梁麗金，劉權(quán)震，覃柳瑩，崔婷，汪梅，曹嵌，黃瑤

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，味辛、苦，性溫，具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉、消風(fēng)祛斑的功效[1]。研究表明，補(bǔ)骨脂生品具有肝毒性[2-8]，而引起肝毒性的潛在成分可能為補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂酚等化學(xué)成分，其中補(bǔ)骨脂酚毒性最強(qiáng)[9]。補(bǔ)骨脂生品經(jīng)炮制后，能緩和其燥毒之性，并可引藥入腎，增強(qiáng)補(bǔ)腎納氣的作用[10]。《中國(guó)藥典》2020 年版一部“補(bǔ)骨脂飲片”項(xiàng)下收載了補(bǔ)骨脂和鹽補(bǔ)骨脂飲片，《雷公炮制論》中也有記載“酒補(bǔ)骨脂”飲片的應(yīng)用：“凡使，性本大燥毒，用酒浸一宿后，漉出，卻用東流水浸三日三夜，卻蒸，從巳至申，出，日干用”[11]，此外也有文獻(xiàn)采用酒焙法和酒浸炒炮制補(bǔ)骨脂[12-13]，這表明個(gè)別地方尚保留了酒補(bǔ)骨脂應(yīng)用?？梢?，炮制工藝對(duì)于補(bǔ)骨脂的“減毒增效”具有重要意義，而補(bǔ)骨脂炮制方法缺乏具體工藝參數(shù)，存在較強(qiáng)的主觀性。補(bǔ)骨脂生品飲片的性狀描述為“表面黑色、黑褐色或灰褐色”，而鹽補(bǔ)骨脂飲片的性狀描述為“表面黑色或黑褐色”[1]195，說(shuō)明補(bǔ)骨脂生品與炮制品飲片性狀較為一致，肉眼難以準(zhǔn)確區(qū)分。依據(jù)中醫(yī)辨證論治的用藥理論，醫(yī)生會(huì)針對(duì)患者病癥選用不同的補(bǔ)骨脂炮制飲片組方，因此，為保證臨床用藥的安全性、準(zhǔn)確性以及有效性，有必要加強(qiáng)補(bǔ)骨脂不同炮制品的質(zhì)量控制，防止臨床出現(xiàn)混用的情況。

中藥指紋圖譜是中藥整體化學(xué)成分的表征，常用于中藥的真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評(píng)價(jià)及生品與炮制品的區(qū)分等方面[14-16]。色度值可將中藥飲片的顏色進(jìn)行量化處理，在中藥炮制領(lǐng)域已有較為廣泛的應(yīng)用[17-19]。因此，本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合綜合評(píng)分法優(yōu)選鹽補(bǔ)骨脂與酒補(bǔ)骨脂的炮制工藝，同時(shí)比較補(bǔ)骨脂不同炮制品指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、指紋圖譜以及色度值的差異性，以期為補(bǔ)骨脂不同炮制品的工業(yè)生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)也為補(bǔ)骨脂“炮制減毒”的科學(xué)內(nèi)涵研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Vanquish型超高效液相色譜儀（Thermo公司）；TS7700型分光測(cè)色儀（深圳市三恩時(shí)科技有限公司），ME204E 型萬(wàn)分之一天平、XP26 型百萬(wàn)分之一天平（Mettler Toledo公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；數(shù)控KQ-500DE 型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H22-X3型電陶爐（杭州九陽(yáng)生活電器有限公司）；MiliQ Direct 8 型超純水機(jī)（默克密理博公司）。

1.2 試藥

補(bǔ)骨脂苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號(hào)ST55020105）、異補(bǔ)骨脂苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號(hào)ST55030105）、補(bǔ)骨脂酚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，批號(hào)ST06860120）對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；補(bǔ)骨脂素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，批號(hào)110738-202016）、異補(bǔ)骨脂素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.4%，批號(hào)110739-201918）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃酒（浙江老蔡酒業(yè)有限公司），甲醇為色譜純（默克公司），甲酸為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。補(bǔ)骨脂藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定均為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。16批補(bǔ)骨脂藥材來(lái)源信息見表1。

