摘 要：【目的】為杜仲膠的工業(yè)化提取及發(fā)展提供技術參考?！痉椒ā恳酝ㄟ^機械研磨杜仲葉片并篩分得到的杜仲葉橡膠絲團為材料，以酶解pH 值、酶用量、酶解時間和酶解溫度為自變量，以粗膠含量為響應值對酶解過程進行響應面優(yōu)化。對所提取杜仲膠進行紅外光譜分析，判斷所提取杜仲膠的品質(zhì)，使用熱分析儀分析杜仲膠的熱穩(wěn)定性。研究酶解處理杜仲葉片對杜仲膠提取效率、提膠率及熱穩(wěn)定性的影響?！窘Y果】響應面法酶解杜仲葉橡膠絲團的最優(yōu)方案為酶解pH 值4.9、酶用量1.5 g、酶解時間6.67 h、酶解溫度45.7 ℃，此條件下杜仲葉膠團含膠量平均值為12.075%。酶解處理、超聲處理和堿煮處理后的剩余膠團質(zhì)量和含膠量之間均有顯著差異，處理后酶解組杜仲葉膠團質(zhì)量最大減少量為38.76%；膠含量平均增幅為204.83%。所提取杜仲膠的紅外光譜出現(xiàn)甲基、亞甲基和碳碳雙鍵的伸縮振動峰值，分別出現(xiàn)在2 962.26、2 849.21 和1 664.76 cm-1 處。經(jīng)3 種預處理法處理后所提取杜仲膠的熱重曲線（TG 曲線）無顯著差異，杜仲膠質(zhì)量損失主要發(fā)生在300 ～ 450 ℃。【結論】以篩分后的橡膠絲團為材料可將提膠效率提高29.53%。在酶解處理、超聲處理和堿煮處理中，以優(yōu)化后酶解工藝處理所提取的杜仲膠含膠量最高，且酶解法對杜仲膠的熱穩(wěn)定性無顯著影響。

關鍵詞：杜仲葉；杜仲膠；酶解提?。豁憫娣?；提取工藝

中圖分類號：S601；S794.9 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）04—0263—10

杜仲Eucommia ulmoides 又名思仲、木棉，是杜仲科杜仲屬植物，為多年生落葉喬木，是僅存于我國的第三紀孑遺植物。杜仲資源十分豐富，自然分布在我國中西部地區(qū)[1-3]。杜仲為我國特有的名貴藥材，含有木脂素、環(huán)烯醚萜、酚類、甾體、萜類、黃酮等具有藥理價值的活性成分，藥用歷史悠久[4]。此外，杜仲還含有超高相對分子質(zhì)量的天然有機物質(zhì)—杜仲膠（E. ulmoides gum，EUG），杜仲不同組織的含膠量存在明顯差異。葉片含膠量為3% ～ 5%，樹皮含膠量為6% ～ 10%，翅果含膠量最高，達12% ～ 18%[5-6]。杜仲膠的主要成分為反-1，4- 聚異戊二烯（trans-1，4-polyisoprene，TPI），是天然三葉橡膠順-1，4- 聚異戊二烯（cis-1，4-polyisoprene，CPI）的同分異構體[7]。杜仲膠有形狀記憶功能，還有透雷達波、抗撕裂等特點，被廣泛用于軍工、飛機輪胎等高端行業(yè)，具有十分廣闊的應用前景[8-10]。

在現(xiàn)有的杜仲膠提取研究中多將杜仲皮和杜仲葉粉碎，這樣處理可以提高杜仲膠在提取溶劑中的溶出效率，但是在機械外力的作用下杜仲膠絲會受到一定程度的破壞。采用酶解法提取杜仲膠，是直接利用單一的纖維素酶或復合酶（纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等）將杜仲組織的纖維素類、果膠、蛋白質(zhì)類等物質(zhì)降解為單糖和低聚糖，破壞杜仲組織的致密結構，使杜仲膠暴露在外，達到提取杜仲膠的目的[11]。張學俊等[12] 制作了酸性蛋白酶降解液，對杜仲樹皮組織結構進行降解，酸性蛋白酶只降解植物中原生生物酶蛋白，并破壞包裹這些植物生物酶的植物組織結構，完整地保留了杜仲膠的分子結構和聚合度。除了不會破壞杜仲膠的分子結構和聚合度，酶解法還具有良好的專一性和操作性，是研究杜仲膠提取方法的主要方向。

