摘 要：【目的】為提高櫻花雜交育種效率，對櫻花遠緣雜交胚離體培養(yǎng)進行胚搶救?！痉椒ā恳杂簷烟覟槟副荆A中櫻桃、尾葉櫻桃、鐘花櫻桃為父本進行遠緣雜交，對不同時期的坐果率進行統(tǒng)計，確定雜交種胚敗育時期；對不同時期雜交胚進行萌發(fā)實驗，確定雜交胚搶救適宜時間。以1/2MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、KT 和NAA 混合物以研究植物生長調(diào)節(jié)劑對種胚萌發(fā)及幼苗生根的影響；將胚搶救苗分別接種到MS、1/2MS、WPM 培養(yǎng)基中，研究其根系生長情況；以泥炭、珍珠巖（1∶1），椰糠、珍珠巖（1∶1），黃土、珍珠巖（1∶1）3 種基質(zhì)栽植胚搶救苗，篩選適合胚搶救苗移栽基質(zhì)?！窘Y(jié)果】以迎春櫻桃為母本的雜交組合中，胚敗育發(fā)生時間在授粉后15 d；胚搶救適宜的時間在授粉后25 d；誘導雜交胚萌發(fā)的適宜基本培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基；誘導胚搶救苗生根的適宜培養(yǎng)基為WPM 培養(yǎng)基；不同雜交組合的雜交胚萌發(fā)和胚搶救苗生根需要的植物生長調(diào)節(jié)劑配比不同；幼苗適宜移栽基質(zhì)為泥炭、珍珠巖（1∶1），成活率95% 以上?！窘Y(jié)論】該技術(shù)對于櫻花遠緣雜交獲得新種質(zhì)資源有良好的效果，能明顯提高櫻花遠緣雜交育種的成功率，對櫻花育種意義重大。

關(guān)鍵詞：迎春櫻桃；遠緣雜交；胚搶救；植物生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號：S565.9 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）04—0254—09

櫻花是薔薇科Rosaceae 李屬Prunus 植物統(tǒng)稱，在北半球溫帶分布最為廣泛，北美、歐洲和亞洲都有櫻花的分布記錄，櫻花在全球有150 多種，在我國主要分布于西部、臺灣、西南部[1]。櫻花是近年來熱門的觀賞植物，在園林景觀、城市綠化、公園造景中有著廣泛的運用。我國擁有豐富的原生櫻花資源，原生櫻花超過52 種或變種，占世界櫻屬植物的1/3 以上[2]，其中不乏觀賞價值高的櫻花種類。其中迎春櫻桃P. discoidea、華中櫻桃P. conradinae、尾葉櫻桃P. dielsiana、鐘花櫻桃P. campanulata 是中國原生櫻花中觀賞價值較為突出的物種，是進行櫻花育種的良好親本，遠緣雜交育種是櫻花主要的育種手段之一。植物遠緣雜交是打破植物種屬間隔離、擴大遺傳基礎(chǔ)、增加遺傳變異、創(chuàng)制新種質(zhì)資源的重要途徑[3]，但由于植物的種間隔離現(xiàn)象，導致遠緣雜交很難產(chǎn)生后代，常表現(xiàn)出受精前的雜交不親和性和受精后的雜種不育性這兩種雜交障礙[4-5]。受精后的雜種不育性又通常表現(xiàn)為雜交胚發(fā)育停滯、胚發(fā)育過程中壞死、種子不萌發(fā)及幼苗衰亡等，造成雜交獲得的雜種少甚至無法獲得雜種[6-7]。胚搶救技術(shù)是克服遠緣雜交不親和的重要技術(shù)手段，在柑橘、葡萄、櫻桃、桃、杏、李等果樹上均有運用，李莎莎等[8] 利用胚搶救和分子標記技術(shù)培育出無核抗寒葡萄，羅賽男等[9] 利用胚搶救獲得椪柑多倍體后代。在薔薇科核果類植物胚搶救研究中，呂雪等[10] 利用胚搶救獲得李、杏遠緣雜交后代，劉文等[11] 利用胚搶救技術(shù)獲得桃遠緣雜種，鄧斌[12]研究了瑪瑙紅櫻桃的胚搶救技術(shù)，并建立了瑪瑙紅甜櫻桃的胚搶救體系。在李屬植物的胚搶救技術(shù)研究中，目前在桃、杏、李、甜櫻桃等上有所進展，在其他李屬植物上研究甚少。前人在胚齡、胚發(fā)育指數(shù)、培養(yǎng)基種類、低溫處理等對成苗率的影響上取得了一定進展[12]。但由于存在物種差異，櫻花的胚搶救時間、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比都存在較大差異，因此，研究櫻花遠緣雜交胚搶救技術(shù)，對于中國原生櫻花育種與新種質(zhì)創(chuàng)制有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的櫻花親本來自于湖南省植物園櫻花國家林木種質(zhì)資源庫，以來自同一迎春櫻桃P. discoidea 母樹的40 株3 年生嫁接樹為母本，華中櫻桃P. conradinae 優(yōu)株、尾葉櫻桃P. dielsiana新品種‘湘韻’、鐘花櫻桃P. campanulata 優(yōu)株為父本進行雜交。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉采集與雜交授粉

