鄭雪芳，王階平，陳燕萍，車(chē)建美，陳 崢，陳梅春，劉 波

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源環(huán)境與土壤肥料研究所, 福州 350003）

由青枯雷爾氏菌Ralstoniasolanacearum（簡(jiǎn)稱(chēng)青枯菌）引起的作物青枯病是一種毀滅性土傳病害，其在茄果類(lèi)蔬菜上尤為嚴(yán)重[1]。常用防治策略包括抗病品種、嫁接、輪作、化學(xué)農(nóng)藥與土壤改良等，但效果均不穩(wěn)定[2]。目前為止，具有抗青枯病性能的作物品種很少，而且抗性不穩(wěn)定[3]；利用嫁接方法防治番茄青枯病雖獲得成功，但因成本太高，技術(shù)難度大而導(dǎo)致推廣和普及困難[4,5]；輪作在一定程度上能夠較好地防治青枯病，但受地理環(huán)境的影響，也難以大面積推廣[6]；化學(xué)農(nóng)藥防治雖有一定的防效，但隨著化學(xué)農(nóng)藥使用量的日益增大，易產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留，小種分化型復(fù)雜，而且尚未有一種理想的農(nóng)藥可以防治青枯病[7]，這些因素限制了他們?cè)趯?shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用；土壤改良能有效改善土壤理化狀況和生物特性，增強(qiáng)植物抗病能力，但其存在見(jiàn)效慢、成本高等問(wèn)題[8]。生物防治具有無(wú)污染、有利于人畜安全、對(duì)生態(tài)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，使得人們將目光逐漸轉(zhuǎn)向青枯病的生物防治[9,10]。

利用無(wú)致病力青枯菌研發(fā)植物疫苗來(lái)防治作物青枯病具有重要的生防應(yīng)用潛力[11]。無(wú)致病力青枯菌可在導(dǎo)管及相鄰組織內(nèi)廣泛分布，利用生態(tài)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)和營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)阻止或延遲強(qiáng)致病力的菌株侵入，或者激發(fā)植物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗病反應(yīng)，從而防止或延遲植株發(fā)病[12]。研究人員通過(guò)自然分離篩選、轉(zhuǎn)座子Tn5插入、基因工程等途徑獲得青枯菌的無(wú)致病力突變菌株，用于防治青枯病，均取得良好的防治效果[13-15]。作者在前期的研究中，將一株無(wú)致病力青枯菌FJAT-1957 進(jìn)行細(xì)菌色譜純化，獲得高純度和防效的菌株FJAT-aRS01（專(zhuān)利號(hào)ZL 2015 1 0589990.1）。研究發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)番茄盆栽苗和田間小區(qū)的防效，分別達(dá)100%和85.71%；如果利用該菌株研發(fā)的植物疫苗應(yīng)用到茄果類(lèi)蔬菜（番茄、茄子和辣椒）種苗健康繁育上，將極大地提升種苗的抗病能力。

在生防制劑的規(guī)模化生產(chǎn)中，為保障生產(chǎn)的可持續(xù)，選擇來(lái)源廣、營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低的發(fā)酵原料是降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵[16]。巨菌草是一種多年生禾本科植物，分蘗能力、適應(yīng)性強(qiáng)、是目前已知的禾本科中產(chǎn)量最高的植物，每畝平均年產(chǎn)量高達(dá)20～30 t，是一種可持續(xù)開(kāi)發(fā)的資源[17]。巨菌草糖分和粗蛋白含量高，富含賴(lài)氨酸、氨基酸、類(lèi)黃酮、皂苷、芳香類(lèi)物質(zhì)、表面活性劑及各類(lèi)有機(jī)鹽[18]，且具有來(lái)源廣、數(shù)量大和價(jià)格低的特點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的生防菌固態(tài)發(fā)酵原料。