杜仲為落葉樹種，每年會產(chǎn)生大量的落葉，杜仲葉中杜仲膠的含量較杜仲其他組織低，但杜仲葉的年產(chǎn)量大，從杜仲葉中提取杜仲膠對杜仲植株生長影響不大，是一種可持續(xù)性高的杜仲膠獲得途徑。杜紅巖[13] 指出提高育種自主創(chuàng)新能力、培育有核心競爭力和革命性的杜仲良種是“育繁推一體化”協(xié)同發(fā)展以及加大杜仲產(chǎn)業(yè)化力度的基礎。本研究中在機械研磨得到杜仲葉橡膠絲團的基礎上，通過響應面法[14-16] 對酶解參數(shù)進行優(yōu)化，得到最優(yōu)的杜仲葉橡膠絲團酶解提取杜仲膠工藝，旨在為進一步利用杜仲葉片提取杜仲膠提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品試劑及儀器設備

2021 年9 月，在貴州省農(nóng)業(yè)科學院植物保育技術應用工程研究中心的杜仲園圃采集杜仲葉。將杜仲葉在水中煮沸10 min，在80 ℃條件下烘干備用。

氫氧化鈉購自貴州賽蘭博科技有限公司，分析純；無水乙醇和石油醚購自永博馨生物科技有限公司，分析純；葡萄糖購自廣州化學試劑廠，分析純；纖維素酶、半纖維素酶、鹽酸、丙酮、蒽酮試劑和SDS 試劑均購自索萊寶生物科技有限公司，分析純。

超純水系統(tǒng)（Smart-Q30），上海和泰儀器有限公司； 電熱鼓風干燥箱（GZX-9140MBE），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電子天平（ME203T/02），梅特勒托利多儀器有限公司；pH 計（PHS-3D），梅特勒托利多儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4），上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；離心機（DL-6-B），上海安亭科學儀器廠；傅里葉紅外光譜儀（VERTEX 70），德國Bruker 公司；臺式高速冷凍離心機（Allegra21R），美國BECKMAN 公司；酶標儀（MultiskanGO），美國賽默飛世爾公司；熱分析儀（STA449F3），德國布魯克公司。

1.2 方 法

1.2.1 杜仲葉膠團分離

將杜仲葉在60 ℃烘箱烘干（6 h）后，對杜仲葉進行研磨，在盡量不破壞杜仲膠的長絲狀結構的條件下破壞細胞結構暴露杜仲膠絲，經(jīng)過篩分得到杜仲葉橡膠絲團和杜仲葉粉末。分別對杜仲葉橡膠絲團、粉末和機械研磨后的杜仲葉采用索式提取法提膠，料液比1∶30（g/mL）加入石油醚，在90 ℃條件下進行提取，加熱回流6 h。提取結束后，趁熱用濾網(wǎng)（孔徑0.15 mm）過濾，濾液置于-20 ℃冰箱中2 h，過濾烘干，即得粗膠，3 個重復，統(tǒng)計溶劑消耗量和含膠量，計算采用杜仲葉橡膠絲團比采用杜仲葉提膠提高的效率。

1.2.2 杜仲葉膠團酶解條件篩選

準確稱取10 g 杜仲葉膠團原料， 纖維素酶與半纖維素酶含量比為2∶1，設定料液比為1∶30（g/mL），采用單因素輪換法研究酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解時間（3、5、7、9、11 h）、酶解pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）和酶用量（0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g）對粗膠含量的影響，重復3 次。將酶解后的杜仲葉橡膠絲團用流水清洗，60 ℃烘干，再按料液比1∶30（g/mL）加入石油醚，在90 ℃條件下進行提取，加熱回流6 h。提取結束后，趁熱用濾網(wǎng)（孔徑0.15 mm）過濾，濾液置于-20 ℃冰箱中2 h，過濾烘干，即得粗膠。

在單因素試驗的基礎上進一步研究因素間的交互影響，以酶解pH 值、酶用量、酶解時間及酶解溫度為自變量，以酶解后粗膠含量為響應值，采用Box-Behnken 中心組合試驗設計進行響應面試驗，因素水平設計見表1。