父本和母本開花時間相近，采集大苞期或鈴鐺花期的父本花朵，用鑷子取下花藥，在室溫條件下自然干燥散粉24 h，轉(zhuǎn)移至干燥皿中硅膠干燥散粉8 h；將花粉混合均勻以避免因植株個體引起的花粉活力差異[13]；將混勻的花粉分裝至5 ml離心管中，于4 ℃或-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。授粉? d 選擇母本樹上健壯的枝條，對枝條上的大蕾期花苞進行去雄處理，每支處理20 ～ 30 朵，每個組合處理150 枝，去雄后立即用硫酸紙袋進行套袋處理；同時對花粉活力進行檢測，檢測方法為參考李慶宏等的離體萌發(fā)法，采用為0.1 g/L 硼酸+10% 蔗糖+0.5% 瓊脂的瓊脂糖凝膠進行花粉活力檢測[14]。翌日用花粉活力良好的花粉進行雜交授粉，授粉采用小筆刷蘸取少量花粉，點蘸在提前去雄的柱頭上，授粉后立即套袋，掛牌標記。

1.2.2 雜種胚敗育與胚搶救時間的確定

雜交授粉后，每隔5 d 統(tǒng)計1 次各雜交組合的坐果率，并同步觀察胚胎發(fā)育情況。胚齡是從授粉開始到剝離胚培養(yǎng)的時間，用胚發(fā)育指數(shù)（PF 值，胚長/ 種子長）表示。以坐果率和PF 值為指標，確定雜種胚敗育和胚搶救時間，參考呂雪等[10]、劉煥芳等[15] 在李屬其他種植物的雜種胚搶救中的結(jié)論，胚敗育現(xiàn)象發(fā)生在授粉后兩周左右坐果率急劇下降后的時期，通過觀察坐果率的變化，確定胚敗育發(fā)生的時間；對不同時期不同PF 值的幼胚進行培養(yǎng)，通過觀察不同PF 值的胚萌發(fā)率變化，確定胚搶救的適宜時間。

從雜交授粉后第20 天開始，5 d 采集1 次雜交幼果（每個組合采果20 個），幼果用自來水沖洗10 min，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上，用75% 酒精浸泡1 min，無菌水清洗2 ～ 3 次，再用10% 次氯酸鈉浸泡8 min，無菌水清洗3 ～ 4 次，轉(zhuǎn)移至干凈的培養(yǎng)皿中，切開幼果，取出種仁，去除種皮，獲得完整的幼胚，接種到胚搶救培養(yǎng)基上，觀察不同胚齡的發(fā)芽率及生長狀況，當雜交胚子葉轉(zhuǎn)綠、下胚軸膨大伸長達胚長度1/2 時記為發(fā)芽。

1.2.3 胚搶救培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑配方的篩選

在授粉后25 d，隨機選取雜交幼果60 個，消毒處理后分別接入MS、1/2MS、WPM 培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種幼胚20 個，20 d 統(tǒng)計褐化率、發(fā)芽率，以篩選適宜的基本培養(yǎng)基。

授粉后25 d，每個雜交組合取幼果540 個，接種至胚搶救生長調(diào)節(jié)劑配方篩選培養(yǎng)基中，胚搶救適宜生長調(diào)節(jié)劑配方篩選以1/2MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入6-BA、KT、NAA 3 種植物生長調(diào)節(jié)劑，采用L9（33）正交試驗，詳情見表1，統(tǒng)一加入蔗糖30 g/L，pH 值為5.8 ～ 6.0，每個組合接種60 個幼胚，20 個為1 組，3 次重復，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計發(fā)芽率、成苗率，當雜交胚的子葉轉(zhuǎn)綠、下胚軸膨大伸長達胚長度1/2 時標記為發(fā)芽，雜交胚長出2 對真葉標記為成苗。