本研究以巨菌草渣作為無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵的主要原料，初步篩選適宜FJAT-aRS01發(fā)酵的培養(yǎng)基，進(jìn)一步運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)，研究FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜種子萌發(fā)、植株生長(zhǎng)及青枯病害的防治效果，以期為無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 的工業(yè)化生產(chǎn)與田間應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株FJAT-aRS01 是將無(wú)致病力青枯菌FJAT-1957 進(jìn)行細(xì)菌色譜純化，獲得高純度和防效的無(wú)致病力青枯菌，強(qiáng)致病力青枯菌FJAT91 分離自番茄青枯病株的根際土壤，對(duì)番茄、辣椒和茄子均具有強(qiáng)致病力，供試菌株均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫(kù)收集保存。巨菌草渣由福建華閩菌草產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司提供，番茄（金石王1 號(hào)）、辣椒（B222）和茄子（如意情）種苗均購(gòu)自廈門(mén)如意集團(tuán)有限公司。優(yōu)化培養(yǎng)基原料：玉米粉、麩皮、稻殼、米糠、豆粕均購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、牛肉浸膏、酪水解素、酵母粉、瓊脂粉、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）均為國(guó)藥化學(xué)純?cè)噭?。聚丙烯滅菌袋?4 cm×28 cm×5 cm）購(gòu)自武漢宜康菌業(yè)科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配制

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（Nutrient Broth，NB）：蛋白胨5 g，蔗糖10 g，牛肉浸膏3 g，酵母粉1 g，蒸餾水定容至1 L，pH 為7.2，121℃滅菌20 min；TTC 培養(yǎng)基參照Kelman[19]方法配置，將蛋白胨10 g、水解酪蛋白1 g、葡萄糖5 g 和瓊脂17 g 用蒸餾水定容至1 L，pH 為7.2，121℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃～60 ℃，加入1.0% TTC 溶液至終濃度為0.5 g/L。

1.3 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵方法

1.3.1 種子液制備 菌株FJAT-aRS01 活化于TTC 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d，挑取單菌落于NB 培養(yǎng)基中，于30 ℃、170 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)24 h，即為無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 的種子液（2×109CFU/mL）。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選 將玉米粉、麩皮、豆粕、米糠等原料分別與巨菌草渣+稻殼（90%巨菌草渣+10%稻殼）按4∶6（質(zhì)量比）混合，按料水比1∶0.8（質(zhì)量比）加水并拌勻，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5，裝入聚丙烯滅菌袋（14 cm×28 cm×5 cm），121 ℃滅菌20 min，溫度降至常溫后，按質(zhì)量比為15%的接種量接入種子液體，30 ℃培養(yǎng)2 d。稱(chēng)取10 g 固態(tài)發(fā)酵物溶于90 mL 無(wú)菌水，10 倍梯度稀釋后，涂布于TTC 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基組合固態(tài)發(fā)酵物中活菌的數(shù)量。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化 根據(jù)篩選的主基質(zhì)結(jié)果，以巨菌草渣、玉米粉、米糠、稻殼為影響因子，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，正交優(yōu)化培養(yǎng)基滅菌、接種及發(fā)酵方法與上述相同，統(tǒng)計(jì)不同正交優(yōu)化組合固態(tài)發(fā)酵物中FJAT-aRS01 活菌數(shù)的方法與上述相同。

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵條件正交優(yōu)化 針對(duì)接種量、水料質(zhì)量比、發(fā)酵時(shí)間和裝袋量四個(gè)影響因素，以發(fā)酵料中無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 活菌數(shù)為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)進(jìn)行FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，正交優(yōu)化培養(yǎng)基滅菌、接種及發(fā)酵方法與上述相同，統(tǒng)計(jì)不同正交優(yōu)化組合固態(tài)發(fā)酵物中FJAT-aRS01 活菌數(shù)方法與上述相同。

1.4 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物的質(zhì)量檢測(cè)

1.4.1 感觀指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物的顏色、質(zhì)地（松散度、有無(wú)結(jié)塊等）和氣味。

