摘要 目的：探究金絲桃苷對急性心肌梗死（AMI）小鼠心功能及核因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶-1（HO-1）信號通路的影響。方法：將60只C57BL/6小鼠隨機分成對照組、AMI組及金絲桃苷低、中、高劑量組，每組12只。除對照組外，其余各組小鼠均建立AMI模型，并給予相應(yīng)劑量（金絲桃苷50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg）藥物處理。小型動物超聲系統(tǒng)評估各組小鼠心功能；試劑盒檢測血清氧化應(yīng)激指標；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組心肌組織病理變化；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡指數(shù)；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織中Nrf2/HO-1通路蛋白表達水平。結(jié)果：對照組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常；AMI組小鼠心肌組織呈明顯壞死，并有大量炎性細胞浸潤；與AMI組比較，金絲桃苷各劑量組小鼠心肌組織表現(xiàn)出局部壞死，炎性浸潤明顯減少。與對照組比較，AMI組小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、丙二醛（MDA）、心肌細胞凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.05），左心室短軸縮短率（LVFS）和左心室射血分數(shù)（LVEF）、超氧化物歧化酶（SOD）及Nrf2、HO-1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。與AMI組比較，金絲桃苷各劑量組LVESD和LVEDD、MDA、心肌細胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05），LVFS和LVEF、SOD及Nrf2、HO-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：金絲桃苷可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，抑制心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善AMI小鼠心功能。

關(guān)鍵詞" 急性心肌梗死；金絲桃苷；心功能；核因子紅系2相關(guān)因子2，Nrf2；血紅素加氧酶-1，HO-1；氧化應(yīng)激；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.05.012

冠狀動脈疾病也被稱為缺血性心臟病（ischemic heart disease，IHD），在過去15年里，缺血性心臟病已經(jīng)成為全球死亡和殘疾的主要原因［1］。急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是在冠狀動脈粥樣硬化、斑塊破裂、血栓形成的基礎(chǔ)上發(fā)生急性冠狀動脈閉塞而引起的一種常見缺血性心臟病。許多研究證實，氧化應(yīng)激和細胞凋亡在AMI發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。缺血心肌在接受灌注治療時可誘導氧化應(yīng)激水平明顯升高，導致心肌細胞凋亡明顯增加，甚至細胞死亡［2］。因此，抑制氧化應(yīng)激水平可作為改善AMI心功能障礙的重要手段。金絲桃苷是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抑制細胞凋亡等細胞保護作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷可通過激活核因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear-factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號通路，抑制氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元死亡［4］。然而，金絲桃苷是否可通過激活Nrf2/HO-1信號通路對AMI心功能發(fā)揮保護作用尚未見報道。因此，本研究擬通過構(gòu)建AMI小鼠模型，探究金絲桃苷對AMI小鼠心功能和Nrf2/HO-1信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 成年C57BL/6雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自廣東省實驗動物監(jiān)測所，許可證號：SYXK（粵）2016-0122。所有小鼠均處于12h的光/暗循環(huán)中，溫度為（22±1）℃，并自由飲食、飲水。使用的動物按照美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南進行處理。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 金絲桃苷標準品（純度≥98%，貨號：SH8310）購自北京索萊寶科技有限公司?？偝趸锲缁福╯uperoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（貨號：A001）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（貨號：A003）均購自南京建成生物工程研究所。Anti-Nrf2抗體（貨號：12721）、anti-HO-1抗體（貨號：86806）及羊抗兔二抗（7074）均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 實驗儀器 小型動物超聲系統(tǒng)購自百思德生物科技（北京）有限公司，光學顯微鏡購自日本Nikon公司，酶標儀購自瑞士TECAN公司，蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物模型制備 參考Zhu等［5］方法，構(gòu)建AMI小鼠模型。首先將小鼠用異氟醚麻醉，并由呼吸機以每分鐘80次搏動輔助呼吸。固定后，經(jīng)左側(cè)胸壁在第3肋間開胸，顯露心包和心臟。用7-0絲線永久性結(jié)扎距主肺動脈2 mm處的左前降支冠狀動脈（left anterior descending coronary artery，LAD），造成結(jié)扎遠端顏色蒼白，表明AMI模型構(gòu)建成功。對照組小鼠僅打開胸腔，分離LAD，穿線但不結(jié)扎。