1.2.3 杜仲葉膠團酶解工藝條件優(yōu)化后提取效果的驗證

1）與其他預處理方法提取效果的比較。將杜仲葉研磨篩分后按照以下3 種方式進行處理。堿煮處理：參考Ran 等[17] 的方法進行，用10% 的NaOH 在100 ℃條件下處理3 h 后過濾，然后在高溫（120 ℃）高壓條件下處理20 min，洗掉殘余的NaOH，加入蒸餾水在60 ℃水浴3 h 后，在37 ℃條件下烘干，加入沸程為60 ～ 90 ℃的石油醚，在120 ℃條件下提取12 h，冷凍離心分離杜仲膠。超聲處理[18]：將原料加入0.1 g/L 的SDS 和50%乙醇，超聲處理30 min；以40 kHz 的超聲頻率，在45 ℃條件下處理10 min；煮沸20 min 除去葉綠素，過濾后采用索氏提取法提取杜仲膠，然后冷凍離心分離杜仲膠。酶解處理：按1.2.2 中得出的最優(yōu)酶解條件提取杜仲膠。比較采用各方法提取杜仲膠的效果。

2）官能團組成鑒定。在有回流的條件下，用石油醚將杜仲膠溶解，得到杜仲膠濃縮溶液。將濃縮溶液滴在溴化鉀鹽片上，室溫下等待溶劑完全揮發(fā)。用紅外光譜儀記錄600 ～ 4 000 cm-1 的紅外光譜，并將其與已報道的杜仲膠紅外光譜圖進行比較。

3）熱穩(wěn)定性分析。參照Zhang 等[19] 的方法，采用N2 作為惰性氣體，使用熱分析儀對杜仲膠的熱穩(wěn)定性進行分析，升溫速率10 ℃ /min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

P=（M2/M1）×100%。

式中：P 為杜仲膠含量；M1 為杜仲葉膠團干質(zhì)量；M2 為所得粗膠干質(zhì)量。

使用Design Expert 11.1.0 軟件進行繪圖，使用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，采用LSD 檢驗法判斷各組間水平的差異。

2 結果與分析

2.1 以研磨后不同杜仲葉材料提膠的差異

杜仲葉經(jīng)烘干和研磨處理后可被篩分為杜仲葉橡膠絲團和粉末（圖1），既保證了提取杜仲膠時的溶出效率，又可以保持膠絲的完整性。橡膠絲團占比68.79% ～ 72.25%，平均值為70.47%；粉末占比27.75% ～ 31.21%，平均值為29.53%。杜仲葉粉末中含膠量少，且粉末中雜質(zhì)會進入溶劑中，影響杜仲膠純度，因此后續(xù)采用橡膠絲團進行提膠。采用杜仲葉膠團提膠可提高29.53% 的效率。

分別以杜仲橡膠絲團、杜仲葉粉末和研磨后的杜仲葉為材料進行提膠，統(tǒng)計溶劑消耗量和含膠量（圖2）。由圖2 可知，以杜仲葉膠團為材料提取杜仲膠時，消耗溶劑最少（21 mL），與以杜仲葉粉末和研磨后的杜仲葉為材料提膠時有顯著差異。杜仲橡膠絲團中含膠量最高，為2.11%，與以杜仲葉粉末和研磨后的杜仲葉為材料提膠時有顯著差異。

2.2 杜仲葉膠團酶解條件的篩選

2.2.1 酶解條件單因素試驗

pH值能影響酶活性中心必需基團的解離程度，也能影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對底物分子的結合和催化。從圖3 可以看出，隨著酶解pH 值的增加，含膠量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，且在pH 值為5.0 時含膠量達到最高值5.23%，表明此時酶具有最高的催化活性。從圖3 可以看出，隨酶用量增大，膠含量明顯增加，這是由于酶作用的底物增多。當酶用量達到1.25 g 后，繼續(xù)增大酶用量，膠含量并未持續(xù)增加。在一定程度上，酶解時間越長則酶促反應越充分，但是當酶解反應徹底結束后，繼續(xù)延長酶解時間會增加時間成本、降低生產(chǎn)效率。從圖3 可以看出，當酶解時間小于7 h 時，膠含量隨酶解時間延長而增加，之后膠含量變化較小，說明酶解7 h 時酶與底物的反應已進行完全，繼續(xù)延長時間不會提高酶解效率。酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，不適宜的酶解溫度會影響酶解反應的進行。由圖3 可以看出，隨著酶解溫度升高，膠含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當溫度從35 ℃升至50 ℃時膠含量逐漸增加，在50 ℃時膠含量達到最高值7.29%；隨著溫度繼續(xù)上升膠含量開始下降，這是由于溫度過高導致酶發(fā)生變性，酶活性減弱。

2.2.2 酶解條件響應面法優(yōu)化

對Box-Behnken 試驗結果進行響應面分析，結果如表2 所示，方差分析結果如表3 所示。對表2 中的試驗結果進行統(tǒng)計分析，經(jīng)回歸擬合，建立二次回歸方程：

