摘 要：【目的】水晶蜜柚原產(chǎn)于馬來(lái)西亞，是海南柚類(lèi)的主栽品種之一，但有關(guān)水晶蜜柚果實(shí)無(wú)籽的原因未見(jiàn)報(bào)道，探究水晶蜜柚果實(shí)無(wú)籽原因可為蜜柚高效栽培和育種提供理論依據(jù)。【方法】從水晶蜜柚的花粉活力與萌芽率、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂，花粉管伸長(zhǎng)熒光顯微觀(guān)察、雜交實(shí)驗(yàn)、胚胎胚囊石蠟切片觀(guān)察等細(xì)胞學(xué)角度研究水晶蜜柚果實(shí)的無(wú)籽機(jī)理。【結(jié)果】水晶蜜柚活力強(qiáng)的花粉76.58%，萌芽率88.48%；花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂正常，但出現(xiàn)異常二分體和三分體現(xiàn)象；水晶蜜柚雜交的花粉管能伸長(zhǎng)至子房并到達(dá)胚珠，完成受精作用，而自交的花粉管只能伸長(zhǎng)到花柱中下部，到達(dá)不了子房，不能完成受精作用；水晶蜜柚胚胎胚囊石蠟切片顯示不做處理和自交的胚胎發(fā)育一致，前期發(fā)育正常，能觀(guān)察到胚胎從幼胚發(fā)育到魚(yú)蕾形胚，魚(yú)雷形胚時(shí)胚囊出現(xiàn)中空異常狀態(tài)，珠柄消失；雜交的胚胎能從幼胚正常發(fā)育到子葉胚，珠柄未消失，有發(fā)育成種子的跡象；水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交的坐果率為21%，其自交和去雄套袋不授粉的坐果率只有3% 和2%；雜交所得的果實(shí)的種子為飽滿(mǎn)可育的種子，其自交和去雄套袋不授粉的種子為敗育和退化的種子。【結(jié)論】水晶蜜柚花粉育性正常，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂正常，胚囊正常可育，水晶蜜柚無(wú)籽的原因是自交不親和且具有單性結(jié)實(shí)能力。

關(guān)鍵詞：水晶蜜柚；無(wú)籽機(jī)理；花粉管伸長(zhǎng)；胚胎發(fā)育

中圖分類(lèi)號(hào)：S667 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2023）04—0209—09

柚Citrus maxima（Burm.）Merr 屬蕓香科柑橘屬喬木植物，是柑橘類(lèi)中最大的水果，同時(shí)也是柑橘中重要的一類(lèi)果實(shí)[1]。水晶蜜柚原產(chǎn)于馬來(lái)西亞，在海南省澄邁縣種植，具有無(wú)籽、皮薄、肉質(zhì)細(xì)嫩、汁液豐富、香甜可口等優(yōu)良性狀，以其“無(wú)籽”著稱(chēng)，又名“無(wú)籽蜜柚”，成為海南柚類(lèi)重要的栽培品種之一[2]，水晶蜜柚不僅含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且耐儲(chǔ)存、上市時(shí)間早，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，具有明顯的市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。無(wú)籽是鮮食蜜柚的一個(gè)優(yōu)良性狀，也是新品種選育的目標(biāo)之一。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，引起柑橘果實(shí)無(wú)籽的原因包括雄性不育、雌性器官不育、胚胎敗育、自交不親和性和單性結(jié)實(shí)[3]。

雄性不育是指植物在發(fā)育過(guò)程中雄性器官發(fā)育不完全導(dǎo)致的形態(tài)和功能異常。雄性不育可分為核雄性不育（MS）和細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）[4]。導(dǎo)致雄性不育的主要因素是花藥及花粉母細(xì)胞退化、減數(shù)分裂不正常和環(huán)境因素[5]。溫州蜜柑在減數(shù)分裂時(shí)出現(xiàn)異常，形成的花粉量不僅少而且多為干癟敗育的花粉[6]。黔陽(yáng)無(wú)核大紅甜橙[7]、無(wú)核甌柑[8]、無(wú)核（少核）紅江橙[9] 等品種的無(wú)核性都是因?yàn)樾坌圆挥?/p>

植物受精和產(chǎn)生種子的場(chǎng)所都在胚囊，胚囊發(fā)育是否正常關(guān)系到種子是否能形成。當(dāng)胚囊出現(xiàn)敗育和花器官形態(tài)外部出現(xiàn)異常時(shí)植物雌性器官表現(xiàn)不育，果實(shí)無(wú)核。大多數(shù)柑橘品種都存在著不同程度的胚囊敗育現(xiàn)象[10]。麗椪2 號(hào)果實(shí)出現(xiàn)無(wú)核是因?yàn)榕吣野l(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)為高度敗育，胚囊敗育在四核時(shí)期，沒(méi)有觀(guān)察到分裂為八核期的胚囊[11]；桂林良豐無(wú)核椪柑也是果實(shí)胚囊發(fā)育到四核期時(shí)出現(xiàn)敗育[12]；特晚熟紅桔JZT（P）-1果實(shí)在發(fā)育過(guò)程中胚珠中的孢原細(xì)胞、胚囊原始細(xì)胞和不同發(fā)育程度的胚囊都出現(xiàn)了敗育現(xiàn)象，導(dǎo)致果實(shí)無(wú)核[13]。

