【摘要】 目的：探討血清干細胞因子（SCF）/酪氨酸蛋白激酶生長因子受體（c-kit）信號通路在肝內(nèi)膽汁淤積癥中與顆粒細胞凋亡的關(guān)系。方法：將黑龍江省醫(yī)院普外三科2017年3月—2020年12月收治的肝內(nèi)膽汁淤積癥患者41例納入研究，記作病變組，另取同期健康受試者41例作為健康組。分別比較兩組顆粒細胞凋亡情況，血清SCF、c-kit表達水平，顆粒細胞內(nèi)Bcl-2及Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并作相關(guān)性分析。結(jié)果：病變組顆粒細胞凋亡細胞DNA含量、血清SCF、c-kit表達水平、Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均高于健康組（Plt;0.05），病變組顆粒細胞內(nèi)Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平低于健康組（Plt;0.05）。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可得：肝內(nèi)膽汁淤積癥患者血清SCF、c-kit表達水平與顆粒細胞內(nèi)Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)（r=-0.532、-0.583，P=0.001、0.000），而與Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)（r=0.479、0.510，P=0.001、0.004）。結(jié)論：在肝內(nèi)膽汁淤積癥中，SCF/c-kit信號通路可能和顆粒細胞凋亡密切相關(guān)，兩者之間的聯(lián)系可能是通過Bcl-2、Caspase-3的表達實現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】 肝內(nèi)膽汁淤積癥 酪氨酸蛋白激酶生長因子受體 干細胞因子 顆粒細胞

Relationship between SCF/c-kit Signaling Pathway and Granulosa Cell Apoptosis in Intrahepatic Cholestasis/SUN Yu， GE Xin. //Medical Innovation of China， 2023， 20（31）： 00-004

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between serum stem cell factor （SCF）/tyrosine protein kinase growth factor receptor （c-kit） signaling pathway and granulosa cell apoptosis in intrahepatic cholestasis. Method： A total of 41 patients with intrahepatic cholestasis admitted to the Third Department of General Surgery of Heilongjiang Provincial Hospital from March 2017 to December 2020 were included in the study and recorded as the diseased group， and 41 healthy subjects in the same period were selected as the healthy group. The apoptosis of granulosa cells， the expression levels of serum SCF and c-kit， the mRNA transcription levels of Bcl-2 and Caspase-3 in granulosa cells were compared between the two groups， and the correlation was analyzed. Result： The DNA content of apoptotic granulosa cells， expression levels of serum SCF， c-kit and the mRNA transcription of Caspase-3 in the diseased group were higher than those in the healthy group （Plt;0.05）， the mRNA transcription level of Bcl-2 in granulosa cells of the diseased group was lower than those of the healthy group （Plt;0.05）. Pearson correlation analysis showed that the expression levels of SCF and c-kit in serum of patients with intrahepatic cholestasis were negatively correlated with the transcription level of Bcl-2 mRNA in granular cells （r=-0.532， -0.583; P=0.001， 0.000）， but positively correlated with Caspase-3 mRNA transcription level （r=0.479， 0.510; P=0.001， 0.004）. Conclusion： SCF/c-kit signaling pathway may be closely related to granulosa cell apoptosis in intrahepatic cholestasis， and the relationship between them may be mediated by the expression of Bcl-2 and Caspase-3.

[Key words] Intrahepatic cholestasis Tyrosine protein kinase growth factor receptor Stem cell factors Granulosa cells

First-author's address： Heilongjiang Provincial Hospital， Harbin 150000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.31.001

肝內(nèi)膽汁淤積癥屬于臨床上較為常見的疾病之一，嚴重威脅患者的生命健康安全[1]。有研究報道指出，肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)病機制可能和遺傳、生活方式及細胞異常刺激等密切相關(guān)[2]。其中顆粒細胞于細胞發(fā)育、成熟等過程中起著至關(guān)重要的作用，可能參與了肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生、發(fā)展過程[3]。此外，血清干細胞因子（stem cell factor，SCF）是一種多功能細胞生長因子，參與機體多種細胞生長的調(diào)控[4]。而酪氨酸蛋白激酶生長因子受體（c-kit）蛋白細胞外的部分為血清SCF的受體區(qū)，細胞膜、細胞漿為酪氨酸激酶區(qū)[5]。c-kit結(jié)合啟動SCF/c-kit信號通路，活化酪氨酸激酶，導(dǎo)致一系列磷酸化過程，對Cajal間質(zhì)細胞（ICC）發(fā)育、成熟和維持正常表型起決定性作用。已有研究報道顯示，SCF/c-kit信號通路與ICC的發(fā)育密切相關(guān)[6]。然而，關(guān)于SCF/c-kit信號通路對顆粒細胞增殖、凋亡影響的研究較為少見。鑒于此，本研究旨在探討肝內(nèi)膽汁淤積癥患者SCF/c-kit信號通路表達與顆粒細胞凋亡的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 一般資料

