摘要 目的：探討慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮模型建立方法，通過觀察骨骼肌組織形態(tài)學(xué)和涉及萎縮相關(guān)的指標(biāo)，探討慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮涉及的分子靶點(diǎn)。方法：通過結(jié)扎大鼠左側(cè)冠狀動脈前降支的方法來建立大鼠慢性心力衰竭模型。術(shù)后3 d進(jìn)行心電圖檢測。術(shù)后飼養(yǎng)12周，檢測大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)（EF）和血清N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）濃度，觀察心臟大體結(jié)構(gòu)和蘇木精-伊紅（HE）染色后組織形態(tài)，確定心力衰竭模型是否復(fù)制成功。同時(shí)測量大鼠抓力、腓腸肌重量，觀察腓腸肌的大體結(jié)構(gòu)和HE染色后組織形態(tài)，確定大鼠慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮模型成功建立。應(yīng)用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測腓腸肌組織中肌球蛋白重鏈（MyHC）、肌萎縮Fbox-1蛋白（Atrogin-1）、肌肉環(huán)指蛋白-1（MuRF-1）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1）蛋白表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組心電圖出現(xiàn)病理性Q波，心臟EF明顯下降（P＜0.01），血清NT-proBNP濃度明顯升高（P＜0.01），心臟體積變大而且水腫，左心室前壁明顯凹陷，HE染色觀察到心肌組織的排列很不規(guī)則；大鼠腓腸肌組織疏松，顏色偏暗淡，抓力和腓腸肌重量下降（P＜0.01），肌纖維橫截面積明顯縮小（P＜0.01）。Western Blot檢測顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠萎縮相關(guān)蛋白Atrogin-1、MuRF-1和FOXO1表達(dá)明顯升高（P＜0.05），而MyHC蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）。結(jié)論：FOXO1-Atrogin-1/MuRF-1通路在慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮中發(fā)揮重要作用，該模型的建立為臨床防治此類疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞" 慢性心力衰竭；骨骼肌萎縮；N末端腦鈉肽前體；心臟射血分?jǐn)?shù)；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.05.010

Abstract Objective：To explore the establishment method of rat model of chronic heart failure combined with skeletal muscle atrophy，and to investigate the molecular targets by observing the histomorphology of skeletal muscle and indicators related to skeletal muscle atrophy.Methods：The anterior descending of left coronary artery was ligated to establish the rat model of chronic heart failure.Electrocardiogram was performed 3 days after surgery.After 12 weeks of feeding，in order to determine whether the heart failure model of rat was successfully replicated，the cardiac ejection fraction（EF） and serum NT-proBNP concentration were detected，and the structure and histological morphology of heart were observed after hematoxylin-eosin（HE） staining.Meanwhile，the grip strength and gastrocnemius muscle weight were measured，gastrocnemius muscle structure and histological morphology after HE staining were observed to determine whether the model of chronic heart failure combined with skeletal muscle atrophy in rat was successful establishment.Western Blot was used to detect the protein expressions of myosin heavy chain（MyHC），Atrogin-1，muscle ring finger protein-1（MuRF1），and forkhead transcription factors of O class1（FOXO1）.Results：Compared with sham operation group，data in model group showed as follows.Pathological Q waves were observed in electrocardiogram，cardiac ejection fraction was significantly decreased（P＜0.01），NT-proBNP concentration was increased（P＜0.01）.The rat heart was enlarged，accompanied with edema，and the anterior wall of the left ventricle was significantly sunken.HE staining data showed that myocardial tissues were irregular arrangement.Gastrocnemius tissue looked dull and felt loose.The grip strength，the weight of gastrocnemius，and the cross-sectional area of muscle fiber were significantly decreased（P＜0.01）.Western Blot indicated that atrophy related protein expressions of Atrogin-1，MurF-1，and FOXO1 were significantly elevated，while MyHC expression was decreased（P＜0.05）.Conclusions：FOXO1-Atrogin-1/MuRF-1 pathway plays an important role in chronic heart failure combined with skeletal muscle atrophy.The establishment of this model provides an experimental basis for clinical prevention and treatment of chronic heart failure combined with skeletal muscle atrophy.