植物雌雄蕊都正常發(fā)育，授粉受精后合子在發(fā)育過(guò)程中發(fā)生異常，從而引起胚胎敗育形成無(wú)核果的現(xiàn)象稱(chēng)為胚胎敗育。江西椪柑無(wú)核的原因有3 點(diǎn)，一是雄配子減數(shù)分裂時(shí)異常，二是自交時(shí)出現(xiàn)了胚胎敗育，三是與鄂柑一號(hào)雜交時(shí)也出現(xiàn)了胚胎敗育[14]；南豐蜜橘果實(shí)無(wú)核則是由于合子胚在自交和雜交授粉4 周后出現(xiàn)了敗育[15]；無(wú)核貢柑和安農(nóng)無(wú)核蜜香柚果實(shí)無(wú)核的原因也是胚胎敗育造成的[16-17]。

自交不親和（Self-incompatibility，SI）是開(kāi)花植物防止自交受精和近親繁殖的重要機(jī)制。與煙草、油菜、甘藍(lán)、罌粟等模式植物相比，果樹(shù)因其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、雜合度較高，SI 分子研究相比較遲緩。近年來(lái)，分子生物技術(shù)快速發(fā)展，果實(shí)SI 分子機(jī)制研究取得了很大成果。有研究表明薔薇科、蕓香科等果樹(shù)自交不親和的雌性決定因子是S-RNase[18]，雄性決定因子是SLF 和SFB 兩個(gè)F-box 基因[19]。S-RNase 基因和SLF 基因可以相互作用，兩者分別在花柱和花粉中特異表達(dá)。如果花粉F-box 基因與花柱S-RNase 基因相碰撞，花粉會(huì)分泌S-RNase來(lái)降解花粉管的RNA，導(dǎo)致花粉管在花柱無(wú)法生長(zhǎng)，從而表現(xiàn)為不親和性反應(yīng)；如果花粉F-box 基因與花柱S-RNase 基因不相碰撞，花粉就不會(huì)分泌S-RNase，花粉管則能穿過(guò)柱頭到達(dá)子房完成受精，這時(shí)表現(xiàn)為半親和性反應(yīng)或完全親和反應(yīng)[20]。

除了上述原因外，單性結(jié)實(shí)和染色體數(shù)目變異也是導(dǎo)致柑桔果實(shí)無(wú)籽的原因[10]。

果實(shí)無(wú)籽是水晶蜜柚和其他柑橘的優(yōu)良性狀之一。目前，未見(jiàn)有關(guān)澄邁水晶蜜柚無(wú)籽原因的報(bào)道，其S 基因型也未鑒定。為了更好地利用水晶蜜柚種質(zhì)，首先從細(xì)胞學(xué)角度分析其無(wú)籽的具體原因。以澄邁水晶蜜柚和三紅蜜柚為實(shí)驗(yàn)材料，水晶蜜柚花期與三紅蜜柚花期相近，三紅蜜柚花粉預(yù)實(shí)驗(yàn)表明其花粉有活力能正常萌發(fā)，且三紅蜜柚S 基因型已被鑒定，其S 基因型為S8S9[21]。下一步可以在分子生物學(xué)水平繼續(xù)探索其無(wú)籽性狀的分子機(jī)理，篩選與無(wú)籽相關(guān)的基因，豐富柚類(lèi)無(wú)籽的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為全面認(rèn)識(shí)水晶蜜柚無(wú)籽機(jī)理奠定基礎(chǔ)。因此，研究水晶蜜柚無(wú)籽的原因，對(duì)豐富柑橘無(wú)籽的理論依據(jù)和育種者在實(shí)際工作中使用這一性狀具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

以種植于海南省澄邁縣洪安蜜柚基地的水晶蜜柚（無(wú)籽）和種植于海南省澄邁縣海膠閩星基地的三紅蜜柚為試驗(yàn)材料。于2021 年2 月7 日采集數(shù)朵含苞待放的水晶蜜柚健康花蕾、不同直徑大小的花苞、授粉后的雌蕊和數(shù)朵含苞待放的三紅蜜柚健康花蕾帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2 方 法

1.2.1 花粉育性相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1）花粉活力測(cè)定：將采集到的2 種健康花蕾剝開(kāi)，取2 ～ 3 枚花藥于載玻片上，加1 滴蒸餾水，用鑷子將花藥搗碎，使花粉釋放，再加1-2 滴I2-KI 溶液（1g I2，2 g KI/300 ml），蓋上蓋玻片，用濾紙吸走多余的染液，在顯微鏡下觀(guān)察。根據(jù)染色后花粉粒的顏色來(lái)判斷花粉活力，活力強(qiáng)的花粉顏色呈藍(lán)黑色，活力弱或內(nèi)含物少的花粉呈黃褐色，沒(méi)有活力的花粉則為無(wú)色。重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)制作5 個(gè)玻片，每個(gè)玻片取5 個(gè)視野觀(guān)察統(tǒng)計(jì)，每個(gè)視野不少于30 ?；ǚ哿22]。

2）花粉萌芽率測(cè)定：花粉培養(yǎng)基選用固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基選用1% 瓊脂、0.01% 硼酸和10% 蔗糖進(jìn)行配制，將適量花粉均勻涂抹在固體培養(yǎng)基表面，在25±2°C條件下培養(yǎng)48 h 后觀(guān)察，重復(fù)3 次，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑作為萌發(fā)的標(biāo)志，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的花粉數(shù)量[23]。

1.2.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀(guān)察

于水晶蜜柚現(xiàn)蕾期晴天上午采集發(fā)育正常、不同直徑大小的花苞，用新鮮配制的卡諾固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1）進(jìn)行固定12 h 以上，然后置于70% 乙醇4℃保存?zhèn)溆?。取出保存的花蕾，用濾紙吸去多余保存液，鑷子挑出2 ～ 3 枚花藥置于載玻片上，加入1 滴改良卡寶品紅染色液，用鑷尖輕輕搗碎花藥，去除殘?jiān)?，蓋上蓋玻片，再蓋上1 張濾紙，用拇指均勻用力輕輕擠壓，使分裂相分散，選擇不同時(shí)期分裂相典型的花粉母細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，觀(guān)察30 ～ 40 張玻片并在40 倍下拍照記錄[24]。

