鄭曼，袁燕，張風(fēng)雷，馬凱，李葉婷，顧磊，劉杰，王殿云

（1.東營市人民醫(yī)院，山東 東營 257091；2.深圳大學(xué)過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，廣東 深圳 518060）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性血管炎癥性疾病，其特點(diǎn)是動(dòng)脈內(nèi)膜受損和炎性細(xì)胞浸潤，參與其中的細(xì)胞和分子眾多[1-2]。每年全球有近2 000 萬人死于心血管疾?。╟ardiovascular disease，簡稱CVD）。作為心肌梗死等多種CVD 的病理基礎(chǔ)，AS 對人類健康構(gòu)成了重大的公共衛(wèi)生問題[3]。目前，AS 的預(yù)防和治療主要是通過控制心血管危險(xiǎn)因素并結(jié)合患者的臨床癥狀給予抗血小板藥物、抗缺血藥物治療等[4]。然而，長期大量服藥可能產(chǎn)生耐藥及藥物相關(guān)不良反應(yīng)，給患者帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理負(fù)擔(dān)[5]。多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）是一類廣泛存在于環(huán)境中的污染物，可通過吸入、飲食和皮膚接觸等途徑攝入。研究表明，PAHs 的暴露會(huì)增加AS 形成和CVD 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。而苯并芘（Benzopyrene，BaP）則為PAHs中含量最多且毒性最強(qiáng)的化合物之一，早在2010年已被列為I類致癌物[8]。

全蝎是指東亞鉗蝎（Buths martensii）的干燥體，被廣泛應(yīng)用于民間與臨床治療風(fēng)濕痹癥、痙攣抽搐、惡瘡腫毒等疾病[9]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，全蝎具有抗腫瘤[10]、抗癲癇[11]、抗驚厥、抗凝、抗菌[12]等多種藥理作用，并且還有鎮(zhèn)痛抗炎和提高免疫力等活性[13]。蝎毒、甾體衍生物和生物堿等小分子成分是全蝎藥理活性的重要基礎(chǔ)[14]。作為傳統(tǒng)藥食同源類中藥，我國全蝎資源十分豐富，但現(xiàn)有研究主要集中在蝎毒等生物活性成分的鑒定和臨床應(yīng)用上，如芪蝎活血通絡(luò)湯（主要成分為全蝎）對于腦血栓的形成，具有顯著的抑制效果[15]；同樣以全蝎為主要成分的復(fù)方芎蝎膠囊，在臨床上可有效改善頸動(dòng)脈粥樣硬化患者的腦供血不足的癥狀[16]；然而對于全蝎中具有抗AS 活性的肽類單體化合物的研究卻并沒有見到相關(guān)報(bào)道。本研究旨在通過構(gòu)建苯并芘（BaP）誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞氧化和炎癥損傷模型，追蹤分離全蝎中具有活性的肽，并研究其抗炎和抗氧化活性以及潛在的分子機(jī)制，以期為發(fā)現(xiàn)全蝎中潛在緩解和治療AS相關(guān)活性物質(zhì)，為功能性食品或藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所）；DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清-FBS和青霉素-鏈霉素混合液（美國Gbico）；BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；Cell counting KIT-8（CCK-8）（日本同仁）；ELISA 試劑盒（ROS、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2、ICAM-1 及VCAM-1）（北京四正柏生物科技有限公司）；COX-2、ASC、Caspase-1、NLRP3、p62、LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin和β-actin 的一抗抗體（美國CST）；山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗（美國CST）；苯并芘（美國MCE）。

1.2 主要儀器

SW-CJ-IC 型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）；INCO 2108 型CO2培養(yǎng)（Memmert，德國）；2K15 型低溫高速離心機(jī)（Sigma 公司，美國）；IKA-Labortechnik 渦旋振蕩器（Staufen，德國）；3-30K 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sigma 公司，美國）；Multiskan ?FC 酶標(biāo)儀（Thermo Fisher，美國）。

