摘 要：【目的】找尋有益于新疆野蘋果植株生長發(fā)育的優(yōu)良菌株，為新疆野蘋果葉片微生物資源的研究與利用提供依據(jù)?！痉椒ā恳孕陆疤O果葉片為研究對象，利用稀釋分離法分離內(nèi)生細(xì)菌，通過16SrDNA 基因測序和序列比對，對菌株進(jìn)行分類。通過配制不同功能培養(yǎng)基對內(nèi)生菌株進(jìn)行功能鑒定，并進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，研究其促生特性?！窘Y(jié)果】共鑒定出24 株菌株，分屬于2 個屬的6 個種，其中芽孢桿菌屬Bacillus 23 株、賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus 1 株。通過對這24 株菌株進(jìn)行功能鑒定，篩選出4 株具有解磷作用的菌株及3 株具有分泌IAA 功能的菌株。盆栽促生試驗(yàn)結(jié)果表明，篩選出的優(yōu)質(zhì)功能菌株HDM4 和HC2 均具有促進(jìn)幼苗生長的能力，促生效果較為明顯的是葉綠素含量和維生素C 含量。與對照組相比：經(jīng)HDM4 菌液處理后葉綠素含量和維生素C 含量分別提高了50.7% 和43.4%；經(jīng)HC2 菌液處理后葉綠素含量和維生素C 含量分別提高了47.5% 和58.0%；經(jīng)HDM4 菌液處理后株高和莖直徑分別增加了12.4% 和6.4%；經(jīng)HC2 菌液處理后株高和莖直徑分別增加了29.5% 和37.2%?！窘Y(jié)論】芽孢桿菌屬廣泛分布于新疆野蘋果葉片中。篩選出的內(nèi)生細(xì)菌具解磷或分泌IAA 的能力，并具有促進(jìn)幼苗生長的能力。

關(guān)鍵詞：新疆野蘋果；葉片內(nèi)生細(xì)菌；分離鑒定；促生效果

中圖分類號：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）04—0228—09

新疆野蘋果Malus sieversii 是栽培蘋果的主要砧木之一，是世界蘋果基因庫極為重要的組成部分[1]。近年來，由于自然災(zāi)害和人為活動的影響，新疆野蘋果分布日益衰退[2]，因此，亟待加強(qiáng)新疆野蘋果的保護(hù)及提升其對生長環(huán)境的適應(yīng)能力[3]。

植物組織中普遍存在內(nèi)生菌，并且較多內(nèi)生菌具有促進(jìn)植物生長、防治病害及抗逆境等作用[4-5]，能夠作為重要的生防資源加以開發(fā)利用。前人在水稻、玉米等作物中均獲得了具有生防作用的內(nèi)生細(xì)菌[6]。李芳等[7] 采用組織培養(yǎng)的方法從新疆野蘋果莖段中分離出能夠促進(jìn)新疆野蘋果生長的內(nèi)生真菌，該菌株還具有增強(qiáng)新疆野蘋果抗干旱、鹽堿等脅迫的能力，并且不會產(chǎn)生有毒物質(zhì)。尹坤等[8] 從藥用稻中分離到1 株具有較高的解磷、分泌生長素等能力的細(xì)菌，且該菌株對水稻有較好的促進(jìn)萌發(fā)和生長的效果。趙凱鵬[9]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛內(nèi)生菌可以產(chǎn)生吲哚-3- 乙酸等與植物生長相關(guān)的激素，并能促進(jìn)鐵皮石斛生長，提升其品質(zhì)。

目前，有關(guān)新疆野蘋果的研究報道集中于形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方面，鮮見對其內(nèi)生菌的分離、鑒定和應(yīng)用研究的報道。本研究中采集不同來源和類型新疆野蘋果的健康葉片，采用組織勻漿法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定，并對功能菌株進(jìn)行篩選和促生效果研究，以期獲得能夠促進(jìn)植株生長的有益細(xì)菌。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