Keywords" "chronic heart failure; skeletal muscle atrophy; N-terminal pro-brain natriuretic peptide; ejection fraction; experiment research

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的最終歸屬［1］，慢性心力衰竭的患病率隨著我國人口老齡化問題的加劇而呈現(xiàn)逐年增加趨勢［2］。慢性心力衰竭病人最常見的癥狀之一是運(yùn)動耐量的降低，表現(xiàn)為活動后出現(xiàn)疲勞、乏力和呼吸困難等，而這一系列癥狀的出現(xiàn)不僅是病人心臟射血分?jǐn)?shù)降低的原因，還與病人的骨骼肌出現(xiàn)萎縮密切相關(guān)［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，大部分慢性心力衰竭病人在早期就有外周骨骼肌組織的減少［5］，其疲乏、氣短的癥狀也會隨著骨骼肌出現(xiàn)萎縮而逐漸加重。骨骼肌出現(xiàn)萎縮不僅導(dǎo)致慢性心力衰竭病人日常生活受到限制，還明顯增加了其發(fā)病率和死亡率，導(dǎo)致病人的病情進(jìn)展和不良預(yù)后［6-8］。本研究構(gòu)建慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮模型，通過觀察骨骼肌組織形態(tài)學(xué)和涉及萎縮相關(guān)的指標(biāo)，探討慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮涉及的分子靶點(diǎn)，為臨床對該疾病的防治提供思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取6周齡的雄性無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級SD大鼠16只，體質(zhì)量（200±10）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的SPF級動物房。動物房實(shí)驗(yàn)條件為室溫（23±2）℃，濕度（50±5）%，光暗周期為12 h交替1次，大鼠可以自由獲得飼料和水。本實(shí)驗(yàn)研究中涉及的操作符合《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，并通過華北理工大學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)（批號：LX201851）。

1.1.2 主要試劑與儀器 N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）試劑盒（Andy gene，貨號：AD202104）；蘇木精染色液（Baso，貨號：c210402）；伊紅染色液（Baso，貨號：c201102）；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（ZOMANBIO，貨號：ZD304A-2）；5×上樣緩沖液（Report，貨號：RP-WA0301）；三色預(yù)染Marker（BIOTIDES，貨號：WB1902）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Roche，貨號：43487300）；10×SDS-PAGE電泳緩沖液500 mL（普利萊，B1005）；10×蛋白電泳電轉(zhuǎn)移緩沖液 500 mL（SOLARBIO，貨號：D1060）；20×TBST 500 mL（SOLARBIO，貨號：T1082）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）（Report，貨號：RP-WA0601）；Anti-Myosin heavy chain antibody［JF097-7］（華安生物，貨號：ET1702-88）；Anti-FOXO1A antibody［SU33-01］（華安生物，貨號：ET1608-25）；Anti-GAPDH Antibody［SA30-01］（華安生物，貨號：ET1601-4）；Anti-MuRF-1 antibody（ABclonal，貨號：A3101）；Anti-Atrogin-1 antibody（華安生物，貨號：JE 41-27）；二抗（兔抗大鼠，北京普利萊，貨號：C1309）。

組織脫水機(jī)、組織切片機(jī)（LEICA，TP1020、RM2245）；顯微鏡（OLYMPUS，BX53）；凝膠成像儀（美國，BIO-RAD 伯樂）；電泳槽（君意，JY-ZY5）；電泳儀（君意，JY600C）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 正常雄性SPF級SD大鼠16只，動物房內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為模型組（8只）和假手術(shù)組（8只）。參考之前大鼠心力衰竭模型的制備［9］，采用左側(cè)冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)造模。模型組大鼠以1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后行內(nèi)鏡下氣管插管，并連接小動物呼吸機(jī)。大鼠固定后剃毛、消毒，打開左胸第3肋、第4肋間，在距離左心耳1.0～1.5 mm處結(jié)扎前降支。假手術(shù)組大鼠麻醉后開胸，縫合針帶線穿過與模型組相同位置的淺層，不做結(jié)扎，余操作同模型組。結(jié)扎完成后在心臟表面滴1滴利多卡因，逐層縫合胸壁，然后腹腔注射利多卡因和呋塞米各0.1 mL，術(shù)后連續(xù)注射青霉素（8×105 U/d）3 d。在第3天檢測心電圖（12導(dǎo)聯(lián)心電圖，走紙速度25 mm/s），12個(gè)導(dǎo)聯(lián)中以出現(xiàn)6～8個(gè)Q波作為早期心力衰竭造模成功的篩選標(biāo)準(zhǔn)［10］。在心力衰竭模型成功的基礎(chǔ)上，繼續(xù)喂養(yǎng)12周。12周后通過小動物超聲檢測心臟射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF），大鼠拉力測定儀測定大鼠抓力。以4%多聚甲醛固定心臟梗死區(qū)邊緣的心肌組織，用于蘇木精-伊紅（HE）染色。分離并獲得大鼠左下肢的腓腸肌，稱重后切為兩半，一半以4%多聚甲醛固定，另一半快速凍存于液氮中。

