王江平，王雅娜，張飛燕，殷嘉璐，劉洪偉，董堯坤，劉秋玥，張麗萍*

（1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024；2.河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；3.河北科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）

種衣劑作為防治種傳、土傳病害及地下害蟲最簡便、經(jīng)濟(jì)有效的途經(jīng)[1]，已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上不可或缺的農(nóng)藥制品之一。目前常用種衣劑以中高毒化學(xué)藥劑為主要成分，在土壤中殘留時間長，容易造成土壤和水體污染、土壤微生態(tài)平衡破壞、有害生物產(chǎn)生抗藥性等問題[2]。研究開發(fā)安全、高效、環(huán)境友好的綠色農(nóng)業(yè)投入品及農(nóng)藥減量替代技術(shù)，改變病蟲害防控方式，是保障食品和環(huán)境安全、實現(xiàn)國家綠色發(fā)展的戰(zhàn)略需求。功能微生物具有殺蟲防病、促進(jìn)生長、提高產(chǎn)量等作用[3]，以微生物及其活性代謝產(chǎn)物為主要成分研發(fā)生物型種衣劑是新的發(fā)展方向。

貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis是一類好氧、產(chǎn)芽胞的桿狀微生物，具有環(huán)境友好、抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快等特點，并能分泌多種活性物質(zhì)[4]。目前，貝萊斯芽胞桿菌在防治植物病害、促進(jìn)作物生長、誘導(dǎo)植物抗性機(jī)理等方面研究較多，在工業(yè)上[5]和動植物病害防控上[6]有很大應(yīng)用前景。本實驗室前期分離出1 株貝萊斯芽胞桿菌ZLP-101，菌株ZLP-101 對地下害蟲蠐螬Protaetiabrevitarsis具有殺滅作用，藥土法結(jié)果顯示蠐螬死亡率達(dá)到90%以上，同時，平板對峙試驗結(jié)果表明對燕麥鐮刀菌Fusariumavenaceum、接骨木鐮刀菌Fusariumsambucinum和茄鏈格孢菌Alternariasolani等多種病原菌有抑制作用，相關(guān)研究已經(jīng)申請了國家發(fā)明專利[7]。篩選出的解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciensZLP-01 和枯草芽胞桿菌B.subtilisZLP-121 能夠促進(jìn)植物生長且對立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、燕麥鐮刀菌、接骨木鐮刀菌等土傳病原菌有顯著抑制作用[8]。

本研究針對目前生物種衣劑中存在的微生物種類單一、應(yīng)用效果不理想，防蟲型生物種衣劑嚴(yán)重缺乏等問題[9]，以貝萊斯芽胞桿菌ZLP-101 為核心、輔以解淀粉芽胞桿菌ZLP-01 和枯草芽胞桿菌ZLP-121，構(gòu)建功能微生物組合，研制一種新型殺蟲防病復(fù)合微生物種衣劑。以玉米為供試作物，明確該種衣劑在防治病蟲害方面的作用，為開發(fā)新型綠色農(nóng)業(yè)投入品提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株和玉米種子 貝萊斯芽胞桿菌ZLP-101、解淀粉芽胞桿菌ZLP-01 和枯草芽胞桿菌ZLP-121由河北省科學(xué)院生物所微生物研究室分離，并在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號分別為CGMCC No.20130、CGMCC No.25031 和CGMCC No.25253。解淀粉芽胞桿菌BA-26 和蘇云金芽胞桿菌Bt-10 由河北省科學(xué)院生物所微生物研究室分離保存。茄病鐮刀菌由河北省科學(xué)院生物所微生物研究室保存；燕麥鐮刀菌和立枯絲核菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)李鳳蘭教授贈送。玉米品種為明科玉七七。蠐螬齡期為3 齡，瑞麥德興生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑 培養(yǎng)基：NB 培養(yǎng)基；成膜劑：海藻酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、羧甲基纖維素鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、聚乙烯醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；化學(xué)增效劑：高效氯氟氰菊酯（江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）、聯(lián)苯菊酯（青島海納生物科技有限公司）、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻蟲胺、嘧菌酯、咯菌腈、噻呋酰胺（陜西華茂凱威生物有限公司）；著色劑：酸性品紅、堿性品紅、孔雀藍(lán)和結(jié)晶紫（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；增稠劑：黃原膠（淄博中軒生化有限公司）、硅酸鎂鋁和有機(jī)膨潤土（河北佳士力化工有限公司）；分散劑：木質(zhì)素磺酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）、D-1003 和D-1008（北京漢莫化學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.2 發(fā)酵液制備