表1 16批補(bǔ)骨脂樣品來(lái)源信息表Table 1 Source information of 16 batches of Psoraleae Fructus sample

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法建立

2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以甲醇（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫0~9 min，18%A→30%A；9~18 min，30%A→46%A；18~19 min，46%A→57%A；19~34 min，57%A→77%A；34~42 min，77%A→90%A。柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。在此色譜條件下，對(duì)照品和供試品溶液中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚3種成分的分離度良好，色譜圖見圖1。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成3 種對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為598.596 0、602.165 2、1 378.566 0 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋成補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量濃度分別為29.929 8、30.108 3、275.713 2 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋制得7 種不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得到各成分的線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

表2 各成分的回歸方程及線性范圍Table 2 Regression equation and linear range of each component

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得到補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD 值分別為0.29%、0.34%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批補(bǔ)骨脂粉末（YN2201001）6 份，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得到補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值分別為0.34%、0.36%、0.27%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（YN2201001），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12、18、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得到補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚峰面積的RSD 值分別為1.42%、1.40%、1.39%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品（YN2201001）約0.25 g，共6份，精密稱定，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚的平均回收率分別為98.70%、95.61%、101.98%，RSD 值分別為0.57%、0.52%、0.52%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.2 補(bǔ)骨脂不同炮制品炮制工藝的優(yōu)選

以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及補(bǔ)骨脂酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在數(shù)據(jù)處理時(shí)參照文獻(xiàn)[20]引用指標(biāo)“隸屬度”計(jì)算，即高優(yōu)指標(biāo)（A1）隸屬度=（指標(biāo)值-指標(biāo)最小值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值）或低優(yōu)指標(biāo)（A2）隸屬度=（指標(biāo)最大值-指標(biāo)值）/（指標(biāo)最大值-指標(biāo)最小值），其中高優(yōu)指標(biāo)即指標(biāo)值越高越好，低優(yōu)指標(biāo)即指標(biāo)值越低越好；補(bǔ)骨脂素+異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的隸屬度按照A1 隸屬度計(jì)算，有文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂酚具有肝腎毒性[9]129-136，[21]，故補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的隸屬度按照A2隸屬度計(jì)算。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素是2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的指標(biāo)性成分，故規(guī)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)指標(biāo)權(quán)重為0.5；有文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)骨脂酚具有肝腎毒性，故將補(bǔ)骨脂酚作為補(bǔ)骨脂炮制工藝優(yōu)選的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，基于“效毒平衡”，故規(guī)定補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)權(quán)重為0.5。綜合評(píng)分值=補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)隸屬度×0.5+補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)隸屬度×0.5，計(jì)算各樣品的綜合評(píng)分值。

2.2.1 鹽補(bǔ)骨脂炮制工藝優(yōu)選 參考2020年版《中國(guó)藥典》[1]195“補(bǔ)骨脂飲片”【炮制】項(xiàng)下要求“取凈補(bǔ)骨脂，照鹽炙法（通則0213）炒至微鼓起”，取補(bǔ)骨脂9 份（每100 g 補(bǔ)骨脂，用食鹽2 g，水量為投料量的0.2 倍），每份按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行炮制。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[22]，悶潤(rùn)時(shí)間、炒制時(shí)間和炒制溫度對(duì)鹽補(bǔ)骨脂炮制工藝有一定影響，且現(xiàn)行藥典只規(guī)定了食鹽用量，其余炮制參數(shù)沒有明確，故選取悶潤(rùn)時(shí)間（A）、炮制溫度（B）、炮制時(shí)間（C）作為考察因素，因素水平表見表3。采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，取不同炮制的鹽補(bǔ)骨脂飲片樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算綜合評(píng)分，優(yōu)選鹽補(bǔ)骨脂炮制工藝，結(jié)果見表4，方差分析見表5。由直觀分析可知各因素主次影響為：C>B>A；方差分析表明因素A、因素B 和因素C 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著的影響。同時(shí)根據(jù)綜合評(píng)分值最大為0.991，故優(yōu)選鹽補(bǔ)骨脂的炮制工藝為悶潤(rùn)3 h，170 ℃炒制13 min。綜上所述，鹽補(bǔ)骨脂炮制工藝參數(shù)確定為：取凈補(bǔ)骨脂，加入鹽水（每100 g 補(bǔ)骨脂，用食鹽2 g，水量為投料量0.2 倍），攪拌均勻，悶潤(rùn)3 h，170 ℃炒制13 min。