1.2.4 胚搶救苗生根培養(yǎng)及移栽

將高度2 ～ 3 cm、4 ～ 5 片葉的胚搶救苗，分別接種到MS、1/2MS、WPM 培養(yǎng)基中，統(tǒng)一加入15 g/L 蔗糖+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA，pH 5.8 ～ 6.0，每種培養(yǎng)基接種60 苗，30 d 統(tǒng)計生根率、葉片顏色、葉片數(shù)。

胚搶救苗生根培養(yǎng)的適宜生長調(diào)節(jié)劑配方篩選以WPM 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，加入NAA、IBA 兩種植物生長調(diào)節(jié)劑，采用L9（32）正交試驗，詳情見表2，統(tǒng)一加入蔗糖15 g/L，pH 5.8 ～ 6.0，每個組合接種60 苗，20 苗一組，3 組重復，30 d統(tǒng)計生根率、生根數(shù)。

1.2.5 胚搶救苗煉苗及移栽

選擇生長良好，根系發(fā)達的胚搶救苗，進行開瓶煉苗，分別移栽至泥炭與珍珠巖體積比（1∶1）、椰糠與珍珠巖（1∶1）和黃土與珍珠巖（1∶1）3種不同的基質(zhì)中，經(jīng)過拱棚保濕，室外馴化等過程，移栽30 d 后統(tǒng)計成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交胚敗育時間

對不同雜交組合授粉后的坐果率進行觀察統(tǒng)計。種核及胚的正常發(fā)育是核果類果樹坐果的必要條件之一，根據(jù)坐果率的高低及種核的發(fā)育情況，可以確定櫻花雜交胚的敗育時期。從表3 中可以看出，從迎春櫻桃同株自交的結(jié)果來看，果實授粉后掛果率不高，僅11.83%，到25 d 掛果率降為0%，表明迎春櫻桃為自交不親和；同時，表3 中可以看出，不同的櫻花雜交組合，坐果率不同，但都表現(xiàn)為隨時間增長而下降的趨勢。在授粉后5 ～ 15 d，坐果率明顯下降，其中迎春櫻桃× 鐘花櫻桃的雜交組合降幅最大， 達到27.84%，15 d 后趨于穩(wěn)定，在30 d 后坐果率不再變化，直至40 d 果實成熟，這與呂雪等[10] 研究的坐果率變化趨勢較為接近。因此，根據(jù)坐果率的變化情況可以初步確定櫻花雜交胚的敗育從授粉后15 d開始。

2.2 雜交胚搶救時間

對不同雜交組合在不同胚齡的雜交胚進行誘導萌發(fā)試驗。由表4 可以看出，PF 值＜ 0.5 時（25 d 以前），3 種雜交組合雜交胚少量萌發(fā)或者不萌發(fā)，PF 值＞ 0.5 時（25 d 以后），不同雜交組合的萌發(fā)率有所差別，但都表現(xiàn)為雜交胚的萌發(fā)率隨胚齡增長而增加。結(jié)合雜交胚的敗育時間，雜交胚搶救的適宜時期在授粉后25 d 左右。

2.3 不同培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑配比對雜交胚發(fā)芽的影響

表5 所示，同一胚齡的幼胚在MS、1/2MS、WPM 3 種培養(yǎng)基中的褐化率，WPM 褐化率最大，MS 次之，1/2MS 最低，為10.00%，發(fā)芽率最高，因此1/2MS 培養(yǎng)基為3 種培養(yǎng)基中最適合的基本培養(yǎng)基。

表6 所示，在1/2 MS 培養(yǎng)基中加入不同配比的植物生長調(diào)節(jié)劑，不同雜交組合幼胚的發(fā)芽率和成苗率不同。結(jié)合發(fā)芽率和成苗率，選擇發(fā)芽率好，成苗率高的為胚搶救的適宜配比。迎春櫻桃× 尾葉櫻桃雜交組合中，Q6 的發(fā)芽率與Q9 無顯著差異，與Q3、Q4、Q5、Q7、Q8 有較顯著差異，與Q1、Q2 有顯著差異，Q6 的成苗率與Q1、Q2、Q3、Q4、Q7、Q8 有顯著差異， 與Q5、Q9有較顯著差異，因此，結(jié)合發(fā)芽率和成苗率結(jié)果，適宜迎春櫻桃× 尾葉櫻桃雜交組合的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為Q6：1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/lKT+0.1 mg/L NAA；迎春櫻桃× 華中櫻桃雜交組合中，Q4 與Q2、Q9 有無顯著差異，與Q5 有較顯著差異，與Q1、Q3、Q6、Q7、Q8 有顯著差異，Q4的成苗率與Q1、Q2、Q3、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9均有顯著差異，因此，結(jié)合發(fā)芽率和成苗率結(jié)果，適宜迎春櫻桃× 華中櫻桃雜交組合的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為Q4：1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/lKT+0.3 mg/L NAA；迎春櫻桃× 鐘花櫻桃雜交組合中，Q8 的發(fā)芽率與Q5 無顯著差異，與Q1、Q2、Q3、Q9 有較顯著差異，與Q6、Q7 有顯著差異，Q8 的成苗率與Q1、Q3、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9 有顯著差異，與Q2 有較顯著差異，因此，結(jié)合發(fā)芽率和成苗率結(jié)果，適宜迎春櫻桃× 鐘花櫻桃雜交組合的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為Q8：1/2 MS+1.5 mg/L 6-BA+1.5 mg/l KT+0.1 mg/L NAA。