采用二級液體發(fā)酵培養(yǎng)，將菌株ZLP-101、菌株ZLP-01、菌株ZLP-121、菌株BA-26 和菌株BT-10斜面上的菌種分別接種到裝有NB 培養(yǎng)基三角瓶中，裝液量50 mL/300 mL，32 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)14 h，制得一級種瓶。二級培養(yǎng)瓶裝液量：100 mL/500 mL，按5%的接種量接種，32 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)50 h，制得發(fā)酵液（菌株ZLP-101 芽胞數(shù)≥6×109cfu/mL、菌株ZLP-01 芽胞數(shù)≥6×108cfu/mL、菌株ZLP-121 芽胞數(shù)≥3×108cfu/mL、菌株BA-26 芽胞數(shù)≥5×108cfu/mL、菌株Bt-10 芽胞數(shù)≥5×108cfu/mL）備用。

1.3 功能微生物的優(yōu)選

采用紙片法測定菌株ZLP-101 與菌株ZLP-01、菌株ZLP-121、菌株BA-26 和菌株Bt-10 的親和性。取100 μL 菌株ZLP-101 發(fā)酵菌液在培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，用菌株ZLP-01（芽胞數(shù)≥6×108cfu/mL）、菌株ZLP-121、菌株BA-26 和菌株Bt-10 的發(fā)酵菌液浸泡過的濾紙片（紙片直徑：6 mm）均勻分布在培養(yǎng)皿上，32 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察親和性結(jié)果。采用上述方法測定菌株ZLP-01 和ZLP-121 的親和性。

1.4 復(fù)合微生物的抑菌殺蟲活性測定

1.4.1 復(fù)合微生物的殺蟲活性測定 將3 株菌的發(fā)酵液按體積比1∶1∶1（菌株ZLP-101 芽胞≥2×109cfu/mL、菌株ZLP-01 芽胞≥2×108cfu/mL、菌株ZLP-121 芽胞≥1×108cfu/mL）混合后，噴霧法進(jìn)行殺蟲試驗。取復(fù)合菌液和NB 培養(yǎng)基到噴瓶中，選擇15 只健康有活力且大小均一的蠐螬，隨機(jī)分為兩組，分別置于培養(yǎng)皿（直徑10 cm）中，噴霧復(fù)合菌液為處理組，噴霧NB 培養(yǎng)基為對照組，每組設(shè)3 組重復(fù)。每8 h 觀察一次，24 h 后統(tǒng)計蠐螬死亡情況。

1.4.2 復(fù)合微生物的抑菌活性測定 將3 株菌的發(fā)酵液過濾除菌得無菌濾液，各取3 種無菌濾液1 mL（菌株濃度同1.4.1）加入30 mL 的PDA 培養(yǎng)基中，充分混合，制作含有復(fù)合菌液的平板。挑取長勢良好的病原真菌，取菌塊接種到含菌平板中央，26 ℃培養(yǎng)，以加入無菌水為對照，設(shè)3 組重復(fù)。待對照長滿菌絲后，觀察其他平板情況，計算抑制率。抑制率（%）＝（對照組菌落直徑―處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑―菌塊直徑）×100。