1.2.2 大鼠心臟EF和NT-proBNP的檢測 術(shù)后12周，采用小動物超聲測定大鼠心臟EF。從大鼠腹主動脈抽取血液，經(jīng)過離心，獲得血清，嚴(yán)格遵照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒說明書檢測NT-proBNP水平。

1.2.3 心肌、腓腸肌病理切片的制備 取出已固定的心肌和腓腸肌組織，流水沖洗過夜，常規(guī)石蠟包埋，心臟組織5 μm 切片，腓腸肌組織4 μm 切片。HE染色：在二甲苯和不同梯度的乙醇中進(jìn)行切片脫蠟，以蘇木精染色，5 min后用自來水稍沖洗；1%的鹽酸水溶液分化10 s；自來水返藍(lán)15 min；置伊紅染色液3 min；95%乙醇（Ⅰ）脫水5 min，吸干液體；95%乙醇（Ⅱ）脫水5 min，吸干液體；無水乙醇（Ⅰ）5 min，吸干液體；無水乙醇（Ⅱ）10 min后吸干液體；二甲苯（Ⅰ）中透明2 min；二甲苯（Ⅱ）中透明5 min，用中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下觀察并采集病理圖片。

1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western Blot）測定大鼠腓腸肌中萎縮相關(guān)蛋白的表達(dá) 用600 μL組織裂解液（Report，中國）裂解100 mg腓腸肌，12 000 r/min離心15 min后吸取上清。通過二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒測定樣品的總蛋白濃度，加入 5×蛋白上樣緩沖液混合后，在100 ℃水浴中進(jìn)行蛋白變性5 min。配制凝膠，進(jìn)行電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜后，封閉液封閉1 h，TBST洗膜1次，依次孵育稀釋后的一抗肌球蛋白重鏈（MyHC）（兔抗大鼠，1∶1 000）、Atrogin-1 （兔抗大鼠，1∶1 000）、肌肉環(huán)指蛋白-1（muscle ring-finger protein-1，MuRF-1）（兔抗大鼠，1∶1 000）、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1）（兔抗大鼠，1 ∶1 000）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（兔抗大鼠，1∶1 000），4 ℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜3次，分別加入二抗（羊抗兔，1∶5 000），室溫下孵育1 h后TBST洗膜3次，均勻加入發(fā)光液，放在BIO-RAD凝膠成像儀里曝光條帶，后期使用ImageJ軟件計(jì)算條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心力衰竭模型的建立 術(shù)后3 d進(jìn)行心電圖檢測，結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠心電圖大致正常；模型組大鼠心電圖在V2～V6和（或）Ⅰ、aVL導(dǎo)聯(lián)上出現(xiàn)明顯的病理性Q波，可作為心力衰竭模型成模的早期篩選標(biāo)準(zhǔn)［10］。見圖1。手術(shù)后12周，模型組大鼠的心臟EF值降低至50%以下，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），血清NT-proBNP濃度增加，是假手術(shù)組的兩倍多（P＜0.01），詳見表1。取材發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的心臟明顯增大、水腫，左心室前壁凹陷明顯，詳見圖2。HE染色結(jié)果：假手術(shù)組大鼠的心肌組織比較緊密，模型組大鼠的心肌組織相對疏松，細(xì)胞間隙增寬，詳見圖2。

2.2 大鼠骨骼肌萎縮情況 術(shù)后12周，假手術(shù)組大鼠的下肢粗壯有力，肌肉相對堅(jiān)實(shí)；模型組大鼠的下肢偏瘦弱，肌肉相對松弛，同時(shí)抓力測定儀顯示其抓力明顯下降（P＜0.01）。取材后肉眼可見，假手術(shù)組腓腸肌豐厚飽滿，顏色鮮紅，模型組腓腸肌疏松，顏色有些暗淡，且其重量較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.01）。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腓腸肌肌纖維的肌間隔明顯增寬，肌纖維橫截面積明顯縮小，呈現(xiàn)不規(guī)則多邊，提示慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮發(fā)生（P＜0.01）。詳見表2及圖3。

2.3 兩組大鼠腓腸肌組織中MyHC、Atrogin-1、MuRF-1和FOXO1蛋白表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組骨架蛋白MyHC表達(dá)較假手術(shù)組明顯降低，進(jìn)一步提示腓腸肌出現(xiàn)萎縮。檢測萎縮關(guān)鍵調(diào)控指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠Atrogin-1、MuRF-1和FOXO1的蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。詳見表3及圖4、圖5。