新疆野蘋果葉片采自伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)果園以及鞏留縣、新源縣、霍城縣的共9 個生境地。伊犁州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)果園（81°38′E，43°93′N）海拔693 m，樣株種下類型包含霍城紅霞果（GB-12）、長柄大黃綠果（GB-13）、晚花野蘋果（GD-3）、小花野蘋果（GD-10）、黃綠野蘋果（GD-12）、效果矮蘋果（GD-14）、紅扁圓果（HDM-11）、小紅扁圓果（HDM-12）、紅紋野蘋果（HDM-21）、短梗野蘋果（XY-39）、圓頭野蘋果（XY-41）、短圓野蘋果（XY-43）、直萼野蘋果（XY-51）、圓錐野蘋果（XY-53）、多棱野蘋果（XY-86）。鞏留縣采樣地為阿勒瑪塞、澆爾塞、經(jīng)啟克塞3 個地區(qū)，分別編號為GL-1、GL-2、GL-3；新源縣采樣地為薩哈、薩哈中、果樹王3 個地區(qū)，分別編號為XY-1、XY-2、XY-3；霍城縣采樣地為小西溝、大西溝、大東溝3 個地區(qū)，分別編號為HC-1、HC-2、HC-3。各采樣地的地理位置信息見表1。

2022 年8 月采集1 年生枝條上無病害及腐爛發(fā)霉?fàn)顩r的健康葉片，每份樣品采集30 片，保存于4 ℃冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基，LB 培養(yǎng)基，Ashby 無氮培養(yǎng)基[10]，NBRIP 無機(jī)磷培養(yǎng)基[11]。

1.2 方 法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化

先將樣品用自來水沖洗干凈，再用無菌水沖洗1 ～ 2 min。之后依次用75% 乙醇、5.2% 的次氯酸鈉溶液浸泡，用無菌水漂洗6 ～ 8 次后，使用無菌的紗布蘸干水分，備用[12]。

采用稀釋分離法分離內(nèi)生細(xì)菌。將經(jīng)表面滅菌的葉片置于無菌研缽中研磨，將研磨液倒入含有少量無菌水的三角瓶中搖勻。采用梯度稀釋法進(jìn)行稀釋，將不同濃度的研磨液涂布于NA培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和Ashby 無氮培養(yǎng)基中，倒置3 ～ 5 d。若有菌落長出，及時分離純化并編號記錄，挑選最后1 次的單個菌落進(jìn)行斜面保存[13]。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將已分離純化的純菌株采用革蘭氏染色法進(jìn)行染色。在顯微鏡下觀察各菌株的形態(tài)，包括形狀、大小、顏色、革蘭氏染色情況等，拍照并記錄其特征，對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)分類鑒定[14]。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定

使用Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒（B518255）提取具有活性且無其他細(xì)菌污染的細(xì)菌純培養(yǎng)物的DNA。使用微量紫外分光光度計（SMA4000）測定DNA 濃度和純度，使用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析DNA 的完整性。

使用25 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系，包括DNA 聚合酶12.5 μL、引物（F/R） 各1 μL、DNA 模板1 μL、9.5 μL DNase/RNase-free 水。將PCR 產(chǎn)物純化后進(jìn)行測序，使用Gene Bank 和NCBI 基因庫對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比較分析，根據(jù)相似度對菌株進(jìn)行鑒定和歸類。使用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌的篩選

解磷能力測定[15-16]： 取已純化的菌株在NBRIP 無機(jī)磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 ～ 5 d，測量菌落透明的解磷圈直徑（φ P）和菌落直徑（φ C），計算菌株的溶解指數(shù)（solubilization index，IS）和溶解效率（solubilization efficiency，ES）。

IS=（φ C+φ P）/φ C；ES=φ P/φ C。

植物生長素IAA 分泌能力測定[17]：取已活化的菌株制備菌液，采用Salkowski 比色法進(jìn)行比色，用液體培養(yǎng)基代替菌懸液作為空白對照，每個處理3 次重復(fù)，測出530 nm 波長下的光密度，計算各菌株的IAA 含量。