1.5 助劑對菌體生長的影響

采用稀釋涂布平板法測定成膜劑、著色劑、增稠劑和分散劑對菌株生長的影響。在NB 培養(yǎng)基中分別加入1%的成膜劑、0.01%的化學(xué)增效劑、0.3%著色劑、0.1%增稠劑和2%的分散劑，制作含有各個助劑的無菌平板。將菌株ZLP-101、菌株ZLP-121、菌株ZLP-01 的發(fā)酵液稀釋到10-6、10-7、10-8，進(jìn)行涂布。32 ℃培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行菌落計數(shù)。NB 培養(yǎng)基為對照，設(shè)3 組重復(fù)。

1.6 助劑種類及用量的篩選

1.6.1 成膜劑篩選 采用玻片流膜法測定成膜時間，將成膜劑依次均勻涂抹在玻片上，記錄成膜劑的固化成膜時間。將不同濃度的海藻酸鈉（3%～5%）作為成膜劑，成膜劑與玉米種子按照重量比1∶10 的比例進(jìn)行手動包衣，得到用成膜劑包衣的種子。分別將一定量的包衣種子用乙醇萃取，測定萃取液的吸光度，計算包衣均勻度；取一定量的包衣種子，在振蕩儀上振蕩15 min 后，乙醇萃取測定吸光度，計算脫落率。包衣均勻度和包衣脫落率的具體測定方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17768-1999[10]。

1.6.2 化學(xué)增效劑篩選 將8 種化學(xué)增效劑（高效氯氟氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻蟲胺、嘧菌酯、咯菌腈、噻呋酰胺）配制濃度為0.1%，參考1.4.1 試驗方法，進(jìn)行殺蟲試驗。

1.6.3 著色劑篩選 取20 g 裸種到燒杯中，分別加入0.1%、0.2%、0.3%的酸性品紅溶液，攪拌混勻進(jìn)行手動包衣，平鋪晾干后，包衣種子進(jìn)行發(fā)芽試驗。分別取20 粒裸種和包衣種子置于培養(yǎng)皿中，室溫下吸漲12 h 后，置于28 ℃恒溫箱中，每組3 次重復(fù)，4 d 后統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.6.4 增稠劑的篩選 配制0.3%硅酸鋁鎂、0.3%有機(jī)膨潤土、0.3%黃原膠、0.05%黃原膠、0.1%黃原膠和0.15%黃原膠，攪拌和傾倒，觀察樣品有無分層現(xiàn)象和傾倒性。

1.6.5 分散劑篩選 在增稠劑和著色劑及其不同分散劑對3 株菌生長影響篩選的基礎(chǔ)上，用1%、2%、3%的木質(zhì)素磺酸鈉作為分散劑。三種發(fā)酵液各取10 mL 混勻后，按比例加入0.2%酸性品紅，0.1%黃原膠，分別加入1%、2%、3%的木質(zhì)素磺酸鈉，測定溶液的懸浮率。用水將待測樣品配制成適當(dāng)濃度的懸浮液，在恒溫水浴中，將量筒中懸浮液靜置30 min，測定底部1/10 懸浮液中種衣劑的質(zhì)量，計算懸浮率。具體方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17768-1999[10]方法測定溶液懸浮率。

1.7 復(fù)合微生物種衣劑質(zhì)量檢測

參考GB 20287-2006[11]方法測定種衣劑的活菌數(shù)（采用平板計數(shù)法測定生物種衣劑活菌數(shù)）；參考GB/T 1601-1993 方法[12]測定pH；參考GB/T 17768-1999[10]的方法測定懸浮率（見1.6.5 懸浮率測定方法）、黏度（使用數(shù)字式旋轉(zhuǎn)黏度計測定黏度）、低溫穩(wěn)定性（樣品在0 ℃放置7 d 后，對黏度、懸浮率等指標(biāo)測定是否合格）和熱貯穩(wěn)定性指標(biāo)（將種衣劑在50 ℃的恒溫箱中放置14 d 后，測定其質(zhì)量是否變化，活菌數(shù)、黏度等指標(biāo)是否合格）。