1.2.3 雜交試驗(yàn)

人工授粉試驗(yàn)設(shè)置為3 組：水晶蜜柚× 水晶蜜柚（自交）；水晶蜜柚× 三紅蜜柚（雜交）；水晶蜜柚去雄套袋不授粉。選擇大小一致的200朵健康花進(jìn)行試驗(yàn)，父本為新鮮的花粉，于果實(shí)成熟期統(tǒng)計(jì)果實(shí)數(shù)量與果實(shí)種子數(shù)。

1.2.4 花粉管伸長(zhǎng)熒光顯微觀(guān)察

授粉組合水晶蜜柚× 水晶蜜柚和水晶蜜柚×三紅蜜柚授粉后2、4、14、24、48、72、96 h、1 周采集雌蕊，用卡諾固定液固定12 h，然后轉(zhuǎn)入70% 乙醇，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取出樣品后小心轉(zhuǎn)移到裝有8 mol/L NaOH 溶液的培養(yǎng)皿中，軟化約12 h，然后用蒸餾水清洗3次，此時(shí)，樣品比較軟，近乎透明，在常溫避光條件下用0.1% 苯胺藍(lán)溶液（NaH2PO4-Na2HPO4·12H2O，pH=8）染色約4 h，然后把樣品放在載玻片上，用蓋玻片輕輕壓住封片，在熒光顯微鏡10 倍下觀(guān)察拍照，每個(gè)時(shí)間段重復(fù)3 次[22]。

1.2.5 雌配子體的育性觀(guān)察

取樣：采集水晶蜜柚不同大小的健康花（現(xiàn)蕾3、6、9、12 d，剛開(kāi)花、謝花、幼果）。授粉組合水晶蜜柚自交、水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交后24、48、72、96 h、2 周、3 周，分別采集子房或幼果。

固定：采集的樣品用卡諾固定液固定約12 h。倒去固定液轉(zhuǎn)入70% 乙醇中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

固定好的樣品采用常規(guī)石蠟切片法進(jìn)行切片觀(guān)察[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3 次平行試驗(yàn)的平均值，用SPSS 26.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水晶蜜柚和三紅蜜柚花粉的活力

水晶蜜柚和三紅蜜柚花粉的活力如表1 所示?？梢钥闯?，兩個(gè)品種柚子的花粉都有活力?；ǚ廴旧Y(jié)果為藍(lán)黑色和黃褐色，藍(lán)黑色的花粉表現(xiàn)為活力強(qiáng)，黃褐色的花粉表現(xiàn)為活力弱。水晶蜜柚活力強(qiáng)的花粉占比比三紅蜜柚高，達(dá)到了顯著差異，相應(yīng)的活力弱的花粉百分比較低，也達(dá)到了顯著差異。

2.2 水晶蜜柚和三紅蜜柚的花粉萌芽率

花粉萌發(fā)率分3 個(gè)時(shí)間段觀(guān)察（12、24、48 h）（表2），12 h 有少量的花粉萌發(fā)，48 h 時(shí)花粉基本萌發(fā)完畢，水晶蜜柚花粉的萌發(fā)率88.48%，而三紅蜜柚的萌發(fā)率只有51.69%，兩者達(dá)到了顯著差異。從兩個(gè)品種柚子的花粉活力和萌發(fā)率來(lái)看，兩者的花粉（雄配子）育性正常。

2.3 水晶蜜柚花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀(guān)察

減數(shù)分裂是植物生殖細(xì)胞形成的重要環(huán)節(jié)。圖1 為水晶蜜柚花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的分裂相，水晶蜜柚花粉母細(xì)胞能正常經(jīng)過(guò)兩次減數(shù)分裂，即前期Ⅰ（圖1A）、中期Ⅰ（圖1B）、后期Ⅰ（圖1C）、前期Ⅱ（圖1D）、中期Ⅱ（圖1E）、后期Ⅱ（圖1F）、四分體時(shí)期（圖1G）。細(xì)胞處于減數(shù)分裂末期Ⅰ時(shí)，細(xì)胞分裂形成1 個(gè)雙核細(xì)胞，染色質(zhì)沒(méi)有解聚，這種細(xì)胞質(zhì)不分裂的現(xiàn)象，被稱(chēng)為胞質(zhì)同時(shí)型。細(xì)胞處于減數(shù)分裂末期Ⅱ時(shí)，由1 個(gè)雙核細(xì)胞形成4 個(gè)染色體減半的細(xì)胞，花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂結(jié)束之后進(jìn)入四分體時(shí)期，形成四核細(xì)胞，核之間產(chǎn)生胼胝質(zhì)壁形成左右對(duì)稱(chēng)、排列方式主要為四面體型的四分體孢子，沒(méi)有觀(guān)察到其他類(lèi)型的四分體。在四分體時(shí)期觀(guān)察發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂過(guò)程中有部分二分體（圖1J）和三分體（圖1K）出現(xiàn)了異?，F(xiàn)象，觀(guān)察統(tǒng)計(jì)303 個(gè)細(xì)胞，其中異常二分體的數(shù)量為10 個(gè)，比例為3.30%；異常三分體數(shù)量為41 個(gè)，比例為13.53%。之后進(jìn)入單核期，在胼胝質(zhì)酶的酶解下，幼期單核花粉粒從四分體中釋放出來(lái)，形成游離狀態(tài)的小孢子，細(xì)胞核處于細(xì)胞中央，細(xì)胞體積相對(duì)小。雙核期單核靠邊期的小孢子進(jìn)行1 次有絲分裂形成2 個(gè)細(xì)胞核，體積大的為營(yíng)養(yǎng)核，體積小的為生殖核。