1.4.2 菌體數(shù)檢測(cè) 隨機(jī)選取3 袋固態(tài)發(fā)酵物，稱(chēng)取10 g，溶于90 mL 無(wú)菌水，10 倍梯度稀釋后，涂布于TTC 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的活菌數(shù)量。

1.4.3 理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 隨機(jī)選取3 份無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物，送至檢測(cè)資質(zhì)單位測(cè)定理化性質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，包括水分（按GB/T 8576-2010 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）、pH（按NY/T 1121.2-2006 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）、有機(jī)質(zhì)（按NY/T 1121.2-2006標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）、全氮（按NY/T 1121.24-2012標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）、粗纖維（按GB/T 6434-2006標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）等，統(tǒng)計(jì)平均值。

1.4.4 FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜種子萌發(fā)的影響 以番茄（金石王1 號(hào)）、辣椒（B222）和茄子（如意情）的種子為試驗(yàn)材料，稱(chēng)取100 g 無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵物，用150 mL 無(wú)菌水慢慢澆灌至飽和，靜置24 h 后，用4 層紗布包裹，擠壓過(guò)濾，收集濾液，獲得浸提液（含菌量1.20×109CFU/mL）。用無(wú)菌水將浸提液分別稀釋至5、10、20、50、80、100 倍，4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎眉埳厦劝l(fā)法，番茄、辣椒和茄子種子于55 ℃溫水漂洗2 次，撈出瀝干，用上述不同稀釋倍數(shù)的浸提液浸種8 h，無(wú)菌水浸種為對(duì)照（CK）。浸種后轉(zhuǎn)移至底部鋪置兩層濾紙的9 cm 的透明培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿15 粒種子，3 次重復(fù)，7個(gè)處理。將培養(yǎng)皿置于27 ℃恒溫人工氣候箱，光照16 h、黑暗8 h，跟蹤觀察種子萌發(fā)情況，記錄發(fā)芽數(shù)，直至連續(xù)3 d 無(wú)新的發(fā)芽粒出現(xiàn)，測(cè)定種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、種子活力指數(shù)。發(fā)芽率（%）=（指定天數(shù)的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100；發(fā)芽指數(shù)（GI）=Σ（Gt/Dt），Gt 為第t 天的種子發(fā)芽數(shù)，Dt 為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)；活力指數(shù)（VI）=發(fā)芽指數(shù)×胚根長(zhǎng)（cm）。

1.4.5 FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜青枯病的防治效果 強(qiáng)致病力青枯菌FJAT-91 在TTC 平板上活化后，轉(zhuǎn)接至NB 培養(yǎng)基中，于170 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h，菌液稀釋至108CFU/mL。按不同質(zhì)量比（添加量0、5%、10%、15%、20%、25%），將無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵物（含菌量1.80×109CFU/g）添加至江平蔬菜育苗基質(zhì)（購(gòu)自廈門(mén)市江平生物基質(zhì)技術(shù)股份有限公司）中，充分混勻后，裝置盆缽中（小缽直徑15 cm、高10 cm），分別將苗齡20 d 的番茄（金石王1 號(hào)）、辣椒（B222）和茄子（如意情）移栽至盆缽，500 g/缽。移栽3 d 后，灌根接種FJAT-91 的菌液（接種濃度1×108CFU/mL），接種量為100 mL/盆，每處理15 盆，3 次重復(fù)。接種后每天觀察植株的發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)青枯病發(fā)病率和防治效果。發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100，防效（%）=（處理組發(fā)病率－對(duì)照組發(fā)病率）/對(duì)照發(fā)病率×100。