1.4.2 動物分組 將60只C57BL/6小鼠按隨機數(shù)字表法分為5組：對照組、AMI組、金絲桃苷低劑量組、金絲桃苷中劑量組、金絲桃苷高劑量組，每組12只。除對照組外，其余各組小鼠均建立AMI模型。金絲桃苷低、中、高劑量組小鼠在造模前3 d至造模后14 d給予金絲桃苷50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg劑量灌胃［6］。對照組和AMI組小鼠給予等量生理鹽水灌胃。

1.4.3 心功能指標檢測 末次給藥24 h后，使用小型動物超聲系統(tǒng)檢測各組小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）和左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.4.4 樣本采集 檢測心功能指標后，采集各組小鼠外周血，離心取上清，置于－20 ℃中保存?zhèn)溆?。然后將小鼠處死，完整取出心臟。從每組中隨機選取6只小鼠，將心肌組織置于10%甲醛溶液中固定；另外6只小鼠心肌組織置于液氮中速凍保存。

1.4.5 血清氧化應(yīng)激指標檢測 根據(jù)試劑盒說明書檢測小鼠血清SOD和MDA濃度。

1.4.6 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠心肌組織病理變化 取出固定在多聚甲醛中的心肌組織，梯度乙醇脫水透明，石蠟包埋，然后將組織切成5 μm厚切片，HE染色后于光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.4.7 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）檢測小鼠心肌細胞凋亡 取制備完成的心肌組織切片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書操作，在光學顯微鏡下計數(shù)并拍照。凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）＝陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4.8 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測小鼠心肌組織中Nrf2/HO-1通路蛋白表達水平 將液氮中凍存的心肌組織研磨勻漿化，提取總蛋白，并測定其濃度?？偟鞍捉?jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。然后用5%脫脂牛奶封閉2 h，洗膜，孵一抗（Nrf2、HO-1，稀釋倍數(shù)為1∶1 000），在4 ℃條件下過夜。洗膜孵二抗，在室溫下孵育1 h，曝光顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白相對表達量。其中以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心功能指標比較 與對照組比較，AMI組LVESD和LVEDD明顯升高（P＜0.05），LVFS和LVEF明顯降低（P＜0.05）；與AMI組比較，金絲桃苷各劑量組LVESD和LVEDD明顯降低（P＜0.05），LVFS和LVEF明顯升高（P＜0.05），其中以金絲桃苷高劑量組最為明顯，金絲桃苷各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組小鼠血清氧化應(yīng)激指標水平比較 與對照組比較，AMI組MDA含量明顯升高（P＜0.05），SOD明顯降低（P＜0.05）；與AMI組比較，金絲桃苷各劑量組MDA含量明顯降低（P＜0.05），SOD明顯升高（P＜0.05），其中以金絲桃苷高劑量組最為明顯，金絲桃苷各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 各組小鼠心肌組織形態(tài)學變化 對照組小鼠心肌細胞排列整齊，未見明顯變性；AMI組小鼠心肌組織呈明顯壞死變化，心肌纖維溶解，排列明顯紊亂，間質(zhì)水腫，并有大量炎性細胞浸潤；與AMI組比較，金絲桃苷各劑量組小鼠心肌組織表現(xiàn)出局部組織壞死，心肌纖維排列較規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)較清晰，炎性浸潤明顯減少。詳見圖1。

2.4 各組小鼠心肌細胞AI比較 與對照組比較，AMI組心肌細胞AI明顯升高（P＜0.05）；與AMI組比較，金絲桃苷各劑量組小鼠心肌細胞AI明顯降低（P＜0.05），其中以金絲桃苷高劑量組最為明顯，與金絲桃苷低劑量組、金絲桃苷中劑量組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖2及表3。