2.3 雜交試驗(yàn)

雜交試驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，不同的雜交組合果實(shí)坐果率和種子均存在差異。水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交所得的果實(shí)比其自交和去雄套袋不授粉多，水晶蜜柚雜交坐果率達(dá)21%，而其自交和去雄套袋不授粉則只有3% 和2%。水晶蜜柚雜交所獲得的種子有3 種形態(tài)，其中平均每個(gè)果的飽滿(mǎn)種子數(shù)為156.6 個(gè)，退化種子數(shù)為14 個(gè)，敗育種子數(shù)為11.1 個(gè)；其自交和去雄套袋不授粉沒(méi)有飽滿(mǎn)的種子，自交的果實(shí)有少量的敗育種子，而去雄套袋不授粉的只有退化的種子。

2.4 花粉管伸長(zhǎng)熒光顯微觀(guān)察

對(duì)水晶蜜柚自交和雜交（三紅蜜柚花粉作父本）的花粉管進(jìn)行熒光顯微觀(guān)察，對(duì)比兩者之間花粉管的伸長(zhǎng)情況。從熒光顯微觀(guān)察可看出，雜交授粉2 h 后有少量花粉開(kāi)始萌芽，長(zhǎng)出了花粉管（圖2A）；雜交48 h 后花粉管通過(guò)乳突細(xì)胞伸長(zhǎng)至花柱中部（圖2B，圖2C），沿著花柱道向下生長(zhǎng)；雜交授粉96 h 后，花粉管伸長(zhǎng)至花柱基部（圖2D，圖2E），進(jìn)一步向子房生長(zhǎng)；授粉1 周后，逐漸有花粉管向子房生長(zhǎng)（圖2F），在子房?jī)?nèi)部可觀(guān)察到花粉管。自交的花粉管伸長(zhǎng)跟雜交明顯不同，自交授粉14 ～ 24 h 后，可觀(guān)察到大量花粉在柱頭萌發(fā)并通過(guò)乳突細(xì)胞伸長(zhǎng)至花柱上部（圖2G，圖2F）；自交授粉48 h 后，少部分的花粉管伸長(zhǎng)到了花柱中部（圖2I）；到自交授粉后72 h時(shí)還可觀(guān)察到極少數(shù)花粉管的生長(zhǎng)（圖2J），伸長(zhǎng)至花柱中下部；自交授粉96 h 后，在花柱基部已經(jīng)觀(guān)察不到花粉管的生長(zhǎng)（圖2K），說(shuō)明花粉管伸長(zhǎng)不到花柱基部，自交授粉1 周后在子房也沒(méi)有觀(guān)察到花粉管（圖2L）。

花粉管伸長(zhǎng)熒光顯微觀(guān)察說(shuō)明水晶蜜柚雜交花粉管能伸長(zhǎng)至子房到達(dá)胚珠，完成受精，而自交的花粉管無(wú)法到達(dá)子房，不能完成受精。因此，初步推測(cè)水晶蜜柚自交不親和。

2.5 雌配子體的育性觀(guān)察

選取水晶蜜柚從現(xiàn)蕾期到幼果期的子房進(jìn)行石蠟切片觀(guān)察其胚囊發(fā)育情況，再選取水晶蜜柚自交和雜交后的子房進(jìn)行石蠟切片對(duì)比觀(guān)察其胚胎發(fā)育情況。從切片的觀(guān)察結(jié)果得知，從現(xiàn)蕾期到開(kāi)花期，水晶蜜柚的胚囊生長(zhǎng)正常，此時(shí)能從幼胚（圖3A）觀(guān)察到球形胚（圖3B）的形成。到幼果期時(shí)，可觀(guān)察到胚囊由心形胚（圖3C）向魚(yú)雷形胚（圖3D）發(fā)育。進(jìn)入了分化時(shí)期，心形胚是左右兩邊對(duì)稱(chēng)、頂端扁平的結(jié)構(gòu)，因類(lèi)似心形故稱(chēng)心形胚，它是由球形胚發(fā)育形成的，心形胚進(jìn)一步發(fā)育成魚(yú)雷形胚，因其頂端扁平結(jié)構(gòu)進(jìn)化發(fā)育成兩枚微微突起的子葉，形狀類(lèi)似魚(yú)雷；魚(yú)雷形胚最終發(fā)育成子葉胚。但在幼果期沒(méi)有觀(guān)察到魚(yú)雷形胚發(fā)育成子葉胚，而是在魚(yú)雷胚的時(shí)候胚囊開(kāi)始出現(xiàn)中空狀態(tài)（圖3D），珠柄消失，極核降解，珠被退化。

水晶蜜柚自交和雜交的子房切片從授粉后24 h、48 h、72 h、96 h、2 周和3 周6 個(gè)時(shí)間段進(jìn)行觀(guān)察，從切片觀(guān)察結(jié)果可看出，水晶蜜柚雜交授粉胚囊的發(fā)育歷程為：幼胚（圖3K）→球形胚（圖3L）→心形胚（圖3M）→魚(yú)蕾形胚（圖3N）→子葉形胚（圖3O）。子葉胚繼續(xù)正常發(fā)育，有發(fā)展成種子的跡象，其大部分珠柄還存在。水晶蜜柚自交授粉后24 ～ 96 h 期間，同雜交授粉觀(guān)察結(jié)果一樣，觀(guān)察到幼胚（圖3F）和球形胚（圖3G），自交授粉2 周后出現(xiàn)了心形胚（圖3H）、魚(yú)雷形胚（圖3I），魚(yú)雷胚發(fā)育到3 周時(shí)大部分胚囊出現(xiàn)了中空現(xiàn)象（圖3J），珠被逐漸退化，珠柄消失，胚珠逐漸瓦解。結(jié)果表明，水晶蜜柚不做處理時(shí)與其自交的胚胎發(fā)育一致，前期發(fā)育均正常，后期有大部分胚囊出現(xiàn)中空狀態(tài)。雜交的胚胎前期也正常發(fā)育，后期少量胚囊中空，大部分胚囊正常，沒(méi)有出現(xiàn)胚胎中途敗育或異?，F(xiàn)象，與人工授粉實(shí)驗(yàn)收獲的果實(shí)種子形態(tài)一致。說(shuō)明水晶蜜柚的胚囊是可育的。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