1.3 方法

1.3.1 全蝎活性肽分離、氨基酸序列鑒定 首先制備全蝎的總蛋白，后超濾分離全蝎總蛋白，利用疏水色譜法、陰離子交換色譜法、

反相高效液相色譜（RP-HPLC）分離等，最終分離純化得SOP-1（301.5 mg）、SOP-2（432.8 mg）、SOP-3（227.2 mg）、SOP-4（355.6 mg）。通過質(zhì)譜儀進(jìn)行ESI-MS 分析。使用Edman 降解法進(jìn)一步驗(yàn)證SOP-1~4的氨基酸序列[17]。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測 將HUVEC 細(xì)胞按5 000 cells/well的密度接種于96 孔板中，并按以下方法處理細(xì)胞：①空白（Control）組不做任何處理，第2~6組，用10 μmol/L 的BaP 處理12 h，第3~6 組分別用20 μmol/mL 的SOP-1~4 孵育24 h，20 μmol/mL 的谷胱甘肽（glutathione，GSH）作為對照組；②不同劑量的SOP-1（0、10、50、250、500及1 000 μmol/L）孵育24 h；③空白組不做任何處理，第2~5 組，用10 μmol/L 的BaP處理12 h，隨后在第3~5組用20 μmol/L的SOP-1分別孵育24、48、72 h；④空白組不做任何處理，用10 μmol/L的BaP處理12 h，隨后第3~5組分別用10、50、250、1 000 μmol/L的SOP-1孵育24 h。分別檢測其細(xì)胞活力[18-19]。

1.3.3 ELISA 法檢測細(xì)胞炎性因子及ICAM-1、VCAM-1 含量 將HUVEC 細(xì)胞按1×106cells/well的密度接種于6 孔板中，Control 組不做任何處理，BaP組、10 μmol/L組和50 μmol/L組首先用10 μmol/L 的BaP 處理12 h；隨后10 μmol/L 組和50 μmol/L組再分別用10 μmol/L 和50 μmol/L 的SOP-1 處理24 h；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的操作說明檢測ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、PGE2、ICAM-1及VCAM-1含量。

1.3.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 按照方法“1.3.3”處理細(xì)胞，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；在SDS-PAGE凝膠上分離蛋白；隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；將一抗（COX-2、ASC、Caspase-1、NLRP3、p62、LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin 和β-actin）用一抗稀釋液按1∶1000 稀釋，在4 ℃條件下孵育過夜；將二抗同樣按照按1∶1 000稀釋，用相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h；加入顯色液后在WB顯影儀中顯影。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18 軟件統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以表示，n=3。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對SOP-1 處理效應(yīng)進(jìn)行回歸分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSPs鑒定

基于MS/MS 數(shù)據(jù)解析及結(jié)合Edman 降解法驗(yàn)證，共分離并鑒定出4 種活性肽，見圖1。SOP-1 為氨基酸序列為Pro-Met-Tyr-His-Glu-Pro 的寡肽，SOP-2 為氨基酸序列為Phe-Thr-Glu-Gly-Pro 的寡肽，SOP-3為氨基酸序列為Phe-Arg-His-Ala-Leu-Ser的寡肽，SOP-4 為氨基酸序列為Trp-Glu-His-Lys-His-Ala的寡肽。

圖1 SOP-1~4 MS圖譜及結(jié)構(gòu)Figure 1 SOP-1~4 MS and structure

2.2 SOPs抗BaP損傷的活性評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A 所示，BaP 暴露損傷HUVEC細(xì)胞，使細(xì)胞活力顯著降低；與Control 組相比，BaP暴露HUVEC 細(xì)胞12 h 后，細(xì)胞活力降低21.6%（P<0.01）。而SOPs及GSH 能夠緩解BaP暴露導(dǎo)致的HUVEC 細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力；相比于BaP 處理組，SOP-1、SOP-2、SOP-3 及SOP-4 組細(xì)胞活力分別提高19.3%（P<0.01）、13.4%（P<0.05）、13.7%（P<0.05）及15.2%（P<0.05）；其中，SOP-1 保護(hù)活性最佳，且SOP-1 減輕BaP 暴露導(dǎo)致HUVEC 細(xì)胞損傷具有時(shí)間和劑量依賴性（圖2C、2D），因此后續(xù)以SOP-1為代表化合物對全蝎寡肽發(fā)揮保護(hù)活性的潛在分子機(jī)制進(jìn)行研究；同時(shí)，結(jié)果顯示，濃度不高于1 000 μmol/L 時(shí)，SOP-1 對HUVEC 細(xì)胞無顯著細(xì)胞毒性（圖2B）。