1.2.5 內(nèi)生細(xì)菌的生理生化特性測定

分別篩選出具有解磷能力和分泌IAA 能力的菌株進(jìn)行生理生化特性的測定[14]。

1.2.6 內(nèi)生細(xì)菌的促生能力測定

將野蘋果種子在75% 酒精中浸泡2 min，在3%次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，用無菌水沖洗，然后放置在含有相同量營養(yǎng)土的盆中。待幼苗長至20 cm 時，每盆分別根灌50 mL 菌液（600 nm 波長下的光密度為0.6 ～ 0.8）。菌液分別選用解磷能力最強(qiáng)的細(xì)菌和分泌IAA 能力最強(qiáng)的細(xì)菌，空白對照選用等量的LB 液體培養(yǎng)基，每隔7 d 灌溉1 次。待處理組與對照組植株長勢出現(xiàn)明顯差異時，使用游標(biāo)卡尺測量莖直徑，使用直尺測量株高，使用葉綠素儀測定葉綠素含量，采用鉬藍(lán)比色法測定維生素C 含量。各指標(biāo)均重復(fù)測定3 次，拍照并記錄[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離的內(nèi)生細(xì)菌

從新疆野蘋果葉片中分離得到24 株內(nèi)生細(xì)菌，各菌株編號見表2。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征

自新疆野蘋果葉片中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌的表現(xiàn)特征呈現(xiàn)差異性，單個菌落在顏色、大小、形狀、表面隆起情況、邊緣狀況以及質(zhì)地上存在不同（圖1、表3），經(jīng)革蘭氏染色均呈現(xiàn)陽性。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的類別

將分離得到的24 株優(yōu)勢活性內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行基因組DNA 提取，所提取的基因組DNA 主帶明顯，并能滿足PCR 擴(kuò)增所需的濃度和純度。擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 480 bp，條帶清晰，擴(kuò)增效果較好。

通過測序和序列比對，發(fā)現(xiàn)24 株細(xì)菌菌株分別屬于芽孢桿菌屬Bacillus 和賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus。其中，11 株為短小芽孢桿菌B. pumilus，3 株為萎縮芽孢桿菌B. atrophaeus，2 株為地衣芽孢桿菌B. licheniformis，2 株為枯草芽孢桿菌B. subtilis；1 株為貝萊斯芽孢桿菌B. velezensis，1 株為細(xì)長賴氨酸芽孢桿菌L. macroides，還有2 株僅鑒定為芽孢桿菌屬，暫未鑒定出種。部分細(xì)菌在不同的種下類型中出現(xiàn)，例如：芽孢桿菌屬中的短小芽孢桿菌在HDM-12、HDM-11、XY-39、GD-3、GD-10、XY-53、XY-51、XY-43、GD-12 以及鞏留地區(qū)的樣品中均有分離出； 在HDM-12、HDM-11 和HDM-21 的樣品中均可分離出萎縮芽孢桿菌；存在于霍城地區(qū)樣品中的枯草芽孢桿菌也存在于GD-14 和GB-13 樣品中；存在于XY-43 樣品中的地衣芽孢桿菌也存在于GD-3、GD-10、XY-53 以及霍城地區(qū)和新源地區(qū)等的樣品中。

如圖2 所示， 菌株HDM3、HDM2、GL1、GL3、XY5、XY6、XY1、HDM4、GD4、GL2、GL4、GD3、GD2 與短小芽孢桿菌位于同一發(fā)育分枝上，相似率為99.8% ～ 100.0%，結(jié)合菌株形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，鑒定該菌株為短小芽孢桿菌；菌株HDM5、HDM6、HDM1 與萎縮芽孢桿菌位于同一發(fā)育分枝上，相似率均達(dá)100%，結(jié)合菌株形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，鑒定其為萎縮芽孢桿菌；菌株XY2 和XY3 與地衣芽孢桿菌位于同一發(fā)育分枝上，且相似率較高，均為100%，結(jié)合菌株形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌；HC1 和HC2 與枯草芽孢桿菌位于同一發(fā)育分枝上，且相似率較高，為99.93%、100%，結(jié)合菌株形態(tài)及革蘭氏染色，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌；XY2 與細(xì)長賴氨酸芽孢桿菌位于同一發(fā)育分枝上，且相似率高達(dá)100%，結(jié)合菌株形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，鑒定該菌株為細(xì)長賴氨酸芽孢桿菌；XY7 與貝萊斯芽孢桿菌位于同一發(fā)育分枝上，且相似率達(dá)100%，結(jié)合菌株形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌；GD1 和GB1 屬于芽孢桿菌屬。