表3 鹽補(bǔ)骨脂炮制正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factor level Table of orthogonal test of salt-processed Psoraleae Fructus processing

表5 方差分析結(jié)果Table 5 The results of variance analysis

表6 酒補(bǔ)骨脂炮制正交試驗(yàn)因素水平表Table 6 Factor level Table of orthogonal test of wine-processed Psoraleae Fructus processing

2.2.2 酒補(bǔ)骨脂炮制工藝的優(yōu)選 參考文獻(xiàn)[13]中《洪氏集驗(yàn)方》中補(bǔ)骨脂酒炒炮制的方法，取補(bǔ)骨脂9 份，每份按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)加炮制用黃酒量分別為投料量的10%、15%、20%（每100 g 補(bǔ)骨脂，用黃酒10、15、20 g）悶潤(rùn)4 h，隨后置于鍋內(nèi)炒制。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃酒用量、炮制時(shí)間和炮制溫度對(duì)酒補(bǔ)骨脂中指標(biāo)成分有一定影響[23]，故選取黃酒用量（A）、炮制溫度（B）、炮制時(shí)間（C）作為考察因素，因素水平表見6。采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及補(bǔ)骨脂酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，取不同批次的酒補(bǔ)骨脂飲片樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算綜合評(píng)分，優(yōu)選酒補(bǔ)骨脂炮制工藝，結(jié)果見表7，方差分析結(jié)果見表8。由直觀分析可知各因素主次影響為C>A>B；方差分析表明因素C 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因素A 和因素B 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)根據(jù)綜合評(píng)分值最大為0.831，故優(yōu)選酒補(bǔ)骨脂的炮制工藝為：加投料量的20%黃酒，110 ℃炒制13 min。綜上所述，酒補(bǔ)骨脂炮制工藝參數(shù)確定為：取凈補(bǔ)骨脂，加投料量的20%黃酒（每100 g 補(bǔ)骨脂用黃酒20 g），攪拌均勻，悶潤(rùn)4 h，110 ℃炒制13 min。

表7 酒補(bǔ)骨脂炮制工藝考察的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果及綜合評(píng)分值Table 7 Mass fraction determination results and comprehensive score values of wine-processed Psoraleae Fructus processing technology investigation

表8 方差分析結(jié)果Table 8 The results of variance analysis

2.3 補(bǔ)骨脂不同炮制品的制備

2.3.1 凈補(bǔ)骨脂飲片的制備 取“1.2”項(xiàng)下16 批補(bǔ)骨脂藥材（B1－B16），除去雜質(zhì)，得凈補(bǔ)骨脂飲片，編號(hào)S1－S16備用。

2.3.2 鹽補(bǔ)骨脂飲片的制備 取16 批凈補(bǔ)骨脂飲片（S1－S16），按“2.2.1”項(xiàng)下優(yōu)選的鹽補(bǔ)骨脂炮制工藝進(jìn)行炮制，得鹽補(bǔ)骨脂飲片，編號(hào)T1－T16，備用。

2.3.3 酒補(bǔ)骨脂飲片的制備 取16 批凈補(bǔ)骨脂飲片（S1－S16），按“2.2.2”項(xiàng)下優(yōu)選的酒補(bǔ)骨脂炮制工藝進(jìn)行炮制，得酒補(bǔ)骨脂飲片，編號(hào)J1－J16，備用。

2.4 補(bǔ)骨脂不同炮制品指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

取補(bǔ)骨脂不同炮制品，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)及補(bǔ)骨脂酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表9。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂經(jīng)炮制后，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)。