1.8 復(fù)合微生物種衣劑的室內(nèi)盆栽防效測定

1.8.1 生物種衣劑對地下害蟲防治效果 在30 cm×40 cm×10 cm 盆中，播種20 粒包衣后玉米，晝夜溫度為28 ℃/25 ℃。待種子發(fā)芽后出苗前，每盆接入10 頭蟲齡一致的蠐螬，10 d 后扣盆，計算防蟲效果。以裸種為空白對照，設(shè)3 組重復(fù)。

蟲口減退率（%）＝（空白對照區(qū)活蟲數(shù)―處理區(qū)施藥后蟲數(shù)）/空白對照區(qū)活蟲數(shù)×100；校正防治效果（%）＝（處理區(qū)蟲口減退率―對照區(qū)蟲口減退率）/（100%―對照區(qū)蟲口減退率）×100。

1.8.2 室內(nèi)盆栽防治效果測定 將立枯絲核菌接種在PDA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，得到立枯絲核菌的孢子菌懸液（孢子數(shù)＞106cfu/mL），孢子菌懸液與滅菌后的土壤以重量比1∶20 的比例混勻，在無菌條件下常溫放置7 d，待土壤表面長滿菌絲后，將包衣玉米種子種下，每個處理20 顆種子，重復(fù)3 次，對照組不包衣，待玉米出苗后，檢測包衣種子是否能夠降低病原菌對于玉米種子的侵染與傷害。

發(fā)病率（%）＝（發(fā)病的玉米植株數(shù)/總植株數(shù)）×100；防治效果（%）＝（處理發(fā)病率―對照發(fā)病率）/對照發(fā)病率×100。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS.24 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能微生物的優(yōu)選

通過紙片擴(kuò)散法測定所試微生物之間的抑菌圈大小，與對照相比，抑菌圈直徑（紙片直徑6 mm）小于7 mm，說明兩株菌無抑制作用親和性良好，抑菌圈直徑大于7 mm，說明兩株菌存在抑制作用。結(jié)果如圖1a 所示，菌株ZLP-101 與菌株ZLP-121 和菌株ZLP-01 無抑菌圈出現(xiàn)，說明親和性好；菌株Bt（抑菌圈直徑：13.5 mm）和菌株BA-26（抑菌圈直徑：9.2 mm）出現(xiàn)抑菌圈，說明菌株ZLP-101 與菌株BA-26和菌株Bt 之間親和性較差。由圖1b 可知，菌株ZLP-01 和菌株ZLP-121 也無抑菌圈，因此選擇菌株ZLP-01和菌株ZLP-121 與菌株ZLP-101 聯(lián)合應(yīng)用，作為種衣劑主要成分。

圖1 菌株ZLP-101 和四株芽胞桿菌的親和性（a）；菌株ZLP-01 和菌株ZLP-121 的親和性（b）Fig.1 Affinity of strain ZLP-101 and four strains of Bacillus bacillus (a); Affinity of strains ZLP-01 and ZLP-121 (b)

2.2 復(fù)合微生物的抑菌殺蟲活性

以蠐螬為靶標(biāo)，3 株芽胞桿菌發(fā)酵液復(fù)配后的菌液處理蠐螬24 h，對照組的蠐螬體表乳白色，身體彎曲呈“C”型，針刺有反應(yīng)；處理組體表呈黑褐色，多數(shù)針刺無反應(yīng)，蠐螬24 h 的死亡率是80%。表1 可看出，復(fù)合菌液對茄病鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和立枯絲核菌3 種病原真菌均有抑制作用，其中對立枯絲核菌的抑制作用最大，抑制率達(dá)93.94%。

表1 3 種微生物復(fù)合發(fā)酵液對真菌的抑菌率Table 1 Antibacterial rate of three microbial compound fermentation broths on fungi