選取黑龍江省醫(yī)院普外三科2017年3月—2020年12月收治的肝內(nèi)膽汁淤積癥患者41例記作病變組。納入標準：（1）所有患者均符合文獻[7]《膽汁淤積性肝病診斷和治療共識》中相關(guān)診斷標準，均經(jīng)相關(guān)檢查確診；（2）年齡≥20歲；（3）入院前尚未接受任何相關(guān)處理。排除標準：（1）正參與其他研究；（2）精神異常和/或無法完成研究。另取同期健康受試者41例作為健康組，納入標準：（1）受試者身體健康，無消化系統(tǒng)疾病；（2）年齡≥20歲。排除標準：（1）資料數(shù)據(jù)缺失；（2）無法理解無法配合本研究，拒絕參與。所有受試者及其家屬均在知情同意書上簽字，并獲得本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 顆粒細胞采集 分別采集 兩組靜脈血，以4 000 r/min，離心半徑12 cm，離心25 min處理，采集上清液存在15 mL離心管內(nèi)，保存在-80 ℃冰箱中。采用PBS重懸沉淀物，加入1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻，吸取并加入含有等體積的淋巴細胞分離液內(nèi)，2 500 r/min離心20 min處理，離心半徑為12 cm，取第2層顆粒細胞保存在離心管內(nèi)，且以PBS重復(fù)清洗3次后保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 顆粒細胞凋亡率檢測 以PBS重復(fù)洗滌3次顆粒細胞后，使其濃度為1×106個/mL，隨后取1 mL的顆粒細胞懸液以1 000 r/min離心10 min，離心半徑為8 cm，去除PBS后垂直加入預(yù)冷的70%乙醇固定2 h。離心去除固定液，離心半徑為8 cm，離心轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心時間為10 min，重懸，離心去除PBS，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）在4 ℃避光條件下孵育30 min，以流式細胞儀（購自美國NovoCyte，貨號：NovoCyt）進行檢測。在PI熒光直方圖上，凋亡細胞在DNA合成前期（G1）/G0期會出現(xiàn)亞二倍體峰（其中G0期主要是對停止在G1期細胞的特定稱謂），其所占樣本數(shù)的比例即是顆粒細胞凋亡率。

1.2.3 血清SCF、c-kit表達水平檢測 分別采集所有受試者入院后翌日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血5 mL，以8 cm為離心半徑，進行時長10 min轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心處理。獲取血清以酶聯(lián)免疫ELISA法完成檢測，具體操作遵循試劑盒說明書完成。相關(guān)試劑盒均購自羅氏生物檢測應(yīng)用公司。

1.2.4 顆粒細胞內(nèi)Bcl-2及Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測 以PBS重復(fù)洗滌顆粒細胞3次，以RNA提取試劑盒（購自天根生化科技有限公司）完成細胞總RNA的提取以及逆轉(zhuǎn)錄。隨后采用Real-time PCR對逆轉(zhuǎn)錄cDNA實施PCR擴增處理。以GAPHD作為內(nèi)參，優(yōu)化反應(yīng)條件，促使目的基因和內(nèi)參的擴增效率無限接近100%，以2-ΔΔCt法計算Bcl-2以及Caspase-3 mRNA相對表達量。其中Bcl-2引物序列中，上游引物：5'-CTGGTGGACAACATCGA-3'，下游引物：5'-GGAGAAATCAAACAGAGGC-3'。Caspase-3引物序列如下：上游引物：5'-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3'，下游引物：5'-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3'。以GAPDH為內(nèi)參，上游引物：5'-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物：5'-CGTTCTCAGCCTTGACGGT-3'。所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)進行PCR檢測，所有操作步驟按照熒光定量PCR的操作步驟進行。反應(yīng)液的組成：上下游引物、2×SYBR Green PCR Master Mix，共25 μL，不足部分用水補齊。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析通過SPSS 22.0軟件實現(xiàn)，計數(shù)數(shù)據(jù)的表示方式為率%，檢驗方式為字2檢驗。計量數(shù)據(jù)的表示方式為（x±s），檢驗方式t檢驗。肝內(nèi)膽汁淤積癥患者血清SCF、c-kit表達水平與顆粒細胞內(nèi)Bcl-2、Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系予以Pearson相關(guān)性分析。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料對比

病變組男22例，女19例；年齡21～38歲，平均（28.02±3.20）歲；文化程度：初中及以下18例，高中及以上23例。健康組男24例，女17例；年齡20～38歲，平均（28.18±3.26）歲；文化程度：初中及以下16例，高中及以上25例。兩組上述指標對比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），具有可比性。

2.2 兩組顆粒細胞凋亡情況對比

病變組顆粒細胞凋亡細胞DNA含量為（3.41±0.21），明顯高于健康組的（1.35±0.10），（t=56.710，P=0.000）。

2.3 兩組血清SCF、c-kit表達水平對比

病變組血清SCF、c-kit表達水平均高于健康組（Plt;0.05），見表1。

2.4 兩組顆粒細胞內(nèi)Bcl-2及Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平對比

病變組顆粒細胞內(nèi)Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平低于健康組，而Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于健康組（Plt;0.05），見表2、圖1。