表9 補(bǔ)骨脂不同炮制品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果Table 9 Results of mass fraction determination of different processed products of Psoraleae Fructus(n=16,) w/%

表9 補(bǔ)骨脂不同炮制品質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果Table 9 Results of mass fraction determination of different processed products of Psoraleae Fructus(n=16,) w/%

注：同一列中，標(biāo)字母a的表明與補(bǔ)骨脂比較，P<0.05。

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2.5 指紋圖譜的檢測(cè)方法

2.5.1 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件。

2.5.2 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 取同一鹽補(bǔ)骨脂供試品溶液（YH2103003），按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以補(bǔ)骨脂素色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 值分別小于0.43%、2.00%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批鹽補(bǔ)骨脂（YH 2103003）粉末6份，精密稱定，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，以補(bǔ)骨脂素色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 值分別小于0.29%、2.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（YH2103003），按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以補(bǔ)骨脂素色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD 值分別小于0.18%、2.94%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 指紋圖譜的建立及共有峰的確定

取16批凈補(bǔ)骨脂、鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂飲片樣品，分別按照“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各特征峰的峰面積，并計(jì)算補(bǔ)骨脂不同炮制品“峰面積/稱樣量”值（缺失的色譜峰峰面積以0 計(jì)），結(jié)果見表10。分別將補(bǔ)骨脂、鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂飲片指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件進(jìn)行處理，其中補(bǔ)骨脂標(biāo)識(shí)17 個(gè)共有峰，鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂均標(biāo)識(shí)21 個(gè)共有峰。結(jié)果見圖2－4。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了峰1、2、5、6、21分別為補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚，如圖5－6所示。

圖2 16批補(bǔ)骨脂的UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 2 Superimposed chromatograms of UPLC fingerprints of 16 batches of Psoraleae Fructus

圖3 16批鹽補(bǔ)骨脂的UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 3 Superimposed chromatograms of UPLC fingerprints of 16 batches of salt-processed Psoraleae Fructus

圖4 16批酒補(bǔ)骨脂的UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 4 Superimposed chromatograms of UPLC fingerprints of 16 batches of wine-processed Psoraleae Fructus

圖5 鹽補(bǔ)骨脂樣品（a）及混合對(duì)照品溶液（b）的UPLC圖譜Figure 5 UPLC chromatograms of salt-processed Psoraleae Fructus sample（a）and mixed reference substance（b）

圖6 酒補(bǔ)骨脂樣品（c）及混合對(duì)照品（d）的UPLC圖譜Figure 6 UPLC chromatograms of wine-processed Psoraleae Fructus sample(c)and mixed reference substance(d)

表10 補(bǔ)骨脂不同炮制品指紋圖譜共有峰的峰面積與稱樣量比值的對(duì)比結(jié)果Table 10 Comparison of the ratio of the peak area of the common peak and the weight of the sample in the fingerprints of different processed products of Psoraleae Fructus(n=16,)

表10 補(bǔ)骨脂不同炮制品指紋圖譜共有峰的峰面積與稱樣量比值的對(duì)比結(jié)果Table 10 Comparison of the ratio of the peak area of the common peak and the weight of the sample in the fingerprints of different processed products of Psoraleae Fructus(n=16,)

注：同一行中，標(biāo)字母a 的表明與補(bǔ)骨脂比較，P<0.05；標(biāo)字母b的表明與鹽補(bǔ)骨脂比較，P<0.05。

?