2.5 各組小鼠心肌組織Nrf2/HO-1通路蛋白表達水平比較 與對照組比較，AMI組Nrf2、HO-1蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與AMI組比較，金絲桃苷各劑量組Nrf2、HO-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），其中以金絲桃苷高劑量組最為明顯，金絲桃苷各劑量組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖3及表4。

3 討 論

心肌梗死是一個備受人們關(guān)注的問題，是冠狀動脈阻塞的主要原因，在世界范圍內(nèi)具有很高的發(fā)病率和死亡率。心肌梗死損傷的病理特征是細胞凋亡和氧化應(yīng)激［7］。在這個過程中，氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞后，會觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加劇氧化應(yīng)激水平，從而促進心肌細胞過度凋亡［8］。本研究采用LAD結(jié)扎法制備小鼠AMI模型，并以心功能、氧化應(yīng)激水平、組織病理學變化、蛋白表達水平為觀察指標，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMI組LVESD和LVEDD升高，LVFS和LVEF降低，血清MDA含量升高，SOD含量降低，光鏡下可見心肌組織呈明顯壞死，并有大量炎性細胞浸潤，且心肌細胞凋亡指數(shù)明顯升高，揭示AMI小鼠模型構(gòu)建成功。

金絲桃苷是從金絲桃屬植物中分離得到的黃酮苷，是中成藥的主要成分之一。金絲桃苷具有多種生物學效應(yīng)，包括抗炎特性，心血管系統(tǒng)中抗缺血和抗凋亡活性，以及通過清除細胞內(nèi)活性氧（ROS）和增強抗氧化酶活性來對抗氧化應(yīng)激的細胞保護特性［9］。金絲桃苷預(yù)處理對心肌缺血引起的心肌損傷具有明顯保護作用［10］。Guo等［11］研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷治療可改善心力衰竭大鼠心功能，抑制細胞凋亡。本研究中，AMI小鼠經(jīng)金絲桃苷處理后，小鼠心功能明顯改善，逆轉(zhuǎn)了LVESD、LVEDD、LVFS和LVEF的變化，同時金絲桃苷可明顯降低AMI小鼠的心肌細胞AI，改善心肌組織病理學特征，表明金絲桃苷對AMI小鼠具有明顯治療作用。在四氯化碳損傷大鼠肝臟的研究中，金絲桃苷可逆轉(zhuǎn)SOD水平的降低和MDA水平的升高［12］。本研究中，AMI小鼠經(jīng)金絲桃苷處理后，MDA水平降低，SOD水平升高，因此，推測金絲桃苷可降低AMI小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而平衡機體正常生理狀態(tài)。

最近數(shù)據(jù)表明，內(nèi)源性抗氧化酶Nrf2在保護機體免受氧化和凋亡損傷中起著核心作用［13-14］。Nrf2與幾個基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，可通過調(diào)節(jié)下游效應(yīng)子（如HO-1）表達，拮抗活性氧誘導的氧化應(yīng)激。HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)酶，能產(chǎn)生抗氧化劑、抗炎劑和細胞凋亡調(diào)節(jié)劑。Nrf2/HO-1信號通路是氧化應(yīng)激和細胞凋亡過程中的重要途徑［15］。Nrf2/HO-1信號通路上調(diào)可改善心肌缺血再灌注小鼠心肌損傷［16］。金絲桃苷已被證明是一種通過HO-1誘導保護細胞免受氧化應(yīng)激的有效化合物［17］。金絲桃苷可激活Nrf2/HO-1信號通路抑制6-羥基多巴胺誘導的氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元凋亡［4］。本研究結(jié)果顯示，AMI組小鼠Nrf2、HO-1蛋白表達水平降低，而經(jīng)金絲桃苷給藥后，可明顯上調(diào)Nrf2、HO-1蛋白表達水平，表明金絲桃苷可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，保護AMI小鼠免受氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，金絲桃苷能改善AMI小鼠心功能，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌細胞凋亡，其治療作用可能與激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)可能為AMI的臨床治療提供新思路，但金絲桃苷的臨床療效還有待于進一步研究。

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（收稿日期：2021-12-18）

（本文編輯郭懷印）