水晶蜜柚花粉育性正常，沒(méi)有雄性不育和雌性不育的特性；水晶蜜柚異花授粉時(shí)花柱能在柱頭正常萌發(fā)，花粉管伸長(zhǎng)至花柱和子房；自花授粉時(shí)花粉能在柱頭上萌發(fā)，但在花柱中停止伸長(zhǎng)，在子房沒(méi)有觀(guān)察到花粉管。表明水晶蜜柚自交不親和，其無(wú)籽是由自交不親和導(dǎo)致的。

3.2 討 論

I2-KI 法染色原理是有生活力的花粉里積累的淀粉遇碘后變藍(lán)，所以判定的方法是染色后變藍(lán)的花粉是有生活力的。這與實(shí)際測(cè)定的結(jié)果有偏差，因?yàn)?，淀粉積累的含量與花粉敗育階段有關(guān)，花粉敗育早期積累的淀粉少或者沒(méi)有積累，染色時(shí)則會(huì)呈現(xiàn)無(wú)色或淺色，花粉敗育晚期，淀粉積累的含量會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，這時(shí)染色會(huì)變深，而這些花粉是沒(méi)有活力的，另外，花粉失去了活力，而淀粉沒(méi)有被水解，這時(shí)花粉也會(huì)顯色[26-27]。在本研究中，花粉經(jīng)I2-KI 染色后，觀(guān)察到的水晶蜜柚花粉有大部分呈藍(lán)黑色，少部分呈黃褐色，而三紅蜜柚花粉則相反，大部分花粉呈黃褐色，少部分花粉呈藍(lán)黑色。染成藍(lán)黑色的花粉粒說(shuō)明淀粉含量高，染成黃褐色的花粉粒說(shuō)明淀粉含量低。

離體培養(yǎng)法判斷花粉是否有活力的依據(jù)是花粉萌發(fā)并長(zhǎng)出花粉管，相比較染色法更準(zhǔn)確直觀(guān)地反映花粉活力情況，與花粉真實(shí)的生活力較接近。不過(guò)離體培養(yǎng)法所需時(shí)間長(zhǎng)，操作上對(duì)花粉量有要求，固體培養(yǎng)基上涂花粉時(shí)不能過(guò)多也不能過(guò)少，涂的密度大萌芽率高，涂的密度低萌芽率低，因?yàn)榛ǚ勖劝l(fā)有“群體效應(yīng)”。涂的時(shí)候盡量不讓花粉重疊，薄薄的一層，讓每個(gè)花粉保持一定的距離最佳[26]。

水晶蜜柚花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程與花蕾大小有關(guān)，柚類(lèi)一般花蕾直徑為5.00 mm 時(shí)是減數(shù)分裂觀(guān)察的好時(shí)期，可以觀(guān)察到減數(shù)分裂的各個(gè)時(shí)期[28]。水晶蜜柚各個(gè)時(shí)期的減數(shù)分裂是正常的，是完整的減數(shù)分裂過(guò)程，第一次核分類(lèi)沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)分裂，只形成雙核細(xì)胞，胞質(zhì)分類(lèi)在第二次減數(shù)分裂結(jié)束時(shí)才發(fā)生，此時(shí)形成四個(gè)子細(xì)胞（四分體），因此，水晶蜜柚減數(shù)分裂中細(xì)胞質(zhì)分裂是同時(shí)型和大多數(shù)雙子葉植物減數(shù)分裂一致[29]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)水晶蜜柚減數(shù)分裂有出現(xiàn)二分體、三分體異常現(xiàn)象，陳欣等[30] 認(rèn)為胡楊減數(shù)分裂中出現(xiàn)三分體和二分體，可能原因是減數(shù)分裂過(guò)程中紡錘體與胞質(zhì)分裂異常；劉麗琴等[31] 則認(rèn)為荔枝減數(shù)分裂產(chǎn)生的多分體是因?yàn)樾℃咦臃稚w含有異常的染色體隨機(jī)分布于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)不均等分裂導(dǎo)致的。

胚胎胚囊敗育也是引起柑橘果實(shí)無(wú)籽的原因之一。植物一般要經(jīng)過(guò)授粉完成受精后，受精卵才能正常發(fā)育形成飽滿(mǎn)種子，如果受精卵在形成后細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，如胚胎在胚囊外發(fā)育或內(nèi)珠被細(xì)胞敗育等，則導(dǎo)致胚收縮并解體，最后產(chǎn)生空癟種子。胚胎發(fā)育是復(fù)雜且有序的，是細(xì)胞不斷變化的過(guò)程，其中任何環(huán)節(jié)出問(wèn)題都會(huì)影響胚胎發(fā)育[32-34]。水晶蜜柚雌配子體發(fā)育過(guò)程的結(jié)果表明水晶蜜柚胚囊發(fā)育正常，水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交后胚胎正常發(fā)育并形成有種子的果實(shí)。水晶蜜柚自交后胚胎發(fā)育到后期出現(xiàn)中空，珠柄消失，胚珠逐漸退化。在去雄不授粉后也能形成無(wú)籽果實(shí)，但坐果率比授粉條件低。