2.8 補(bǔ)骨脂不同炮制品色度值的測(cè)定

采用測(cè)色儀測(cè)定補(bǔ)骨脂不同炮制品粉末的色度值（L*、a*、b*），平行測(cè)定3 次，取平均值，結(jié)果見表11。色度值L*表示顏色深淺明暗，即黑白色；a*值表示紅綠色軸，b*值表示黃藍(lán)色軸。L*的數(shù)值為正表示偏白，反之表示偏黑；a*的數(shù)值為正表示偏紅，反之表示偏綠；b*的數(shù)值為正表示偏黃，反之表示偏藍(lán)。

表11 補(bǔ)骨脂不同炮制品色度值測(cè)定結(jié)果Table 11 Determination results of colorimetric value of different processed products of Psoraleae Fructus(n=16,)

表11 補(bǔ)骨脂不同炮制品色度值測(cè)定結(jié)果Table 11 Determination results of colorimetric value of different processed products of Psoraleae Fructus(n=16,)

注：同一列中，標(biāo)字母a 的表明與補(bǔ)骨脂比較，P<0.05；標(biāo)字母b的表明與鹽補(bǔ)骨脂比較，P<0.05。

?

結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂經(jīng)炮制后，飲片色度值L*變小，炮制品顏色變暗變深；色度值a*增大，表明炮制品顏色偏紅。其中色度值a*增大比較明顯，而色度值b*變化不明顯。

2.9 方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)

采用SPSS 20 軟件對(duì)補(bǔ)骨脂不同炮制品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、指紋圖譜和色度值數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊性的采用方差分析，不符合的采用非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果見表9－11。

結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂與鹽補(bǔ)骨脂的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），補(bǔ)骨脂不同炮制品的補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但相對(duì)于補(bǔ)骨脂生品飲片，炮制后的鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所下降，故推測(cè)炮制后可能具有減毒功效。除了峰12、13、17、峰20 外，補(bǔ)骨脂生品與炮制品的其余特征峰均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；鹽補(bǔ)骨脂與酒補(bǔ)骨脂指紋圖譜中峰13 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。此外，補(bǔ)骨脂經(jīng)炮制后，峰1、2、9、15、16、21 的峰面積均有所下降，峰5、6、19 的峰面積均有所增加，且峰3、4、7、14為補(bǔ)骨脂炮制后新產(chǎn)生的特征峰，故峰3、4、7、14 可作為鑒別補(bǔ)骨脂生品與炮制品的專屬性特征峰。色度值結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂生品與炮制品的色度值a*差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；補(bǔ)骨脂與鹽補(bǔ)骨脂、鹽補(bǔ)骨脂與酒補(bǔ)骨脂的色度值L*差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同炮制品的色度值b*無(wú)明顯差異。

2.10 聚類分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)補(bǔ)骨脂不同炮制品中21個(gè)特征峰峰面積和色度值數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，聚類方法選擇ward 法，測(cè)量區(qū)間選擇平方Euclidean 距離，結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示可將樣品分成兩大類，其中補(bǔ)骨脂樣品（S1-S16）聚為一類；鹽補(bǔ)骨脂（T1-T16）和酒補(bǔ)骨脂（J1-J16）聚為另一類，說(shuō)明建立的補(bǔ)骨脂不同炮制品指紋圖譜及色度值可區(qū)分補(bǔ)骨脂生品與炮制品，但難以區(qū)分鹽補(bǔ)骨脂與酒補(bǔ)骨脂。

2.11 補(bǔ)骨脂不同炮制品的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

采用SIMCA 13.0軟件，對(duì)補(bǔ)骨脂不同炮制品指紋圖譜中21 個(gè)特征峰峰面積和色度值進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），OPLS-DA 得分圖見圖8，得出24 個(gè)指標(biāo)的VIP 值結(jié)果見表12。其預(yù)測(cè)模型的Q2 為0.58，大于0.5，說(shuō)明建立的預(yù)測(cè)模型有效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可根據(jù)模型中變量權(quán)重重要性（VIP），選取VIP 值>1.0 的因素作為差異性標(biāo)志物，故選取VIP 值>1.0 的因素作為引起補(bǔ)骨脂不同炮制品差異的重要特征指標(biāo)。由表12 結(jié)果可知，VIP值>1.0的指標(biāo)有峰2、3、4、7、9、13、14、15、16、19、21的峰面積以及色度值L*、a*、b*，故上述14 個(gè)指標(biāo)是鑒別補(bǔ)骨脂不同炮制品的差異性特征指標(biāo)。

表12 補(bǔ)骨脂不同炮制品的各指標(biāo)VIP值Table 12 VIP value of each index of different processed products of Psoraleae Fructus