Y=10.94+0.30A+0.51B-0.50C-1.75D-0.55AB-0.01AC+0.16AD-0.60BC-0.34BD-0.34CD-1.11A2-0.51B2-1.21C2-1.17D2。

式中：A 表示酶解pH 值；B 表示酶用量；C 表示酶解時間；D 表示酶解溫度。

從表3 可知：該二次回歸方程的模型項極顯著（P ＜ 0.01），表明與實際情況擬合度好；一次項中的A、C、D 均為極顯著影響，B 為顯著影響，交互項中AB、BC 影響顯著，二次項中的A2、C2、D2 均表現(xiàn)出極顯著影響，B2 影響顯著，失擬項不顯著（P ＞ 0.05），說明非試驗因素對試驗結果影響不大。預測值與試驗值有高度相關性（R2=0.954 6）。調(diào)整確定系數(shù)為0.909 3，說明試驗數(shù)據(jù)可靠性較高，可以用此模型來分析和預測酶解處理杜仲葉膠團的工藝條件。根據(jù)F 值可知，各因素對含膠量的影響由大到小依次為D（酶解溫度）、B（酶用量）、C（酶解時間）、A（酶解pH 值）。

如圖4 所示：殘差緊緊圍繞著對角線分布，滿足正態(tài)性，說明模型合理可用；含膠量的實際值和預測值圍繞著對角線分布，證明方程擬合效果較好，且該模型具有可行性。

由圖5 可知，酶解pH 值與酶用量、酶用量與酶解時間交互項曲面幅度大且等高線呈橢圓形，表明酶解pH 值與酶用量、酶用量與酶解時間之間交互作用顯著，這與方差分析結果一致。

含膠量取最大值，利用軟件分析得到最佳提取條件：酶解pH 值4.913 7、酶用量1.5 g、酶解時間6.671 h、酶解溫度45.728 ℃，此條件下的杜仲葉膠團含膠量理論值為12.038%。結合實際可操作性，選擇在酶解pH 值4.9、酶用量1.5 g、酶解時間6.67 h、酶解溫度45.7 ℃條件下進行驗證試驗，經(jīng)索氏提取后杜仲葉膠團含膠量平均值為12.075%，與理論值較為接近，說明回歸模型與實際情況的擬合度較好，可用于優(yōu)化酶解杜仲葉膠團提取杜仲膠的工藝條件。

2.3 杜仲葉膠團酶解工藝條件優(yōu)化后的提取效果

2.3.1 與其他預處理方法提取效果的比較

以僅進行研磨預處理的杜仲葉為對照，對超聲處理、堿浸處理和酶解處理后的剩余膠團質(zhì)量進行統(tǒng)計。結果表明各處理組間均有顯著差異。由圖6 可知：杜仲葉膠團最大減少量分別為超聲組23.42%、堿煮組63.43%、酶解組38.76%；不同處理組與對照組膠含量均有顯著差異，其中膠含量平均增幅分別為超聲組177.64%、堿煮組142.66%、酶解組204.83%。堿煮處理組剩余膠團質(zhì)量和膠含量較低，可能是堿煮后流水沖洗導致大量含膠組織流失。

2.3.2 官能團組成

經(jīng)過酶解處理后所得杜仲膠的紅外光譜（500 ～ 4 000 cm-1）如圖7 所示。從圖7 中可以看出，在3 360.62、2 962.26、2 916.26、2 849.21、1 712.23、1 664.76、1 444.87、1 380.69、1 102.62 和974.69 cm-1處有吸收峰以及其他峰。甲基和亞甲基的伸縮振動峰分別出現(xiàn)在2 962.26 和2 849.21 cm?1 處。此外，在2 916.26 cm?1 處觀察到亞甲基不對稱反應。碳碳雙鍵伸縮振動的位置在1 664.76 cm-1 處清晰可見。分別在1 102.62 和974.69 cm?1 處觀察到碳碳雙鍵拉伸和對稱拉伸振動。甲基對稱和對稱彎曲振動分別發(fā)生在1 380.69 和1 444.87 cm?1 處。這與Cui 等[20] 得出的杜仲膠分子結構特征基本一致。在3 360.62 cm-1 處出現(xiàn)吸收峰可能是因為未完全除去杜仲膠樣品中的雜質(zhì)。