圖2 SOP-1抑制BaP的細(xì)胞毒性Figure 2 Inhibition of SOP-1 on the cytotoxicity induced by BaP(n=3)

2.3 SOP-1對BaP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞ROS及炎性因子過量分泌的影響

研究結(jié)果顯示，與Control組相比，BaP處理組的細(xì)胞ROS水平顯著增加了451.3%（P<0.01）；而相比于BaP組，不同濃度的SOP-1治療后，ROS含量分別減少33.6%（10 μmol/L，P<0.01）、63.5%（50 μmol/L，P<0.01）。表明SOP-1 可能具有抗氧化活性，能夠通過抑制BaP暴露誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞ROS過量產(chǎn)生，抑制細(xì)胞的氧化損傷（圖3A）。

圖3 SOP-1抑制BaP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞ROS及炎性因子過量分泌Figure 3 Inhibition of SOP-1 on the excessive expression of ROS and inflammatory factors in HUVEC cells induced by BaP

ELISA 的結(jié)果顯示，與Control 組相比，BaP 組的IL-1β、IL-6、IL-8 及TNF-α含量分別增加183.4%（P<0.01）、239.7%（P<0.01）、89.7%（P<0.01）和222.2%（P<0.01）；而50 μmol/L SOP-1 可顯著抑制BaP 導(dǎo)致的炎性損傷，IL-1β、IL-6、IL-8 及TNF-α的含量分別減少了41.3%（P<0.01）、50.7%（P<0.01）、5.29%及38.4%（P<0.01）。結(jié)果表明，SOP-1能夠通過抑制BaP 暴露誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞炎性因子過量表達(dá)、分泌發(fā)揮抗炎活性。

2.4 SOP-1對BaP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞PGE2、COX-2、ICAM-1和VCAM-1蛋白高表達(dá)的影響

與Control 組相比，BaP 組PGE2含量增加188.6%（P<0.01）；而與BaP組相比，50 μmol/L SOP-1 組PGE2含量減少42.1%（P<0.01，圖4A）；說明SOP-1 能夠有效抑制BaP 暴露誘導(dǎo)的PGE2過量分泌。COX-2 是PGE2的合成酶，為了探討SOP-1 對PGE2上游通路的影響，本研究還檢測了COX-2蛋白表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示，BaP 暴露顯著誘導(dǎo)HUVEC 細(xì)胞COX-2 蛋白高表達(dá)，而SOP-1 則有效抑制BaP暴露誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)增加（圖4B）。

圖4 SOP-1對BaP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞PGE2、COX-2、ICAM-1和VCAM-1蛋白高表達(dá)的影響Figure 4 Effect of SOP-1 on the overexpression of PGE2,COX-2,ICAM-1 and VCAM-1 in HUVEC cells induced by BaP (n=3)

同樣的，對于VCAM-1 和ICAM-1，BaP 暴露會(huì)導(dǎo)致其顯著升高，與Control組相比，BaP組ICAM-1、VCAM-1 含量分別增加289.5%（P<0.01）、126.7%（P<0.01）；而經(jīng)過50 μmol/L 的SOP-1 治療后，ICAM-1、VCAM-1 含量分別減少了59.8%（P<0.01）、5.87%（圖4C、D）。