2.12 相關(guān)分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)補(bǔ)骨脂不同炮制品的色度值（L*、a*、b*）與VIP 值>1.0 的色譜峰（峰2、3、4、7、9、13、14、15、16、19、21）及峰1、峰5、峰6、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)、補(bǔ)骨脂酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)分析，否則采用Spearman 相關(guān)性分析，結(jié)果見表13。結(jié)果顯示，色度值L*與峰2、9、15、16、21、1 呈現(xiàn)正相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著炮制過(guò)程L*值減小，峰2、9、15、16、21、1 的峰面積均減??；色度值L*與峰3、7、14、19、5、6、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著炮制過(guò)程L*值減小，峰3、7、14、19、5、6 的峰面積及補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均增加；色度值a*與峰3、4、7、14、19、5、6、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈正相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著炮制過(guò)程a*值增大，峰3、4、7、14、19、5、6 的峰面積及補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均增大；色度值a*與峰2、9、15、16、21、1 均呈負(fù)相關(guān)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即隨著炮制過(guò)程a*值增大，峰2、9、15、16、21、1的峰面積均減小；色度值b*與峰2、13、15、1 均呈正相關(guān)性且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與峰5、6、補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈負(fù)相關(guān)性且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表13 相關(guān)性分析結(jié)果Table 13 Results of correlation analysis

2.13 補(bǔ)骨脂不同炮制品峰面積和色度值范圍的確定 為實(shí)現(xiàn)補(bǔ)骨脂生品與炮制品的快速區(qū)分鑒別，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析和OPLS-DA 分析結(jié)果，選取VIP值>1.0且補(bǔ)骨脂不同炮制品中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)作為差異標(biāo)志物，并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)范圍，結(jié)果見表14。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂生品與炮制品的峰2、16、19 的峰面積以及色度值a*的范圍均沒有交集，表明除炮制后新增的峰3、4、7、14 外，共有峰2、16、19 和色度值a*亦可作為鑒別補(bǔ)骨脂生品和炮制品的關(guān)鍵指標(biāo)。鹽補(bǔ)骨脂與酒補(bǔ)骨脂中各指標(biāo)范圍均存在交集，二者難以區(qū)分。

表14 峰面積與稱樣量的比值及色度值范圍Table 14 The ratio of peak area to weighing sample and the range of chroma values

3 討論

傳統(tǒng)“辨色論質(zhì)”是通過(guò)藥材外觀色澤特點(diǎn)來(lái)判斷藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，中藥外觀顏色往往反映了其內(nèi)在成分的有無(wú)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而且與藥理活性相關(guān)。本研究通過(guò)研究色度值與色譜峰、指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性，可預(yù)測(cè)色度值與色譜峰、成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系，為補(bǔ)骨脂及炮制品質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供新方法。補(bǔ)骨脂不同炮制品色度值結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂經(jīng)炮制后，飲片色度值L*變小、色度值a*增大，其中色度值a*增大比較明顯，而色度值b*變化不明顯。結(jié)合相關(guān)分析結(jié)果可知，炮制后，飲片色度值L*變小，應(yīng)與峰2、9、15、16、21、1 的峰面積均減少及峰3、7、14、19、5、6的峰面積及補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均增加有關(guān)；色度值a*增大，應(yīng)與峰3、4、7、14、19、5、6 的峰面積及補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均增大及峰2、9、15、16、21、1 的峰面積均減小有關(guān)；色度值b*變化與峰2、15、1 的峰面積均減小及峰5、6的峰面積及補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均增大有關(guān)。

