛋白表達程度降低，參芪益心方高劑量組呈淡黃色，治療效果明顯。詳見圖4。

2.5 心肌組織病理學變化 Masson染色結果顯示，與對照組比較，異丙腎上腺素組大鼠心肌組織藍色膠原纖維增多，纖維化程度增強，不定性膠原纖維組織顯著增生，膠原容積分數增高（P＜0.001）。參芪益心方低劑量組和參芪益心方高劑量組心肌膠原纖維組織（染色為藍色）減少，心肌纖維化程度減輕，膠原容積分數較異丙腎上腺組降低（P＜0.001）。詳見圖5、圖6。

3 討 論

內質網應激是細胞在受到外界應激刺激后，機體內質網穩(wěn)態(tài)被打破，引起未折疊蛋白質或錯誤折疊的蛋白質不能被機體有效清除，導致這些未折疊、錯誤折疊蛋白質在內質網腔內異常蓄積的現象。內質網應激發(fā)生后，內質網上調分子伴侶表達水平，啟動未折疊蛋白反應（unfolded protein reaction，UPR），促進錯誤折疊及未折疊蛋白質的降解，從而緩解內質網應激［5］。強烈或持續(xù)的刺激激活凋亡相關因子和信號通路，引起細胞凋亡。內質網應激作為細胞的應激響應機制，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。

IRE1是內質網應激的重要調節(jié)因子，在未折疊蛋白反應和細胞凋亡中發(fā)揮著關鍵作用［6］。內質網受到應激刺激時，IRE1發(fā)生二聚化和自身磷酸化，激活IRE1上的核糖核酸酶域［7］，通過內質網相關性降解（ER assocated degradation，ERAD）減少未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網內的蓄積。凋亡蛋白酶（cysteine aspartic acid specificprotease，Caspase）是促進細胞凋亡的一種蛋白酶［8-9］，處于細胞凋亡的核心位置。Caspase在細胞凋亡中居中心位置，其中Caspase-12和Caspase-3分別是凋亡的啟動酶和關鍵酶，通過級聯(lián)反應誘發(fā)細胞凋亡［10］。Caspase-3通過級聯(lián)反應誘發(fā)細胞凋亡［11］，Caspase-3可使DNA酶抑制物、細胞核骨架水解，引起DNA降解、胞核固縮、核膜分解，產生凋亡小體導致細胞凋亡［10］。Caspase-3是關鍵的細胞凋亡執(zhí)行者， Cleaved Caspase-3是Caspase-3活化形式，Cleaved Caspase-3活性可有效評估細胞凋亡的程度。有研究顯示，丹參能降低葡萄糖調節(jié)蛋白94（GRP94）、IRE1、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）、Caspase-12、Cleaved Caspase-3水平，改善異丙腎上腺素誘導的心肌損傷［12］。本研究結果顯示，異丙腎上腺組IRE1、Cleaved Caspase-3表達水平均增加，表明內質網應激參與異丙腎上腺素誘導的心肌損傷。

中醫(yī)學認為心力衰竭的基本病機為心氣（陽）虛、瘀血水飲停阻，氣虛無以行血，血不利則為水，氣不足則陽氣衰，陽衰則水無以為輸。參芪益心方是根據心力衰竭的本虛標實病機，以益氣溫陽、活血利水為基本治法，選用11味藥物組成。方中君以人參、黃芪補益心氣，臣以桂枝、淫羊藿溫陽納氣，佐以丹參、益母草活血化瘀，茯苓、葶藶子、白術、仙鶴草利水滲濕，甘草益氣補中、調和諸藥為使藥。全方藥味配伍精當，諸藥合用，共奏益氣溫陽、活血利水之效。課題組前期研究發(fā)現本方能影響心肌能量代謝［13-16］，改善心功能［17-18］，減少炎性細胞因子產生［19］。本研究證實了參芪益心方對異丙腎上腺素誘導的心肌損傷有保護作用。

綜上所述，內質網應激參與了異丙腎上腺素誘導出現的心肌損傷，參芪益心方具有心肌保護作用，且高劑量組效果顯著，其機制與抑制內質網凋亡信號分子IRE1、Cleaved Caspase-3表達有關。

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（收稿日期：2022-05-02）

（本文編輯薛妮）