2.4 篩選內(nèi)生細(xì)菌的功能

2.4.1 解磷能力

從圖3 可知，有4 株內(nèi)生細(xì)菌在無機(jī)磷培養(yǎng)基中出現(xiàn)透明解磷圈，分別為HC1、HC2、XY2、HDM6。這4 株內(nèi)生細(xì)菌的解無機(jī)磷能力測定結(jié)果如表4 所示。

由表4 可知，4 株內(nèi)生細(xì)菌所釋放出的有效磷質(zhì)量濃度為25.43 ～ 33.82 mg/L，不接菌的CK 為（6.15±0.11） mg/L，其中，HC2 培養(yǎng)液中可溶性磷質(zhì)量濃度最高，HC1 培養(yǎng)液中可溶性磷質(zhì)量濃度最低，為（25.43±1.17） mg/L，但高于CK。

通過比較菌株在固體平板和液體培養(yǎng)基中對磷的分解能力，發(fā)現(xiàn)4 株內(nèi)生細(xì)菌對磷的分解能力不同。例如，在固體平板上菌株HDM6 的解磷圈比HC2 的稍大，但是兩者在液體培養(yǎng)基中的解磷能力相反，HC2 培養(yǎng)液中可溶性磷質(zhì)量濃度為（33.82±0.22） mg/L，HDM6 為（25.43±1.17） mg/L。比較內(nèi)生細(xì)菌HDM6 和XY2 的解磷能力可以發(fā)現(xiàn)，前者在固體培養(yǎng)基上的解磷圈直徑大于后者，但在液體培養(yǎng)基中后者的解磷能力大于前者。

2.4.2 IAA 分泌能力

在24 株內(nèi)生細(xì)菌中，有3 株具有分泌IAA 的能力，但存在一定差異，結(jié)果見圖4。當(dāng)顏色變粉紅表示能夠分泌IAA，HDM4、XY3、HDM5 這3株細(xì)菌均出現(xiàn)不同的紅色，圖4 中顯示顏色變深。由圖5 可知，菌株HDM4 分泌IAA 的能力最強(qiáng)，菌液中IAA 質(zhì)量濃度達(dá)92.47 mg/L。

2.5 內(nèi)生細(xì)菌的生理生化特性

根據(jù)功能鑒定結(jié)果，將篩選出的7 株優(yōu)質(zhì)細(xì)菌進(jìn)行生理生化特性鑒定。由表5 可知，7 株細(xì)菌的過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，且均為好氧細(xì)菌，果膠水解試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，HC2 的氧化酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性。

2.6 內(nèi)生細(xì)菌對新疆野蘋果幼苗的促生能力

當(dāng)處理組與對照組新疆野蘋果幼苗生長出現(xiàn)明顯差異時（培養(yǎng)30 d 后）進(jìn)行指標(biāo)測定。通過觀察幼苗生長情況可知，經(jīng)菌株HDM4 和HC2 菌懸液處理的幼苗株高、莖直徑、葉綠素含量和維生素C 含量等指標(biāo)均優(yōu)于對照組（圖6）。與對照組相比，促生效果較為明顯的是葉綠素含量和維生素C 含量，經(jīng)HDM4 菌液處理后葉綠素含量和維生素C 含量分別提高了50.7% 和43.4%；經(jīng)HC2 菌液處理后葉綠素含量和維生素C 含量分別提高了47.5% 和58.0%。

3 結(jié)論與討論

通過觀察菌落形態(tài)等性狀共計從新疆野蘋果葉片中分離出24 株內(nèi)生細(xì)菌，再結(jié)合16S rDNA序列分析，鑒定出菌株主要為芽孢桿菌屬和賴氨酸芽孢桿菌屬，其中包含了6 個種：短小芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、細(xì)長賴氨酸芽孢桿菌。表明新疆野蘋果葉片中蘊(yùn)藏著獨(dú)有的可培養(yǎng)的內(nèi)生細(xì)菌。從篩選出的具有解磷和分泌IAA 能力的菌株中，分別篩選出2 株細(xì)菌HDM4 和HC2 進(jìn)行幼苗盆栽的促生試驗(yàn)，結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)菌懸液處理，幼苗的葉綠素和維生素C 含量的變化最明顯。經(jīng)HDM4 菌液處理后葉綠素含量和維生素C 含量分別提高了50.7% 和43.4%；經(jīng)HC2菌液處理后葉綠素含量和維生素C 含量分別提高了47.5% 和58.0%。因此，HDM4 和HC2 可以促進(jìn)新疆野蘋果幼苗生物量的積累，促進(jìn)幼苗的生長，將其制成微生物肥料，不僅可以為植物提供有效的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物生長，還可以減少農(nóng)藥和化肥的使用量，改善環(huán)境。

