摘要 目的：基于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路探究沉默CircRNA-100395對心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用。方法：選取36只大鼠，按照脂質(zhì)體2000說明書對細胞進行轉(zhuǎn)染CircRNA-100395 mimics及CircRNA-100395 inhibitor，將其分為缺血再灌注組、缺血預(yù)處理組、過表達組、沉默組。采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）法檢測各組CircRNA-100395表達量；采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測MAPK蛋白、磷酸化p38蛋白（p-p38）、氨基末端激酶（p-JNK）蛋白表達量；比較各組心率、左心室舒張壓（LVDP）、左心室收縮壓（LVSP）。結(jié)果：缺血預(yù)處理組、過表達組CircRNA-100395表達量、LVSP水平明顯低于缺血再灌注組，心率、LVDP水平及MAPK通路蛋白明顯高于缺血再灌注組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沉默組CircRNA-100395表達量、LVSP水平明顯高于缺血預(yù)處理組、過表達組，LVDP、心率水平明顯低于缺血預(yù)處理組、過表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；過表達組MAPK通路蛋白表達量明顯高于缺血預(yù)處理組，沉默組MAPK通路蛋白表達量明顯低于過表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：CircRNA-100395可能通過作用于MAPK信號通路，也可能通過沉默CircRNA-100395表達量減輕大鼠心肌細胞缺血再灌注損傷。

關(guān)鍵詞 心肌細胞缺血再灌注損傷；絲裂原活化蛋白激酶；CircRNA-100395；血流動力學；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.05.009

心肌缺血再灌注損傷（cardiac reperfusion injury）一般指的是冠狀動脈出現(xiàn)了急性梗阻的現(xiàn)象，最常采用的灌注有預(yù)先短暫缺血及再灌注兩種，在經(jīng)過一段時間之后可能會恢復(fù)正常，重新獲得了正常灌注，但是可能會對冠狀動脈組織造成損傷［1-2］。經(jīng)灌注后可有效減輕后續(xù)較長時間缺血造成的損傷，其次缺血再灌注時間的差異性可對心肌造成不同結(jié)果的影響，但當再灌注后缺血心肌的功能恢復(fù)后便可迅速恢復(fù)正常；如長時間心肌血供完全中斷，則造成心肌細胞不可逆性損傷、壞死，即心肌梗死［3-5］。本研究探討絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路沉默CircRNA-100395對心肌細胞缺血再灌注損傷大鼠的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究動物 48只大鼠購自河南天地藥業(yè)股份有限公司［動物編號：SYXK（豫）2021－0002］，體質(zhì)量251～305（264.10±25.65）g，喂養(yǎng)大鼠1周，每日均對大鼠進行光照12 h，本研究經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑 聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增儀以及免疫蛋白印跡法（Western Blot）電泳儀均購于美國Bio-Rad公司；細胞株購于蘇州瑞諾德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床標本收集與細胞培養(yǎng) 將心肌細胞放置在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與分組 應(yīng)用脂質(zhì)體2000試劑將CircRNA-100395 inhibitor及CircRNA-100395 mimics轉(zhuǎn)染心肌細胞，分為缺血預(yù)處理組、過表達組、沉默組，轉(zhuǎn)染24 h后將細胞正常培養(yǎng)，并于－80 ℃保存，供后續(xù)實驗使用，而缺血再灌注組不做任何特殊處理。

1.2.3 建模方法 將36只大鼠分為缺血再灌注組、缺血預(yù)處理組、過表達組、沉默組，各9只，缺血預(yù)處理組、過表達組、沉默組首先參照宜全等［6］實驗進行心肌缺血建模。建模方法：術(shù)前12 h大鼠禁食，注射10%水合氯醛麻醉，麻醉后將大鼠固定在鼠板上，氣管切開后連接呼吸機，連接心電圖機實施心電監(jiān)測。在大鼠胸部左側(cè)第3肋與第4肋間處剪開皮膚并分離各層肌肉露出肋骨，持剪刀剪開第3肋骨、第4肋骨，并拉開胸壁，暴露其心臟，用止血鉗將胸腺夾住，將左心耳與肺動脈圓錐間穿7-0絲線。詳見圖1。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察各組心肌組織病理學變化。