1.4.6 FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜植株生長(zhǎng)的影響 栽培基質(zhì)中添加不同量無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵物（添加量0、5%、10%、15%、20%、25%），充分混勻后，裝置盆缽中（15 cm×10 cm），500 g/缽，分別將苗齡20 d 長(zhǎng)勢(shì)一致的番茄（金石王1 號(hào)）、辣椒（B222）和茄子（如意情）種苗，移栽至盆缽中，4 株/盆，每種添加量處理6 盆（24 株）。盆栽苗移至人工氣候室培養(yǎng)，溫度為30±1 ℃，相對(duì)濕度90%。培養(yǎng)20 d 后隨機(jī)選取15 株測(cè)量植株的株高（卷尺測(cè)量葉片所能到達(dá)最高高度）和莖粗（游標(biāo)卡尺測(cè)量離基質(zhì)土面1 cm 莖部）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS 7.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

結(jié)果如表1 所示，巨菌草渣+稻殼+玉米粉處理組FJAT-aRS01 的活菌數(shù)最大為3.67×108CFU/g；其次是巨菌草渣+稻殼+米糠，該處理組FJAT-aRS01 的活菌量為2.60×108CFU/g；巨菌草渣+稻殼+豆粕和巨菌草渣+稻殼+麩皮處理組FJAT-aRS01 的活菌數(shù)分別為1.29×107和2.17×107CFU/g。

表1 FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選Table 1 Selection of basic medium for solid-state fermentation of the strain FJAT-aRS01

2.2 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果表明，處理水平2：巨菌草渣40 g、玉米粉30 g、米糠30 g、稻殼10 g，所培養(yǎng)出來(lái)的活菌數(shù)最多，為1.01×109CFU/g，與其他各處理水平差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；其次是處理水平1：巨菌草渣40 g、玉米粉15 g、米糠15 g 和稻殼5 g 所培養(yǎng)出來(lái)的FJAT-aRS01 活菌數(shù)為1.37×108CFU/g；處理水平5 的FJAT-aRS01 活菌數(shù)最低，為1.70×107CFU/g（表2）。因此，F(xiàn)JAT-aRS01固態(tài)發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基配方為巨菌草渣40 g、玉米粉30 g、米糠30 g 和稻殼10 g。

表2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of different treatments in orthogonal experimental design of solid-state fermentation medium

2.3 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

固態(tài)發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果表明，處理水平9：接種量15%、水料質(zhì)量比為0.8:1、裝袋量150 g 和發(fā)酵時(shí)間2 d，F(xiàn)JAT-aRS01 活菌數(shù)最大，為3.31×109CFU/g，與其他各處理水平的差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；其次是處理水平5 和7，這2 種發(fā)酵條件下，F(xiàn)JAT-aRS01 活菌數(shù)分別為5.74×108和5.04×108CFU/g；處理水平6，F(xiàn)JAT-aRS01 活菌數(shù)最低，為2.99×106CFU/g（表3）。因此，F(xiàn)JAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵條件為接種量15%、水料質(zhì)量比為0.8、裝袋量150 g 和發(fā)酵時(shí)間2 d。

2.4 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物的感觀指標(biāo)和菌體數(shù)

無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵物為黃褐色，質(zhì)地松散，無(wú)結(jié)塊（圖1），帶有發(fā)酵氣味。隨機(jī)抽取3 袋FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物樣本的活菌量分別為2.02×109CFU/g（圖2A）、1.52×109CFU/g（圖2B）和1.67×109CFU/g（圖2C）。

圖1 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 的固態(tài)發(fā)酵物Fig.1 Agents of R.solanacearium avirulent strain FJAT-aRS01

圖2 隨機(jī)抽取3 袋FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物在TTC 平板上分離菌的形態(tài)特征Fig.2 Colony morphology of isolates from FJAT-aRS01 agents by three random samples

2.5 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物的營(yíng)養(yǎng)成分分析

無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，水分平均含量為17.8%，pH 平均值為5.8，有機(jī)質(zhì)平均含量為27%，全氮平均含量為0.54%，全磷平均含量為130.33%，全鉀平均含量為0.57%，粗纖維平均含量為13.15%，其營(yíng)養(yǎng)成分含量超過(guò)微生物肥料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 798-2015），即總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）為8.0～25.0，有機(jī)質(zhì)≥20.0%。