本研究對(duì)補(bǔ)骨脂不同炮制品進(jìn)行差異性研究，發(fā)現(xiàn)指紋圖譜中峰3、4、7、14 為補(bǔ)骨脂經(jīng)炮制后新增的特征峰，可作為區(qū)分補(bǔ)骨脂生品與炮制品的專屬性特征峰；同時(shí)補(bǔ)骨脂生品與炮制品指紋圖譜中峰2、16、19 的峰面積范圍存在較大差異，亦可用于生品與炮制品的區(qū)分鑒別。此外，補(bǔ)骨脂生品與炮制品飲片粉末的色度值a*的范圍不存在交叉，在實(shí)際生產(chǎn)檢驗(yàn)中，可采用色度儀測(cè)定飲片的色度值a*，達(dá)到快速區(qū)分補(bǔ)骨脂生品與炮制品的目的。除峰13 和色度值L*外，鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂各指標(biāo)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聚類分析也將鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂聚為一類，表明鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂的化學(xué)成分和色澤差異不大，同時(shí)也反映出酒補(bǔ)骨脂的性效與鹽補(bǔ)骨脂基本相似。對(duì)于鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂的鑒別還需深入研究，且峰13是否與不同輔料炮制對(duì)補(bǔ)骨脂功效有不同影響有關(guān)，也有待進(jìn)一步研究。

補(bǔ)骨脂生品具有溫腎助陽(yáng)、納氣平喘、溫脾止瀉功效，鹽炙后其補(bǔ)腎作用增強(qiáng)，但補(bǔ)骨脂生品性燥，易傷陰助火，具有一定的毒副作用[21]50-58，[24-25]，因此臨床上多使用其炮制品，在“炮制減毒”的基礎(chǔ)上更能增強(qiáng)其功效。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3，9]，補(bǔ)骨脂苷、異補(bǔ)骨脂苷、補(bǔ)骨脂酚等化學(xué)成分可能是引起肝毒性的潛在成分。本研究結(jié)果顯示，相對(duì)于補(bǔ)骨脂生品飲片，炮制后的鹽補(bǔ)骨脂和酒補(bǔ)骨脂中補(bǔ)骨脂酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所下降，且炮制品指紋圖譜中峰1（補(bǔ)骨脂苷）、2（異補(bǔ)骨脂苷）、9、15、16 的峰面積較生品明顯下降，表明以上所述成分的變化可能是補(bǔ)骨脂“炮制減毒”的機(jī)理之一。此外，補(bǔ)骨脂炮制品指紋圖譜中峰3、4、7、14、19 的峰面積顯著增加，推測(cè)這些成分的變化可能與其炮制后補(bǔ)腎作用增強(qiáng)有關(guān)。同時(shí)，補(bǔ)骨脂經(jīng)炮制后，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，指紋圖譜中峰1（補(bǔ)骨脂苷）和峰2（異補(bǔ)骨脂苷）的峰面積降低的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[26]補(bǔ)骨脂苷和異補(bǔ)骨脂苷會(huì)向補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素轉(zhuǎn)化的結(jié)果相一致。綜上可知，補(bǔ)骨脂酒炙和鹽炙均能達(dá)到炮制減毒作用，但目前炮制規(guī)范中炮制工藝僅是簡(jiǎn)單的定性描述，易使各地炮制工藝參數(shù)不一致，造成市售補(bǔ)骨脂炮制品質(zhì)量參差不齊，故有必要統(tǒng)一炮制工藝，建立參數(shù)明確、過(guò)程可控、穩(wěn)定性好的補(bǔ)骨脂炮制工藝，保證臨床用藥有效性和安全性。而現(xiàn)行藥典只記載鹽補(bǔ)骨脂，其原因可能是中藥炮制理論提到入鹽走腎，補(bǔ)骨脂鹽制后不僅能降低其燥性，而且能夠引藥入腎，來(lái)增強(qiáng)其溫腎壯陽(yáng)的功效，故在臨床應(yīng)用中也主要以其鹽制品為主。

本研究在優(yōu)選的補(bǔ)骨脂炮制工藝的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了補(bǔ)骨脂不同炮制品的指紋圖譜，同時(shí)對(duì)補(bǔ)骨脂不同炮制品外觀顏色進(jìn)行定量表征，建立了補(bǔ)骨脂生品與炮制品的鑒別方法。本研究可為補(bǔ)骨脂的炮制工藝、生品與炮制品的區(qū)分鑒別以及補(bǔ)骨脂的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。