2.3 助劑種類及用量的篩選

2.3.1 助劑對微生物生長的影響 通過測定成膜劑、著色劑、分散劑、化學(xué)增效劑和增稠劑對微生物生長的影響（表2），選擇對微生物生長沒有抑制作用或促進(jìn)微生物生長的物質(zhì)并結(jié)合助劑的理化性質(zhì)（結(jié)果見2.3.1～2.3.6）綜合考慮，選出作為助劑。助劑確定為成膜劑3%海藻酸鈉，化學(xué)增效劑0.01%高效氯氟氰菊酯，0.2%著色劑酸性品紅，增稠劑0.1%黃原膠，分散劑2%木質(zhì)素磺酸鈉。

表2 各個劑型對功能微生物的菌數(shù)影響Table 2 Effect of each dosage form on the number of bacteria of functional microorganisms

2.3.2 成膜劑的篩選 通過稀釋涂布平板法測定成膜劑對3 株芽胞桿菌菌體生長的影響，從表2 中可以看出，海藻酸鈉和羧甲基纖維素鈉對3 種微生物的生長影響均沒有顯著影響，聚乙烯醇對菌體生長有明顯抑制作用。由表3 中不同成膜劑成膜性能的測試結(jié)果可知，羧甲基纖維素鈉較海藻酸鈉成膜慢；2%、3%、4%和5%的海藻酸鈉成膜性良好，但5%海藻酸鈉流動性極差，故選2%、3%、4%海藻酸鈉測定其包衣均勻度和包衣脫落率。包衣均勻度在90%以上，包衣脫落率在7%以內(nèi)，說明包衣性能較好。因此確定海藻酸鈉作為成膜劑，添加濃度為2%。

表3 不同濃度成膜劑的性能測定Table 3 Performance determination of film formers of different concentrations

2.3.3 化學(xué)增效劑篩選 選取以蠐螬為靶標(biāo)的8 種化學(xué)殺蟲劑，進(jìn)行殺蟲試驗。其中，高效氯氟氰菊酯、95%噻膚酰胺和吡蟲啉對蠐螬有良好的殺蟲效果。高效氯氟氰菊酯殺蟲效果最好，在0.1%的濃度下蠐螬24 h 的死亡率為93.33%，95%噻膚酰胺和吡蟲啉對蠐螬的死亡率分別為22.5%和12.5%。由表2 可知，高效氯氟氰菊酯對3 種微生物生長無影響，因此選擇高效氯氟氰菊酯為化學(xué)增效劑。

通過使用不同濃度的高效氯氟氰菊酯進(jìn)行殺蟲試驗，高效氯氟氰菊酯濃度為0.005%時，蠐螬死亡率在10%以內(nèi)。通過測定復(fù)合菌液中添加高效氯氟氰菊酯對蠐螬的殺滅效果，由圖2 可知，在復(fù)合菌液中添加高效氯氟氰菊酯，可以提高蠐螬的死亡率。添加0.01%的高效氯氟氰菊酯和添加0.02%的高效氯氟氰菊酯在死亡率上提高4%，但無顯著差異。以蠐螬死亡率為指標(biāo)且從生態(tài)環(huán)境考慮，因此化學(xué)增效劑的添加濃度0.01%。

圖2 復(fù)合發(fā)酵液添加化學(xué)增效劑高效氯氟氰菊酯對蠐螬的殺滅效果Fig.2 The combination of compound fermentation broth and chemical auxiliaries lambda-cyhalothri on the killing effect of grubs

2.3.4 著色劑的確定 通過稀釋涂布平板法，測定4 種著色劑（濃度0.3%）對3 株芽胞桿菌生長的影響，由表2 得出，酸性品紅對功能微生物的生長無顯著影響，堿性品紅、孔雀藍(lán)和結(jié)晶紫抑制菌體的生長。通過測定不同濃度的酸性品紅對玉米種子發(fā)芽率的影響，從表4 的結(jié)果可知，與其他處理相比，0.3%酸性品紅的種子發(fā)芽率較低。0.1%酸性品紅包衣顏色較淺，綜合考慮，選用酸性品紅為著色劑，使用濃度為0.2%較為合適。