表4 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物的營(yíng)養(yǎng)成分分析Table 4 Nutrient components analysis of FJAT-aRS01agents

2.6 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物浸提液的50、80 和100 倍稀釋液處理的番茄種子發(fā)芽率分別為79.33%、81.00%和76.17%，均顯著高于對(duì)照（72.67%）（P＜0.05），50 倍稀釋液處理的番茄種子發(fā)芽指數(shù)（18.26）和活力指數(shù)（133.69）也顯著高于對(duì)照（發(fā)芽指數(shù)12.54，種子活力指數(shù)109.65）。無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物浸提液的80 倍和100 倍稀釋液處理的辣椒種子發(fā)芽率分別為88.80%和93.30%，均顯著高于對(duì)照（82.93%），其100 倍稀釋液處理的辣椒種子發(fā)芽指數(shù)（60.28）和種子活力指數(shù)（420.67）也顯著高于CK（發(fā)芽指數(shù)56.59，種子活力指數(shù)254.64）。無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物浸提液的100 倍稀釋液處理茄子的種子發(fā)芽率（97.78%）、發(fā)芽指數(shù)（14.10）和種子活力指數(shù)（59.93）均顯著高于對(duì)照的發(fā)芽率（91.11%）、發(fā)芽指數(shù)（11.45）和種子活力指數(shù)（36.88）。無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物浸提液的稀釋數(shù)低于50 倍會(huì)抑制番茄、辣椒和茄子種子萌發(fā)，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)均顯著低于無(wú)菌水對(duì)照（P＜0.05，表5）。

表5 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜種子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of FJAT-aRS01 agents on germination of solanaceous vegetable seeds

2.7 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜青枯病的防治效果

青枯病防效試驗(yàn)結(jié)果表明，在觀察期30 d 內(nèi)，番茄、辣椒和茄子對(duì)照組（添加量為0）分別在接種強(qiáng)致病力青枯菌FJAT-91 后6、8 和12 d 植株開(kāi)始發(fā)病，接種30 d，番茄、辣椒和茄子發(fā)病率分別為99.33%、100%和99%。番茄、辣椒和茄子試驗(yàn)組中，均是FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物添加量25%處理組的青枯病發(fā)病率最低，防效最好；該添加量處理對(duì)番茄、辣椒和茄子的青枯病防效分別達(dá)85.33%、75.67%和80.11%（表6）。

表6 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜青枯病的防治效果Table 6 Control effects of FJAT-aRS01 agents against bacterial wilt of solanaceous vegetables

2.8 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜植株生長(zhǎng)的影響

無(wú)致病力青枯菌固態(tài)發(fā)酵物添加量小等于15%，會(huì)促進(jìn)番茄、辣椒和茄子植株生長(zhǎng)，反之則抑制植株生長(zhǎng)。對(duì)于番茄，添加量為5%時(shí)促長(zhǎng)效果最好，其株高和莖粗分別比對(duì)照增加29.62%和25.77%。對(duì)于辣椒和茄子，添加量10%促長(zhǎng)效果最好，辣椒的株高和莖粗分別比對(duì)照增加55.15%和33.66%，茄子的株高和莖粗分別比對(duì)照增加20.89%和13.01%（表7）。

表7 無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜植株生長(zhǎng)的影響Table 7 Effect of FJAT-aRS01 agents on plant growth of solanaceous vegetables

3 討論

生防菌的生產(chǎn)與應(yīng)用，發(fā)酵技術(shù)是關(guān)鍵[20]。目前市場(chǎng)上生防菌制備的方法多采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，其對(duì)設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而固體發(fā)酵具有培養(yǎng)基來(lái)源廣且價(jià)格低、能耗少、技術(shù)較簡(jiǎn)單、產(chǎn)物產(chǎn)率較高、環(huán)境污染較小等優(yōu)點(diǎn)，在微生物生產(chǎn)應(yīng)用中愈加廣泛[21]。陳新元等[21]利用農(nóng)產(chǎn)品下腳料（玉米芯等）對(duì)生防芽胞桿菌BMF04 進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，有效降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。本研究將農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物巨菌草渣進(jìn)行資源化利用，用作無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成份，在降低生產(chǎn)成本的同時(shí)，解決了農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品廢棄物對(duì)環(huán)境造成的污染，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