1.2.4 CircRNA-100395表達量檢測 采集所有大鼠心肌組織，2 000 r/min 4 ℃離心10 min。離心后收集miRNA。CircRNA-100395正向引物序列：5′-GTTTTCCCAGTC ACGAC-3′，反向引物序列：5′-CAGGAAACAGCTAT GAC-3′。U6正向引物序列：5′-ACACAAAGCCGCT CCATCAG-3′，反向引物序列：5′-GACTGGTCCA ATTGA CAAGC-3′。PCR擴增：取上述0.02 mL DNA提取液加入分裝好的反應(yīng)液管中，實時熒光定量PCR提取血清加入0.1 mL樣品稀釋液。

1.2.5 心率檢測 采用迪姆軟件（北京）有限公司DMS300-4A動態(tài)心電記錄器檢測心率，將大鼠固定為仰平臥位，剃去貼放電極位置處的體毛，用75%乙醇棉球涂擦電極安置部位局部皮膚表面，并用小砂片輕磨皮面，降低皮膚電阻，將電極粘貼在皮膚表面，準備好記錄盒，將記錄盒裝進專用套子，從大鼠身上按順序拆卸記錄盒后連接計算機，輸入信息后，將診斷條進行裝訂。

1.2.6 左心室舒張壓（left ventricular diastolic pressure，LVDP）、左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）水平檢測 采用24 h動態(tài)血壓檢測，通過血壓監(jiān)測儀，對大鼠進行動態(tài)血壓監(jiān)測，以了解大鼠24 h血壓情況。

1.2.7 MAPK信號通路蛋白檢測 采用Western Blot法檢測MAPK蛋白、磷酸化p38蛋白（p-p38 protein，p-p38）、氨基末端激酶（amino-terminal kinase，p-JNK）蛋白表達量，取所有大鼠心肌蛋白，提取50 μg蛋白，把5×蛋白上樣緩沖液注入4∶1的體積中。經(jīng)過增強型化學發(fā)光試劑（ECL）顯色和曝光后，進行BIO-RAD成像，檢測條帶的灰度值，分析統(tǒng)計結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計處理。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織病理學變化 缺血再灌注組大鼠心肌組織無病理改變且心肌細胞正常。缺血預(yù)處理組模型大鼠心肌組織間質(zhì)膠原沉積明顯增多。過表達組大鼠心肌細胞凋亡且出現(xiàn)壞死。沉默組大鼠心肌炎癥細胞及纖維細胞浸潤數(shù)量明顯減低，心肌細胞水腫及間質(zhì)充血程度減輕。詳見圖2。

2.2 各組大鼠CircRNA-100395表達量比較 缺血預(yù)處理組、過表達組CircRNA-100395表達量明顯低于缺血再灌注組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沉默組CircRNA-100395表達量明顯高于缺血預(yù)處理組、過表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；過表達組CircRNA-100395表達量明顯低于缺血預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 各組大鼠心率、LVSP、LVDP比較 缺血預(yù)處理組、過表達組心率、LVDP水平明顯高于缺血再灌注組，LVSP水平明顯低于缺血再灌注組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；過表達組心率、LVDP水平明顯高于缺血預(yù)處理組，LVSP水平明顯低于缺血預(yù)處理組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沉默組LVSP水平明顯高于過表達組，LVDP、心率水平明顯低于過表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沉默組心率、LVDP水平明顯低于缺血預(yù)處理組，LVSP水平明顯高于缺血預(yù)處理組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.4 各組大鼠MAPK信號通路表達量比較 缺血預(yù)處理組、過表達組MAPK、p-p38、p-JNK蛋白表達量明顯高于缺血再灌注組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；過表達組MAPK、p-p38、p-JNK蛋白表達量明顯高于缺血預(yù)處理組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；沉默組MAPK、p-p38、p-JNK蛋白表達量明顯低于缺血預(yù)處理組、過表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表3、圖3。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷一般指冠狀動脈部分或者是完全急性梗阻之后，如果癥狀比較嚴重可以通過心臟搭橋手術(shù)來進行緩解［7-8］。缺血時間越長，可逆性損傷的細胞數(shù)越少，再灌注后可能恢復(fù)正常功能的組織越少［9-10］。目前認為其發(fā)病機制主要與細胞內(nèi)氧自由基的大量產(chǎn)生、鈣離子超負荷、白細胞的炎癥作用以及高能磷酸化合物缺乏有關(guān)，缺血引起的心肌超微結(jié)構(gòu)、能量代謝、心功能和電生理一系列損傷性變化，在血管再通后表現(xiàn)得更為突出，甚至可以發(fā)生嚴重的心律失常和猝死［11-13］。在探究心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制及治療的過程中，使用組織分析等方法誘導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷動物模型被廣泛采用。