表4 不同濃度酸性品紅對玉米種子發(fā)芽率的影響Table 4 Effects of different concentrations of acidic magenta on germination rate of maize seeds

2.3.5 增稠劑篩選 表5 可以看出，添加硅酸鋁鎂、有機(jī)膨潤土?xí)r，樣品均出現(xiàn)分層和析水等不穩(wěn)定現(xiàn)象。添加0.1%黃原膠，樣品在靜置時體系內(nèi)可形成牢固的凝膠支架結(jié)構(gòu)，在搖晃時又可變成流體，不影響樣品的流動性。同時由表2 可知，黃原膠對 3 株菌的生長沒有影響。因此，選用黃原膠作為增稠劑，濃度量為0.1%。

表5 不同增稠劑的性能測定Table 5 Performance determination of different thickeners

2.3.6 分散劑篩選 3 種分散劑對3 株芽胞桿菌生長影響的測定，結(jié)果如表2 所示，木質(zhì)素磺酸鈉對功能微生物的生長沒有顯著影響，D-1003 和D-1008 對功能微生物的生長有明顯抑制作用。

懸浮率是決定種衣劑的一個重要指標(biāo)，在2.3.3 著色劑和2.3.4 增稠劑確定的基礎(chǔ)上，測定不同濃度的木質(zhì)素磺酸鈉包衣種子的懸浮率。懸浮率在90%～100%分散效果好，從表6 的試驗結(jié)果可以看出，2%的木質(zhì)素磺酸鈉懸浮率為94.95%，分散效果好，故選用木質(zhì)素磺酸鈉為分散劑，添加濃度為2%。

表6 不同濃度木質(zhì)素磺酸鈉的懸浮率Table 6 Suspension rates of sodium lignosulfonate at different concentrations

2.4 復(fù)合微生物種衣劑的制備及質(zhì)量檢測

2.4.1 復(fù)合微生物種衣劑制備方法 將菌株ZLP-101 發(fā)酵菌液（≥2×109cfu/mL）、菌株ZLP-01 發(fā)酵菌液（≥2×108cfu/mL）及菌株ZLP-121 發(fā)酵菌液（≥5×107cfu/mL）按體積比為1∶1∶1 的比例混合均勻，再將0.01%的高效氯氟氰菊酯加入復(fù)合菌液中。再按比例加入2%的木質(zhì)素磺酸鈉、0.1%的黃原膠和0.2%的酸性品紅，最后，加入3%的海藻酸鈉，用攪拌器充分?jǐn)嚢瑁瞥缮锓N衣劑。將玉米種子表面消毒，晾干。生物種衣劑和種子按質(zhì)量比1∶50 稱取后，倒入燒杯中，充分?jǐn)嚢柽M(jìn)行包衣，至種子表面顏色均勻，平鋪晾干。

2.4.2 復(fù)合微生物種衣劑質(zhì)量檢測 參照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 17768-1999 懸浮種衣劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)范》和農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)《GB 20287-2006》對生物種衣劑主要指標(biāo)性能進(jìn)行檢測。結(jié)果見表7，活菌體含量大于 2.25×109cfu/mL，雜菌率小于2%，懸浮率大于90%，黏度322 mPa·s，成膜時間為7.47 min，包衣均勻度為92.63%，包衣脫落率6.38%，低溫穩(wěn)定性和熱貯穩(wěn)定性合格，表明所制備的種衣劑符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

表7 復(fù)合微生物種衣劑指標(biāo)檢測結(jié)果Table 7 Composite microbial seed coating index detection results

2.5 復(fù)合微生物種衣劑的室內(nèi)盆栽防效測定

2.5.1 對地下害蟲的防治效果 如表8 的結(jié)果所示，包衣種子播種10 d 后，該生物種衣劑對玉米種子的出苗率與對照相比提高了8%，對地下害蟲蠐螬的防效達(dá)79.63%，可以明顯抑制地下害蟲蠐螬對種子產(chǎn)生的為害，提高蟲口減退率。