SI 是植物界廣泛存在的一種生殖現(xiàn)象，也是導(dǎo)致果實(shí)無(wú)籽的原因之一。本試驗(yàn)通過(guò)熒光顯微觀(guān)察水晶蜜柚花粉的發(fā)育發(fā)現(xiàn)，自交和雜交花粉均能在柱頭上黏附、萌發(fā)并通過(guò)柱頭乳突細(xì)胞伸長(zhǎng)至出花粉管，雜交授粉后2 h 時(shí)就可觀(guān)察到花粉萌發(fā)，而自交授粉后14 h 才觀(guān)察到花粉管伸長(zhǎng)。雜交授粉后的花粉管能伸長(zhǎng)至子房，完成受精。而自交授粉后的花粉管只能伸長(zhǎng)至花柱中部，花粉管不能到達(dá)子房完成受精。此外，在相同的環(huán)境下，不同授粉組合的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)速度可鑒定其親和性強(qiáng)弱[35]。

SI 是開(kāi)花植物為防止近親繁殖和促進(jìn)異交而采取的一種繁殖策略，這是一種促進(jìn)遺傳多樣性的繁殖方式[36]。廣義上，SI 可分為同態(tài)和異態(tài)兩種類(lèi)型，在異態(tài)型SI 中，自交不親和植株產(chǎn)生兩種不同類(lèi)型的花：短花柱和長(zhǎng)花柱，長(zhǎng)或短的心皮分別與短或長(zhǎng)的雄蕊配對(duì)[37]。在同態(tài)型SI 中，來(lái)自同一物種的花具有相同的形態(tài)。同態(tài)型SI 又可分為兩種類(lèi)型：配子體自交不親和（gametophyticself-incompatibility，GSI） 和孢子體自交不親（sporophytic self-incompatibility，SSI）。這取決于參與不親和反應(yīng)的花粉粒的基因組[38]。在GSI 中，SI 是基于花粉的單倍體基因型（即配子體），在SSI 中，它是基于親本（即孢子體）的二倍體基因[39]。SSI 的抑制發(fā)生在柱頭上。而GSI 的抑制在花柱中[40]。本研究中，水晶蜜柚自交不親和表現(xiàn)為花粉可以黏附在柱頭上萌發(fā)，花粉管通過(guò)乳突細(xì)胞伸長(zhǎng)至花柱中部，然后停止生長(zhǎng)，這種不親和的特征表現(xiàn)為配子體自交不親和（GSI）類(lèi)型。

坐果率是反應(yīng)親和性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，本研究中水晶蜜柚3 個(gè)授粉組合坐果率的結(jié)果顯示，水晶蜜柚自交和去雄套袋不授粉兩個(gè)組合的坐果率很低，只有2% 和4%，而雜交組合的坐果率為21%，與花粉管熒光顯微觀(guān)察的結(jié)果大致符合。

本研究從細(xì)胞學(xué)水平闡明了水晶蜜柚果實(shí)無(wú)籽的原因是其自交不親和，但關(guān)于水晶蜜柚自交不親和的分子調(diào)控機(jī)制尚未明確。學(xué)者們對(duì)柑桔自交不親和的分子調(diào)控機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展，挖掘出許多候選基因。因此，未來(lái)可深入研究水晶蜜柚自交不親和的分子調(diào)控機(jī)制，挖掘出相關(guān)的調(diào)控基因。

參考文獻(xiàn)：

[1] 汪奇. 我國(guó)柚品種（ 系） 選育分析及海南柚種質(zhì)資源收集、鑒定與初步評(píng)價(jià)[D]. 海口： 海南大學(xué)，2021.

WANG Q. Breeding analysis of pomelo varieties （lines） in Chinaand collection ，identification and preliminary evalution of pomelogermplasm resources in Hainan[D]. Haikou： Hainan Univertity，2021.

[2] DB46/T 414-2016 無(wú)籽蜜柚生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程[S]. 海口： 海南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2017.

DB46/T 414-2016 Technical regulations for production ofseedless honey pomelo[S]. Haikou： Hainan provincial qualityand Technical Supervision Bureau，2017.

[3] 肖祥希， 李明， 邱棟梁. 果實(shí)無(wú)核機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2009，27（2）：104-10.

XIAO X X， LI M， QIU D L. Research progress of seedlessmechanism of fruits[J]. Non-wood Forest Research，2009，27（2）：104-10.

[4] 曹慶芹， 伊華林， 鄧秀新. 果樹(shù)雄性不育研究進(jìn)展[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2005，22（6）：678-681.

CAO Q X， YI H L， DENG X X. Advances in research on madesterility in fruit crops[J]. Journal of Fruit Science，2005，22（6）：678-681.

[5] 張彥昌， 趙德英， 馬駿. 果樹(shù)雄性不育機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 河北林果研究， 2008，23（1）：66-69.

ZHANG Y C，ZHAO D Y，Ma J. Study on male sterility of fruittrees[J]. Forestry and Ecological Sciences，2008，23（1）：66-69.

[6] 胡志勇， 伊華林， 鄧秀新. 國(guó)慶一號(hào)溫州蜜柑小孢子發(fā)育過(guò)程及其分期[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2005，22（5）：567-569.

HU Z Y， YI H L， DENG X X. Microspore developmen and itsstages in Citrus unshiu [J]. Journal of Fruit Science. 2005， 22（5）：567-569.