2.4 不同培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑配比對胚搶救苗生根的影響

如表7 所示，不同基本培養(yǎng)基對胚搶救苗的生根和生長的影響不同，主要差異表現(xiàn)在生根率、葉片顏色和葉片數(shù)上。3 種培養(yǎng)基中，WPM 培養(yǎng)基上胚搶救苗生根率最高，達96.67%，葉片顏色最綠，葉片數(shù)最多，平均達10.8 片，生長最為健壯，因此3 種基本培養(yǎng)基中最適宜的生根培養(yǎng)基是WPM 培養(yǎng)基。

如表8 所示，不同濃度配比的植物生長調(diào)節(jié)劑對不同雜交組合的櫻花胚搶救苗的生根效果不同。綜合生根率和生根根數(shù)，選擇生根率高，生根數(shù)多的為生根的適宜配比，結(jié)合基本培養(yǎng)基篩選結(jié)果，迎春櫻桃× 尾葉櫻桃雜交組合中，S8 的生根率與S5、S7 無顯著差異，與S1、S2、S3、S4、S9 有顯著差異，S8 的生根數(shù)與S4、S5、S6、S7 有較顯著差異，與S1、S2、S3、S9 有顯著差異，因此，結(jié)合生根率和生根數(shù)，適宜迎春櫻桃× 尾葉櫻桃雜交組合生根的生長調(diào)節(jié)劑配比為S8：WPM+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA；迎春櫻桃× 華中櫻桃雜交組合中，S9 的生根率與S3、S5、S8 無顯著差異，與S6 有較顯著差異，與S1、S2、S4、S7 有顯著差異，S8 的生根數(shù)與S2、S3、S8 有較顯著差異，與S1、S4、S5、S6、S7 有顯著差異，因此，結(jié)合生根率和生根數(shù)，適宜迎春櫻桃× 華中櫻桃雜交組合生根的生長調(diào)節(jié)劑配比為S9：WPM+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/LIBA；迎春櫻桃× 鐘花櫻桃雜交組合中，S6 的生根率與S3、S8 無顯著差異，與S4、S7 有較顯著差異，與S1、S2、S5、S9 有顯著差異，S6 的生根數(shù)與S3、S5、S8、S9 有較顯著差異，與S1、S2、S4、S7 有顯著差異，因此，結(jié)合生根率和生根數(shù)，適宜迎春櫻桃× 鐘花櫻桃雜交組合生根的生長調(diào)節(jié)劑配比為S6：WPM+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA。