2.5 肝內(nèi)膽汁淤積癥患者血清SCF、c-kit表達水平與顆粒細胞內(nèi)Bcl-2、Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析可得：肝內(nèi)膽汁淤積癥患者血清SCF、c-kit表達水平與顆粒細胞內(nèi)Bcl-2

mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)（r=-0.532、-0.583，P=0.001、0.000），而與Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)（r=0.479、0.510，P=0.001、0.004）。

3 討論

肝內(nèi)膽汁淤積癥可能會對肝臟產(chǎn)生肝損害，甚至惡化至肝硬化、肝功能衰竭乃至肝癌[8-10]。有研究顯示，肝內(nèi)膽汁淤積癥具有家族遺傳性，可能和種族、居住環(huán)境以及體內(nèi)性激素等存在密切相關(guān)[11-12]。且隨著近年來相關(guān)研究的不斷深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)肝細胞以及膽管上皮細胞結(jié)構(gòu)功能受損可能是肝內(nèi)膽汁淤積癥的可能機制之一[13-14]。顆粒細胞是為多種細胞提供營養(yǎng)的相關(guān)因子，保證了細胞的發(fā)育成熟，其可通過自身抗氧化作用保護細胞免受氧化應(yīng)激損害[15-16]。細胞凋亡又稱之為程序化細胞死亡，主要是指細胞在一定的病生理條件下，由相關(guān)基因調(diào)控且遵守自身程序的一種自主性死亡方式，可能對機體造成不同程度的刺激，增加了肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生的概率[17-18]。

本文結(jié)果顯示，顆粒細胞增殖、凋亡可能參與了肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生、發(fā)展過程，并在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。究其原因，可能是由于顆粒細胞在肝細胞生長發(fā)育過程中起著不可忽視的作用，顆粒細胞的凋亡會直接影響肝細胞的成熟，進一步引起肝細胞的發(fā)育異常，促使肝細胞以膽固醇為原料，通過復(fù)雜、有序的酶促反應(yīng)，和?；撬峄蚋拾彼峁曹棧罱K合成膽汁酸，并最終形成“腸肝循環(huán)”，促進了肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。此外，病變組血清SCF、c-kit表達水平均高于健康組。這提示了SCF/c-kit信號通路在肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生、發(fā)展過程中同樣起著不可忽視的作用。分析原因，可能是SCF、c-kit均屬于干細胞家族重要成員，兩者的特異性結(jié)合可激活絡(luò)氨酸激酶受體信號傳導(dǎo)途徑，而絡(luò)氨酸激酶在信號傳導(dǎo)過程中起著至關(guān)重要的作用，介導(dǎo)了細胞增殖、分化、遷移、凋亡等過程。與此同時，SCF可誘導(dǎo)原始肝細胞的發(fā)育，且對優(yōu)勢肝細胞的生長具有積極的影響，其作用貫穿肝細胞發(fā)育的整個過程，因此，當(dāng)其表達發(fā)生異常時，會對肝細胞的發(fā)育產(chǎn)生影響，進一步對肝臟造成異常的刺激，促進肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生[21-22]。而c-kit蛋白的變化會直接影響SCF與其結(jié)合水平和細胞功能，其可能是通過影響SCF的表達，進一步介導(dǎo)肝細胞的發(fā)育過程，繼而參與肝內(nèi)膽汁淤積癥發(fā)生、發(fā)展。另外，病變組顆粒細胞內(nèi)Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平低于健康組，而Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平高于健康組。其中Bcl-2在細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用，主要是通過抑制線粒體內(nèi)鈣離子和細胞色素C的釋放，從而發(fā)揮抗氧化作用，最終對細胞的凋亡起到抑制作用[23]。而Caspase-3主要是通過對DNA修復(fù)以及基因整形產(chǎn)生影響，進一步促進細胞的凋亡，且該過程可被Bcl-2阻斷[24-25]。這充分證實了顆粒細胞增殖、凋亡介導(dǎo)了肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生、發(fā)展。本文結(jié)果還顯示了肝內(nèi)膽汁淤積癥患者血清SCF、c-kit表達水平與顆粒細胞內(nèi)Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈負相關(guān)，而與Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。這提示了SCF/c-kit信號通路和顆粒細胞凋亡密切相關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Caspase-3的表達，進一步對顆粒細胞增殖、凋亡產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，SCF/c-kit信號通路與顆粒細胞增殖、凋亡可能均參與了肝內(nèi)膽汁淤積癥的發(fā)生、發(fā)展過程，且兩者密切相關(guān)，其主要機制有待進一步研究證實。

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（收稿日期：2023-01-09） （本文編輯：郝天煜）