表8 生物種衣劑對蠐螬的防治效果Table 8 Effect of biological seed coating agents on the control of grubs

2.5.2 對玉米立枯病害的防治效果測定 接種立枯絲核病原菌后，包衣的種子長勢較未包衣的種子長勢好，未包衣種子的發(fā)病率達(dá)到91%，包衣種子的發(fā)病率為15%，該生物種衣劑對玉米立枯病的室內(nèi)盆栽防效達(dá)83.64%，可有效降低其發(fā)病率。

3 討論

種衣劑可以保護(hù)種子發(fā)芽，幼苗健壯，減少病蟲害發(fā)生[13]，是種子處理常用的一種方式。目前常用種衣劑以中高毒化學(xué)藥劑為主要成分，隨著人們對食品安全和環(huán)境安全意識的提高，急需安全高效、環(huán)境友好的替代品，生物農(nóng)藥領(lǐng)域的研究越來越受到重視。國內(nèi)外都在積極開展生物型種衣劑的研發(fā)工作。Hameeda 等[14]用假單胞菌對鷹嘴豆進(jìn)行包衣，對莖腐病的防治效果與克菌丹的效果相當(dāng)。朱雪峰等[15]以微生物為活性成分的種衣劑對藜麥進(jìn)行包衣，可促進(jìn)藜麥植株的生長發(fā)育，提高產(chǎn)量。

鑒于單一微生物種衣劑的應(yīng)用缺陷，相關(guān)研究逐漸從單一菌株到多菌株復(fù)合或有益生物與高效低毒化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合應(yīng)用方向發(fā)展。劉睿等[16]研發(fā)以4 株生防菌為主要成分的生物種衣劑，對大豆苗期具有促進(jìn)作用、對根腐病具有防治作用。陳麗華等[17]以甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌復(fù)配化學(xué)農(nóng)藥為活性成分，研制出一種生物復(fù)合種衣劑，對棉花黃萎病害和棉大卷葉螟有抑制作用。

芽胞桿菌具有殺蟲抑菌[18]、促進(jìn)植物生長、提高植物抗病性[19]等作用。本試驗所用的貝萊斯芽胞桿菌ZLP-101，前期試驗證明了對蠐螬、蚜蟲等多種害蟲具有殺滅作用的同時，對多種植物病原真菌具有顯著的抑制作用，并促進(jìn)植物生長。成膜劑是種衣劑不可缺少的一部分，包裹的有效成分可通過成膜劑的網(wǎng)狀孔洞從根部釋放出去，隨著種子生長轉(zhuǎn)移到各個部位[20]。周茂超等[21]研究發(fā)現(xiàn)，90%海藻酸鈉＋10%聚乙烯醇處理的玉米種子發(fā)芽和苗期生長最佳。本研究以海藻酸鈉作為成膜劑，海藻酸鈉對菌株ZLP-101、菌株ZLP-01 和菌株ZLP-121 的生長沒有抑制作用且包衣性能良好。

關(guān)于微生物菌種單一、田間應(yīng)用效果不理想；貨架期短限制了產(chǎn)業(yè)發(fā)展[22]；防蟲型的生物種衣劑的研發(fā)還是空白等生物種衣劑存在的問題，本文的相關(guān)研究在生物種衣劑的研究方面取得了一定的進(jìn)展。本研究以貝萊斯芽胞桿菌ZLP-101 為核心，根據(jù)作用機(jī)理互補(bǔ)的原則輔以解淀粉芽胞桿菌ZLP-01 和枯草芽胞桿菌ZLP-121，研制出的多功能復(fù)合微生物種衣劑，結(jié)合盆栽應(yīng)用試驗，初步驗證了對地下害蟲蠐螬和玉米立枯病害的防治效果。為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)綠色農(nóng)用投入品、為解決當(dāng)前化學(xué)制劑對農(nóng)業(yè)環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的脅迫問題提供前期工作基礎(chǔ)，具有比較重要的研究與現(xiàn)實意義。