2.5 胚搶救苗煉苗及移栽

胚搶救苗在生根培養(yǎng)基中長出4 ～ 5 條，長3 ～ 4 cm 的不定根時，打開組培瓶在室內(nèi)煉苗，5 ～ 7 d 后進行移栽。移栽后放入小拱棚中保濕，7 ～ 10 d 后打開棚膜，進行室外煉苗。表9 所示，在3 種移栽基質(zhì)中，胚搶救苗在泥炭∶珍珠巖（1∶1）中成活率最高，在椰糠∶珍珠巖（1∶1）成活率最低，最低僅有31.11%，在黃土∶珍珠巖（1∶1）成活率適中，因此，胚搶救苗移栽選用泥炭∶珍珠巖（1∶1）效果最好，其中，迎春櫻桃× 尾葉櫻桃胚搶救苗成活率97.78%；迎春櫻桃× 華中櫻桃成活率95.56%；迎春櫻桃× 鐘花櫻桃成活率95.56%，均大于95%。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本試驗以迎春櫻桃為母本，尾葉櫻桃、華中櫻桃、鐘花櫻桃為父本，建立了櫻花遠緣雜交胚搶救體系，確定了櫻花的胚敗育開始時間為授粉后15 d，適宜胚搶救時間為授粉后25 d（PF ＞0.5），胚搶救適宜基本培養(yǎng)基為1/2 MS 培養(yǎng)基，迎春櫻桃× 尾葉櫻桃雜交組合胚搶救的適宜植物生長調(diào)節(jié)劑配比為1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/lKT+0.1 mg/L NAA；迎春櫻桃× 華中櫻桃雜交組合胚搶救的適宜配比為1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/l KT+0.3 mg/L NAA；迎春櫻桃× 鐘花櫻桃雜交組合胚搶救的適宜配比為1/2 MS+1.5 mg/L6-BA+1.5 mg/l KT+0.1 mg/L NAA。胚搶救苗生根培養(yǎng)適宜基本培養(yǎng)基為WPM 培養(yǎng)基，迎春櫻桃×尾葉櫻桃雜交組合生根的適宜生長調(diào)節(jié)劑配比為WPM+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA； 迎春櫻桃× 華中櫻桃雜交組合生根的適宜配比為WPM+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA； 迎春櫻桃× 鐘花櫻桃雜交組合生根的適宜配比為WPM+0.5 mg/LNAA+1.0 mg/L IBA。移栽適宜的基質(zhì)配比為泥炭∶珍珠巖（1∶1），各雜交組合成活率均大于95%。

3.2 討 論

植物遠緣雜交是獲得植物新種質(zhì)的重要方法，胚敗育是遠緣雜交中最常見的雜交障礙之一，胚敗育現(xiàn)象是櫻花遠緣雜交育種的重要制約因素，櫻花雜交敗育時間早，敗育數(shù)量大，導致櫻花雜交收獲種子數(shù)量少或者收獲不到種子。在雜交育種中，胚搶救技術(shù)起著非常重要的作用，其能有效地阻止雜種胚的敗育與退化。本試驗進行了櫻花遠緣雜交胚搶救技術(shù)研究，對提高櫻花雜交育種效率，加快育種進程具有極大的促進作用，對其他木本觀賞植物胚搶救有一定的參考價值。胚齡是影響誘導率的關(guān)鍵因素[16]，本試驗發(fā)現(xiàn)，在授粉后15 d 開始發(fā)生胚敗育，25 d（PF ＞ 0.5）為開展胚搶救的適宜時間，從胚發(fā)育指數(shù)看，這一結(jié)果與呂雪等[10] 的李杏遠緣雜交胚搶救、鄧斌等[12]的瑪瑙紅甜櫻桃胚搶救研究的結(jié)果較為一致。試驗表明胚搶救適宜基本培養(yǎng)基為1/2MS 培養(yǎng)基，這與劉煥芳等[15] 在甜櫻桃與中國櫻桃雜種的胚搶救中的1/2MS 培養(yǎng)基一致，與趙艷華等[17] 和鄧斌等[12] 在甜櫻桃的胚搶救研究中的MS 培養(yǎng)基不同，這與物種差異可能有關(guān)。胚搶救苗生根培養(yǎng)的適宜基本培養(yǎng)基為WPM 培養(yǎng)基，與Yan 等[18]在中國櫻桃和甜櫻桃雜交胚搶救研究和謝志亮等[19]早食李離體胚培養(yǎng)中使用的1/2MS 培養(yǎng)基，以及葉小玲等[20] 在大島櫻優(yōu)良單株的組織培養(yǎng)中使用的改良MS 培養(yǎng)基均不同，這也可能與物種差異有關(guān)，具體原因需要進一步研究才能得知。本試驗研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑的配比對雜交胚萌發(fā)及胚搶救苗生根的影響，確定了櫻花雜交胚萌發(fā)和胚搶救苗生根的適宜培養(yǎng)基配方，為解決櫻花遠緣雜交育種中的胚敗育問題提供了技術(shù)基礎(chǔ)，也為其他木本植物的胚搶救技術(shù)提供了一定的依據(jù)和參考。同時，本研究存在較大的局限，實驗親本僅為迎春櫻桃、尾葉櫻桃、華中櫻桃、鐘花櫻桃，在櫻花數(shù)量上還存在不足，不能完全涵蓋當前的櫻花品種；下一步將在當前研究的基礎(chǔ)上進一步擴展櫻花的雜交親本范圍、完善更多櫻花品種雜交胚搶救技術(shù)方法。

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[ 本文編校：李義華]