[7] 邱文明.“ 黔陽(yáng)無(wú)核” 椪柑無(wú)核機(jī)理及雄性不育相關(guān)基因發(fā)掘[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

QIU W M. Mechanism of seedlessness in ‘Qianyang seedless’ponkan mandarin and identification of male sterility relatedgenes[D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University.2013.

[8] 劉志輝.“ 無(wú)子甌柑” 雄性不育的細(xì)胞與分子機(jī)理研究[D]. 杭州： 浙江農(nóng)林大學(xué)， 2015.

LIU Z H. Studies on the cytological and molecular mechanismreferring ‘Wuzi Ougan’. [D]. Hangzhou：Zhejiang A amp; FUniversity，2015.

[9] 王平， 馬培恰， 唐小浪， 等. 無(wú)核紅江橙的無(wú)核成因探討[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016，43（10）：64-68，2.

WANG P， MA P Q， TANG X L， et al. Study on the seedlessmechanism of seedless ‘Hongjiangcheng’[J]. GuangdongAgricultural Sciences， 2016，43（10）：64-68，2.

[10] 王向東， 秦朝， 蘇靜， 等. 柑桔無(wú)核機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)南方果樹(shù)， 2012，41（3）：60-63.

WANG X D， QIN C， SU J， et al. Progress of research onthe mechanism of citrus nucleation[J]. South China Fruits，2012，41（3）：60-63.

[11] 肖金平， 譚金娟， 劉海琳， 等. 麗椪2 號(hào)椪柑無(wú)核機(jī)制研究[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2007，24（4）：421-426.

XIAO J P， TAN J J， LIU H L， et al. Studies on the seedlessmachanism of Liping No.2 Ponkan（Citrus reticulata）[J]. Journalof Fruit Science， 2007，24（4）：421-426.

[12] CHEN L S， WANG S Y. Studies on cytology and embryology ofguilin-liangfeng seedless ponkan （Citrus reticulata Blanco）[J].Acta Horticulturae. 1995. Doi： 10.17660/ACTAHORTIC.1995.403.2.

[13] 周心智， 尤淑芬， 張?， 等. 特晚熟紅桔JZT（P）-1 胚珠敗育的胚胎學(xué)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2011，27（28）：231-234.

ZHOU X Z， YOU S F， ZHANG Y， et al. Embryological researchon the ovule abortion developmen of super late-maturing cultivarJZT（P）-1 Tanggerine[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，2011，27（28）：231-234.

[14] 張雅菁， 程玉芳， 伊華林. 椪柑無(wú)核優(yōu)系的細(xì)胞學(xué)研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2016，35（3）：6-11.

ZHANG Y J， CHENG Y F， YI H L. Cytological mechanisms ofthe elite seedless ponkan accessions[J]. Journal of HuazhongAgricultural University， 2016， 35（3）：6-11.

[15] 余楊， 王微， 楊曉伶. 南豐蜜橘無(wú)核成因的研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2011，38（4）：631-636.

YU Y， WANG W， YANG X L. Causes of seedless forming of NanfengTangerine[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2011，38（4）：631-636.

[16] 王平， 唐小浪， 吳文， 等.‘ 無(wú)核貢柑’ 的無(wú)核機(jī)理[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009，30（7）：965-969.

WANG P， TANG X L， WU W， et al. Seedless mechanism ofcitrus ‘Seedless Gonggan’[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，2009，30（7）：965-969.

[17] 蔣文君， 楊文學(xué)， 匡曉東， 等. 安農(nóng)無(wú)核蜜香柚無(wú)核機(jī)理的研究[J]. 浙江柑桔， 2000，17（2）：47-48.

JIANG W J， YANG W X， KUANG X D， et al. Study on themechanism of nucleus-free mechanism of Anong’s nucleus-freehoney grapefruit[J]. Zhejiang Ganju， 2000，17（2）： 47-48.

[18] BROOTHAERTS W， KEULEMANS J， VAN NERUM I. Selffertileapple resulting from S-RNase gene silencing[J]. Plant CellReports， 2004.22（7）：497-501.

[19] USHIJIMA K， SASSA H， DANDEKAR A M， et al. Structural andtranscriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond：identification of a pollen-expressed F-box gene with haplotypespecificpolymorphism[J]. Plant Cell.2003.15（3）：771-781.

[20] 何敏， 谷超， 吳巨友， 等. 果樹(shù)自交不親和機(jī)制研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào)， 2021，48（4）：759-777.

HE M， GU C， WU J Y， et al. Recent advances on self-incompatibilitymechanism in fruit trees[J]. Acta Horticulturae Sinica，2021，48（4）：759-777.

[21] 梁梅. 柑橘自交不親和相關(guān)基因鑒定及其演化[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

LIANG M， Gene identification and evolution of self-incompatibilityof Citrus.[D]. Wuhan.Huazhong Agricultural University.2020.

[22] 段青， 蔡晶晶， 杜文文， 等. 大麗花花粉活力及離體萌發(fā)研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2022，38（7）：52-61.

DUAN Q， CAI J J， DU W W， et al. Pollen viability and in vitrogermination of Dahlin Cultivars[J]. Chinese Agricultural ScienceBulletin， 2022，38（7）：52-61.

[23] 季璇， 郭紹霞， 孫欣， 等.4 個(gè)蘋(píng)果觀(guān)賞品系開(kāi)花、授粉習(xí)性及花粉管萌發(fā)的熒光顯微觀(guān)察[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017，49（5）：34-38，45.

JI X， GUO S X， SUN X，et al. Flowering and pollination habitand fluorescence microexamination of pollen tube germination offour ornamental apple strains[J]. Shandong Agricultural Science，2017，49（5）：34-38，45.