2.3.3 熱穩(wěn)定性

如圖8 所示：溫度小于300 ℃時，杜仲膠質(zhì)量損失較小，當溫度在300 ～ 450 ℃時，杜仲膠開始發(fā)生較大的質(zhì)量損失。溫度到達300 ℃時，酶解處理組、超聲處理組和堿煮處理組的質(zhì)量損失率較低，分別為2.19%、0.96% 和1.38%。溫度到達450 ℃時，酶解處理組所提取的杜仲膠質(zhì)量損失率達到95.81%，堿煮處理組和超聲處理組的質(zhì)量損失率分別為96.04% 和95.05%（表4）。酶解處理組所提取杜仲膠的熱穩(wěn)定性較差，堿煮處理組所提取杜仲膠的熱穩(wěn)定性比其他組略好。3 種預處理組所得杜仲膠的熱穩(wěn)定性差異不顯著，酶解不會對杜仲膠的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響。

3 結論與討論

本研究中以杜仲葉為原料，使用研磨處理后的橡膠絲團進行酶解處理，采用Box-Behnken 中心組合試驗設計進行響應面試驗，確定了最佳酶解條件。對杜仲葉片進行機械研磨后得到杜仲葉橡膠絲團，在盡量不破壞杜仲膠長絲狀結構的條件下破壞細胞結構暴露杜仲膠絲，以橡膠絲團為材料提取杜仲膠，這樣能夠有效減少溶劑消耗，且提膠率高。橡膠絲團的最佳酶解條件為酶解pH 值4.9、酶用量1.5 g、酶解時間6.67 h、酶解溫度45.7 ℃，在該條件下得到的膠含量最高為12.075%，比以杜仲葉片為原料所提取膠含量提高了67.2%，提膠效率提高了30%。以僅進行研磨預處理的杜仲葉為對照，對經(jīng)超聲處理、堿煮處理和酶解處理的剩余膠團質(zhì)量進行統(tǒng)計。結果表明：各處理組間均有顯著差異，杜仲葉膠團最大減少量分別為超聲組23.42%、堿煮組63.43%、酶解組38.76%；不同處理組與對照組含膠量均有顯著差異，其中膠含量平均增幅分別為超聲組177.64%、堿煮組142.66%、酶解組204.83%。經(jīng)紅外光譜驗證，本試驗中所提取杜仲膠與前人發(fā)表過的分子結構特征基本一致。經(jīng)3 種預處理所提取杜仲膠的熱穩(wěn)定性無顯著差異，即酶解處理不會對杜仲膠的熱穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

自20 世紀60 年代以來，分離提取技術的發(fā)展推動了纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)及應用，現(xiàn)在市場上纖維素酶的種類越來越多，為酶解法降解細胞壁纖維素提供了方便。張學俊等[12] 提出用全生物酶降解杜仲原料，能夠同時提取杜仲原料中的膠以及其他活性成分。袁婷等[21] 以杜仲果皮干粉為材料，分別采用堿浸法、苯-CH3OH 法和酶水解法提取杜仲膠，結果表明酶水解法的提取率最高，且3 種方法對杜仲膠的熱穩(wěn)定性無顯著影響。劉貴華等[22] 對酶解預處理杜仲粕殼的工藝條件進行了優(yōu)化，酶解后杜仲膠得率是非酶解處理的1.3 倍，薄層層析檢測結果表明酶解處理和非酶解處理所得杜仲膠的成分基本相同。任濤等[23] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，與非酶解原料相比，杜仲葉殘渣經(jīng)酶解預處理后膠提取率是未經(jīng)酶解處理的1.49 倍，表明纖維素復合酶可被用于以杜仲葉殘渣提取杜仲膠的預處理。邵鳳俠等[24] 以杜仲樹葉、樹皮、果殼為材料，分別采用機械法、堿浸法和綜合法提取杜仲粗膠，發(fā)現(xiàn)以杜仲果殼為材料的提膠率高，以綜合法提膠具有成本低、膠的雜質(zhì)少等優(yōu)點，建議在生產(chǎn)中以綜合法提取杜仲果殼粗膠。杜仲葉中含膠細胞主要存在于葉脈的韌皮部和葉脈上下的薄壁組織中，即含膠細胞主要沿葉脈存在，通過研磨處理可最大限度去除其他葉片組織，保留葉脈部分的組織。

杜仲膠是天然的生物材料，其具有的特殊性質(zhì)在人體工程和醫(yī)學領域是無法用三葉橡膠和人工合成塑料替代的，隨著研究的深入，杜仲膠在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及日常生活中的應用會越來越廣泛，其應用價值和經(jīng)濟價值將會越來越明顯。但生物酶的價格較高，為了杜仲膠的規(guī)?；崛?，后續(xù)應從降低生產(chǎn)成本角度進一步完善杜仲膠提取工藝。

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[ 本文編校：聞 麗]