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球心力衰竭病人數(shù)大約為2 600萬例，加重了社會醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)［11］。我國2020年發(fā)布的《中國心血管健康與疾病報(bào)告》提示，因心力衰竭住院病人的病死率為4.1%［12］。由此可見，心力衰竭的防治非常重要。近幾年，研究者越來越重視骨骼肌在慢性心力衰竭病變進(jìn)展中的作用［8］。慢性心力衰竭病人骨骼肌的病變表現(xiàn)為肌肉質(zhì)量的減少與功能的降低。從組織病理學(xué)的角度看，主要表現(xiàn)為Ⅰ型纖維比率下降，Ⅱ型纖維比率相對增加，脂肪組織沉積，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量減少以及功能下降［13］。慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮的發(fā)病機(jī)制尚處于研究中，多種因素參與其中，如血管緊張素、促炎癥生長因子、肌肉生長抑制素、睪酮、血供受損等［13-14］。這些因素造成氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等的出現(xiàn)，引發(fā)骨骼肌蛋白質(zhì)合成與分解失衡，最終引起骨骼肌萎縮［15］。本實(shí)驗(yàn)研究中，首先通過大鼠左側(cè)冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)建立慢性心力衰竭模型，動物繼續(xù)飼養(yǎng)12周，出現(xiàn)抓力降低，腓腸肌重量減輕，肌纖維橫截面積減小，骨架蛋白MyHC表達(dá)下降，提示大鼠慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮模型成功建立。此模型的建立可為研究慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮的發(fā)病機(jī)制以及藥物防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

骨骼肌蛋白降解的方式包括溶酶體途徑、泛素-蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome system，UPS）和Ca2＋依賴性途徑［16］。其中，泛素-蛋白酶體途徑在蛋白降解中發(fā)揮重要作用［17］。該途徑主要由泛素、泛素相關(guān)酶和蛋白酶體3部分組成，涉及MuRF-1和肌肉萎縮相關(guān)的F-box蛋白（muscle atrophy F-box，MAFbx/Atrogin-1）兩個(gè)關(guān)鍵酶［18］。這兩個(gè)關(guān)鍵酶的表達(dá)升高，能促進(jìn)蛋白降解，參與多種疾病伴發(fā)的骨骼肌萎縮過程［18］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MuRF-1通過降解粗肌絲中含有肌球蛋白結(jié)構(gòu)域的其他蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)肌肉萎縮［19］。Atrogin-1通過下調(diào)蛋白質(zhì)的起始因子eIF3-f，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而造成肌肉萎縮［20］。在不同因素誘導(dǎo)的肌肉萎縮模型中，均可見MuRF-1和Atrogin-1的表達(dá)升高，而抑制MuRF-1和Atrogin-1的表達(dá)，則可減少肌肉的降解［21-22］。由此可見，在骨骼肌萎縮調(diào)控過程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶MuRF-1和Atrogin-1可作為臨床上治療慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮的干預(yù)靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腓腸肌組織中MuRF-1和Atrogin-1的蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，提示MuRF-1和Atrogin-1通過促進(jìn)蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致骨骼肌萎縮的發(fā)生。轉(zhuǎn)錄因子叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FOXO）是具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的一類蛋白，研究發(fā)現(xiàn)FOXO1能與MuRF-1和Atrogin-1轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)兩者的表達(dá)［23］。研究發(fā)現(xiàn)，特異性敲除小鼠骨骼肌中FOXO1基因，可以抑制肌萎縮的發(fā)生［24］。同時(shí)，如果骨骼肌出現(xiàn)萎縮，不僅FOXO1的表達(dá)會升高，Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)也會上調(diào)，肌肉萎縮加重［25-26］。本實(shí)驗(yàn)研究獲得與上述研究相似結(jié)果，萎縮的腓腸肌中FOXO1表達(dá)增加，提示在慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮的過程中轉(zhuǎn)錄因子FOXO1表達(dá)升高，通過上調(diào)蛋白降解中的兩個(gè)關(guān)鍵酶MuRF-1和Atrogin-1的表達(dá)，共同參與骨骼肌萎縮的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，在慢性心力衰竭合并骨骼肌萎縮的過程中，F(xiàn)OXO1表達(dá)升高，同時(shí)調(diào)控肌肉中蛋白降解相關(guān)的基因MuRF-1和Atrogin-1，共同促進(jìn)骨骼肌萎縮的發(fā)生。對于FOXO1、MuRF-1和Atrogin-1的調(diào)控，可能成為臨床上防治心力衰竭合并骨骼肌萎縮的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2022-02-27）

（本文編輯郭懷?。?/p>