[24] 高居榮， 宋雪皎， 王樹(shù)蕓， 等. 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂細(xì)胞及染色體變化研究[J]. 實(shí)驗(yàn)室科學(xué)， 2017，20（6）：6-9.

GAO J R， SONG X J， WANG S Y，et al. Study on the changesof- cells and chromosomes in pollen mother cells meiosis[J].Laboratory Science， 2017，20（6）：6-9.

[25] 王成， 李在留. 一種改進(jìn)的石蠟切片技術(shù)在植物雌性不育研究中的應(yīng)用[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2015，44（2）：174-176.

WANG C， LI Z L. Application of an improved paraffin sectionmethod in plant female sterility[J]. Guangxi Forestry Science，2015，44（2）：174-176.

[26] 孫愛(ài)芹， 常偉光， 韓斌， 等. 不同棗品種花粉生活力及貯藏方法研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2010，26（1）：166-168.

SUN A Q， CHANG W G， HAN B，et al. Study on pollen viabilityand storage methods of different Chinese Jujubes[J]. ChineseAgricultural Science Bulletin， 2010，26（1）： 166-168.

[27] 秦曉君， 潘磊， 牛永志， 等. 煙草花粉活力檢測(cè)方法篩選[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（ 自然科學(xué)版）， 2020，42（3）：592-598.

QIN X J， PAN L， NIU Y Z，et al. Screening on the methods fordetecting the pollen viability of Nicotiana[J]. Journal of YunnanUniversity （Natural Sciences Edition）， 2020，42（3）：592-598.

[28] 范學(xué)翠， 秦永華， 葉自行， 等. 無(wú)籽八月橘花粉育性觀(guān)察[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（ 自然科學(xué)版）， 2010，39（3）：246-250.

FAN X C， QIN Y H， YE Z X，et al. Pollen fertility of the newmandarin cultivar Wuzibayueju（Citrus reticulata Blanco）[J]. Journalof Fujian Agriculture and Forestry University （Natural Science"Edition）， 2010，39（3）：246-250.

[29] 葛潔， 張?jiān)聠蹋?田樹(shù)娟， 等. 西瓜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程觀(guān)察[J]. 中國(guó)瓜菜， 2020，33（3）：16-22.

GE J， ZHANG Y Q， TIAN S J，et al. Observation on meiosisprocess of watermelon pollen mother cell[J]. China Cucurbitsand Vegetables， 2020，33（3）：16-22.

[30] 陳欣， 楊倩， 張平冬， 等. 胡楊小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂與花粉變異研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 2015，30（2）：90-95.

CHEN X， YANG Q， ZHANG P D，et al. Studies on meiosis ofmicrospore mother cell and variations of pollen grains in populuseuphratica[J]. Journal of Northwest Forestry University， 2015，30（2）：90-95.

[31] 劉麗琴， 石勝友， 李偉才， 等. 荔枝花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀(guān)察[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2015，32（2）：254-258，351.

LIU L Q， SHI S Y， LI W C，et al. Meiotic observations of thepollen mother cells of Litchi chinenisis sonn[J].Journal of FruitScience， 2015，32（2）：254-258，351.

[32] 楊轉(zhuǎn)英， 王惠聰， 豐鋒， 等. 荔枝果實(shí)敗育發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014，41（23）：31-34.

YANG Z Y， WANG H C， FENG F， et al. Research- progress oncauses of seed abortion in litchi fruit[J]. Guangdong AgriculturalSciences， 2014，41（23）：31-34.

[33] 肖華山， 呂柳新. 荔枝雌花發(fā)育過(guò)程中花藥敗育的超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察[J]. 福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（ 自然科學(xué)版），2008，24（1）：70-73.

XIAO H S， LV L X. Observation on ultrastructure of antherabortion in the process of litchi（litchi chinensis sonn.）femal flower development[J]. Journal of Fujian NormalUniversity（Natural Science Edition）， 2008，24（1）：70-73.

[34] XU-YUAN Y， HUAI-YU M， GUO-CHENG L， et al. Anatomicalstudy on the multi-ovule development and abortion of Hanfuapple[J]. Journal of Integrative Agriculture. 2014，13（4）：770-777.

[35] 田青蘭， 吳艷艷， 張英俊， 等. 西番蓮自交和異交的花粉管熒光顯微觀(guān)察及授粉親和性分析[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2022，40（1）：98-110.

TIAN Q L， WU Y Y， ZHANG Y J，et al. Pollen tube fluorescencemicroscopic observation and pollination compatibility analysis ofself and cross-pollination of passion fruit （Passiflora edulis）[J].Journal of Fruit Science， 2022，40（1）：98-110.

[36] YAMAMOTO M， NISHIO T. Commonalities and differencesbetween Brassica and Arabidopsis self-incompatibility[J]. HorticultureResearch.2014，1， doi：10.1038/hortres.2014.54.eColletion 2014.

[37] COCKER J M， WRIGHT J， LI J， et al. Primula vulgaris（primrose） genome assembly， annotation and gene expression，with comparative genomics on the heterostyly supergene[J].Scientific Reports.2018， doi.org/10.1038/s41598-018-36304-4.

[38] FUJII S， KUBO K-I， TAKAYAMA S. Non-self- and selfrecognitionmodels in plant self-incompatibility[J]. Nature Plants.2016，2（9）：16130.

[39] TAKAYAMA S， ISOGAI A. Molecular mechanism of selfrecognitionin Brassica self-incompatibility[J]. Journal ofexperimental botany. 2003，54（380）： 149-156.

[40] WHEELER M J， DE GRAAF B H J， HADJIOSIF N， et al.Identification of the pollen self-incompatibility determinant inPapaver rhoeas[J]. Nature. 2009，459（7249）：992-995.

[ 本文編校：趙 坤]