內(nèi)生細(xì)菌廣泛分布在植物中，從植物的葉鞘、種子、花、莖、葉片和根等組織中均已分離到內(nèi)生細(xì)菌[19]。內(nèi)生細(xì)菌在植物應(yīng)對脅迫以及植物體生長發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)生細(xì)菌是篩選和開發(fā)具有植物促生和病害防控作用的微生物菌劑的重要來源。近年來，有關(guān)新疆野蘋果內(nèi)生細(xì)菌的研究正在逐步開展，新疆野蘋果內(nèi)生細(xì)菌的研究材料主要為枝條和根系，有關(guān)新疆野蘋果葉片內(nèi)生細(xì)菌的研究鮮有報道。李永麗等[20] 從新疆野蘋果枝條中分離出枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，本研究從葉片中分離出枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌，但未見解淀粉芽孢桿菌，推測是因?yàn)椴牧项愋筒煌?，或者對葉片進(jìn)行預(yù)處理時未滿足解淀粉芽孢桿菌需要的培養(yǎng)環(huán)境。

菌株在生長繁殖過程中，可能是將難解磷轉(zhuǎn)為有效磷，也可能是大量吸收了其他菌株分解出來的有效磷，因此，發(fā)酵液中有效磷含量不能完全反映解磷能力。同時，有些具有解磷能力的菌株為了有利于自身的生長繁殖，會消耗許多有效磷，從而導(dǎo)致有效磷濃度下降[15]。因此，有些細(xì)菌的解磷圈較其他細(xì)菌的大，而發(fā)酵液中有效磷濃度并不高。

當(dāng)植物自身合成IAA 的能力受到抑制時，外源IAA 能夠有效促進(jìn)植物幼苗的伸長生長，并降低幼苗細(xì)胞膜的透性，增強(qiáng)植物對不良環(huán)境的適應(yīng)能力，同時，IAA 與植物的抗寒能力、抗病能力息息相關(guān)。劉娟娟等[21] 從蘋果組織中篩選出具有分泌IAA、解磷等功能的內(nèi)生細(xì)菌，并且這類內(nèi)生細(xì)菌對幼苗均具有促生作用。也有研究結(jié)果表明，具有較強(qiáng)的分泌IAA 能力的菌株可以有效分泌大量IAA，從而促進(jìn)植物細(xì)胞的生長和分裂，促進(jìn)植物吸收營養(yǎng)物質(zhì)，同時促進(jìn)葉綠素的合成，增加光合作用的強(qiáng)度，使幼苗生物量增加[22]。本研究結(jié)果也證實(shí)具有此類功能的菌株能夠促進(jìn)植物的生長。

王家艷等[23] 利用內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌防治獼猴桃采后的軟腐病，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠顯著減緩果實(shí)軟化和降低水分散失速率，從而達(dá)到防治軟腐病和保鮮的效果。許多內(nèi)生芽孢桿菌不但具有防病作用，而且具有促進(jìn)植物生長等多種功能。敖遠(yuǎn)等[24] 將枯草芽孢桿菌回接至番茄幼苗上，發(fā)現(xiàn)該菌株對番茄幼苗的生長有極大的促進(jìn)作用。本研究中篩選出的HC2 為枯草芽孢桿菌，對新疆野蘋果幼苗具有促生作用，與其研究結(jié)果一致。

下一步將研究促生細(xì)菌促進(jìn)新疆野蘋果幼苗生長的機(jī)制。另外，在不同生長時期或不同感染時長條件下，促生細(xì)菌對幼苗的促生作用也有待研究。

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[ 本文編校：聞 麗]