無(wú)致病力青枯菌FJAT-aRS01 對(duì)茄果類(lèi)蔬菜青枯病的防效好，具備開(kāi)發(fā)植物疫苗的潛能。植物疫苗的開(kāi)發(fā)利用應(yīng)當(dāng)考慮劑型的適宜性、運(yùn)輸便利性、生產(chǎn)成本等[21]。目前青枯病生防菌的發(fā)酵和生產(chǎn)工藝研究有較多報(bào)道[20,23,24]。陳燕萍等[20]利用微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料為發(fā)酵培養(yǎng)基主成分，固態(tài)發(fā)酵無(wú)致病力青枯菌FJAT-1458，活菌量達(dá)4.68×108CFU/g。本論文以巨菌草渣為發(fā)酵培養(yǎng)基主成分，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，確定其最佳培養(yǎng)基配方為巨菌草渣36.36%、玉米粉27.27%、米糠27.27%和稻殼9.09%；最佳發(fā)酵條件為接種量15%，料水質(zhì)量比為1:0.8，裝袋量為150 g/袋，發(fā)酵時(shí)間為48 h，在此培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件下，F(xiàn)JAT-aRS01 的固態(tài)發(fā)酵物平均活菌量為1.80×109CFU/g，與陳燕萍等[20]研究結(jié)果相比，活菌量增加近4 倍。

為了能夠在茄果類(lèi)蔬菜生產(chǎn)過(guò)程中安全、有效地利用FJAT-aRS01 的固態(tài)發(fā)酵物，本論文系統(tǒng)地研究了FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)茄果類(lèi)蔬菜種子萌發(fā)、植株生長(zhǎng)的影響及青枯病的防治效果：FJAT-aRS01固態(tài)發(fā)酵物對(duì)種子萌發(fā)的影響與浸提液濃度（低濃度促進(jìn)，高濃度抑制）密切相關(guān)，這與陳燕萍等[20]、魏云霞等[25]研究結(jié)果一致；FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物浸提液的50 倍稀釋液能促進(jìn)番茄種子萌發(fā)，其100 倍稀釋液能促進(jìn)辣椒和茄子種子萌發(fā)，且種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和種子活力數(shù)均顯著高于對(duì)照（發(fā)芽指數(shù)既可反映發(fā)芽的速度，也可反映發(fā)芽的整齊程度[26]。種子活力指數(shù)是種子發(fā)芽速率和生長(zhǎng)量的綜合反映[27]）；在栽培基質(zhì)中添加質(zhì)量百分比≤15%的FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物能促進(jìn)植株生長(zhǎng)，添加質(zhì)量百分比25%的FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物對(duì)于番茄、辣椒和茄子青枯病的防效均達(dá)75%以上，且防效隨添加量增大而增加，這與劉波等[28]研究結(jié)果相吻合。

綜上所述，低濃度FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物會(huì)促進(jìn)番茄、辣椒和茄子種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)，而高濃度FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物則會(huì)抑制種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)。對(duì)于番茄，F(xiàn)JAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物添加量為5%時(shí)促生效果最好，對(duì)于辣椒和茄子，添加量10%促生效果最好，但FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物添加量為25%時(shí)，對(duì)這3 種作物青枯病的防效均為最好。因此，在生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)不同作物，兼顧植株生長(zhǎng)和防效，適宜添加FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物。本論文僅對(duì)FJAT-aRS01 固態(tài)發(fā)酵物進(jìn)行室內(nèi)促生防病方面研究，其作用機(jī)理及田間應(yīng)用效果有待進(jìn)一步研究。