經(jīng)研究顯示，心肌缺血再灌注損傷大鼠均存在不同程度的心肌細胞損傷，目前臨床上多采用血液流動學指標評估心肌缺血再灌注損傷損傷程度［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA-100395在心肌缺血再灌注損傷大鼠中有著傳導(dǎo)及調(diào)控信號通路作用［15］，由此認為CircRNA-100395可作為預(yù)測心肌缺血再灌注損傷的指標之一。Deguchi等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷大鼠血中有多個miRNA存在差異性表達，心肌缺血再灌注損傷與CircRNA-100395相關(guān)。溫藝紅等［17］研究進一步證明，心肌細胞異常大鼠CircRNA-100395表達量明顯降低，其診斷心肌細胞的敏感度與特異度均較高。提示CircRNA-100395與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病密切相關(guān)，可作為心肌缺血再灌注損傷有效的診斷標志物。Nah 等［18］研究表明，CircRNA-100395可能是一個潛在的預(yù)測心肌細胞是否存在異常的標志物，在心肌成纖維細胞中顯著降低。最近研究發(fā)現(xiàn)，CircRNA-100395可作為一個新的敏感性生物學標志物，可能是各種原因造成不同表達量與心肌缺血再灌注損傷相關(guān)。但在現(xiàn)有研究中，CircRNA-100395大多是在惡性腫瘤中表達，在心肌缺血再灌注損傷中的相關(guān)報道較少。本研究檢測心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織內(nèi)CircRNA-100395表達量，同樣發(fā)現(xiàn)CircRNA-100395在心肌缺血再灌注損傷大鼠中呈低表達量，說明CircRNA-100395能夠反映大鼠心肌缺血再灌注損傷情況， CircRNA-100395參與了疾病的發(fā)病過程，可作為治療及診斷心肌缺血再灌注損傷的一個新靶點。

有多項研究報道，通過抑制炎癥反應(yīng)等途徑，可有效減輕心肌細胞的損害，促進心肌細胞修復(fù)和再生，從而有效改善心功能［19］。MAPK信號通路可以有效抑制心肌細胞的表達，參與心肌損傷過程，對下游功能性基因的表達促進了細胞存活。孟慶莉等［20］研究證明，MAPK通路參與了心肌過程，經(jīng)沉默CircRNA-100395后可降低磷酸化活性，如MAPK被激活便會誘導(dǎo)心肌細胞的凋亡、炎癥及免疫。李昌等［21］研究發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK信號通路后可有效降低MAPK活性。以上研究證明，MAPK信號通路參與了心肌細胞的遷移過程，CircRNA-100395水平在心肌缺血再灌注損傷大鼠中表現(xiàn)為下降趨勢，與本研究結(jié)果一致，說明MAPK信號通路在疾病發(fā)病機制中起到重要作用，通過抑制MAPK信號通路可促進功能性基因的表達，促進心肌細胞存活。

綜上所述，沉默CircRNA-100395經(jīng)作用于MAPK信號通路后，可減少心肌細胞的損傷，且對心肌細胞起到保護作用。

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（收稿日期：2021-12-24）

（本文編輯郭懷?。?/p>