2.5 SOP-1 對BaP 誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞NLRP3 炎癥小體激活的影響

為了進(jìn)一步探討SOP-1 抗BaP 誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞炎癥的機(jī)制，本研究對NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，BaP 處理后，NLRP3、ASC 和Caspase-1 的蛋白表達(dá)量顯著升高，NLRP3 炎癥小體被激活；而SOP-1 能夠有效抑制BaP 暴露誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞NLRP3、ASC和Caspase-1 蛋白表達(dá)增加，抑制NLRP3 炎性小體激活，SOP-1 的濃度越高，抑制效果越強(qiáng)（如圖5）。說明SOP-1 發(fā)揮抗炎活性與抑制BaP 誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞NLRP3 炎癥小體激活密切相關(guān)。

圖5 SOP-1抑制BaP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 5 Inhibition of SOP-1 on the expression of NLRP3 inflammasome associated proteins in HUVEC cells induced by BaP(n=3)

2.6 SOP-1 對BaP 誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞Pink1/Parkin信號(hào)通路激活的影響

為了研究SOP-1 抗BaP 誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制，對Pink1/Parkin 信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。如圖6 所示，BaP 暴露導(dǎo)致Pink 1、LC 3-Ⅱ及Parkin 蛋白的表達(dá)顯著增加，同時(shí)p62 的表達(dá)量顯著降低；表明BaP 暴露激活HUVEC 細(xì)胞的Pink1/Parkin 通路，可能通過HUVEC 細(xì)胞線粒體自噬的途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷。而SOP-1 處理后，BaP 暴露導(dǎo)致的Pink 1、LC 3-Ⅱ和Parkin 蛋白表達(dá)增加及p62蛋白表達(dá)減少均被逆轉(zhuǎn)，其中50 μmol/L的SOP-1 甚至可以將Pink1/Parkin 通路相關(guān)蛋白恢復(fù)至接近正常水平。結(jié)果表明，SOP-1 發(fā)揮抗氧化活性可能與抑制BaP 誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞Pink1/Parkin 信號(hào)通路的激活從而抑制線粒體自噬密切相關(guān)。

圖6 SOP-1調(diào)控BaP誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞Pink1/Parkin通路相關(guān)蛋白表達(dá)Figure 6 Effect of SOP-1 on the expression of Pink1/Parkin pathway related proteins in HUVEC cells induced by BaP(n=3)

3 討論

PAHs 是重要的環(huán)境和食品污染物，它們是煤、煙草等不完全燃燒產(chǎn)生含有苯環(huán)的稠環(huán)芳烴化合物。研究表明，AS 患者血清中PAHs 的含量明顯高于健康人群，同時(shí)在與PAHs 相關(guān)的AS 病理反應(yīng)中，發(fā)生了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[7]。中藥全蝎具有多種藥理活性，然而，尚未發(fā)現(xiàn)針對全蝎中的肽類成分的抗氧化、抗炎和緩解AS 功效方面的研究。本研究使用活性追蹤方法分離了全蝎活性肽，并研究了其在體外的抗AS活性。結(jié)果顯示，SOP-1能夠有效抑制由BaP暴露引起的HUVEC細(xì)胞損傷。

AS是由多種外界刺激和其他因素誘導(dǎo)形成的，其中氧化應(yīng)激和炎癥損傷是AS發(fā)生的主要機(jī)制[20]。COX-2 是一種酶，它在炎癥和傷害時(shí)被激活，從而合成包括PGE2前列腺素類物質(zhì)，已有證據(jù)表明，COX-2 的缺失會(huì)抑制AS 的發(fā)生和發(fā)展，因此COX-2/PGE2在AS 中起到重要作用[21]。在本研究中，SOP-1可以通過抑制BaP暴露引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)ROS和炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8）的過量產(chǎn)生，同時(shí)抑制COX-2/PGE2的表達(dá)，從而緩解了細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥損傷，提高了HUVEC細(xì)胞的活力。

VCAM-1 和ICAM-1 是表面黏附分子，在AS 模型中介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附。它們在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)升高，會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞募集和炎癥反應(yīng)[22]。本研究中，BaP的暴露引發(fā)了HUVEC細(xì)胞中ICAM-1、VCAM-1 以及炎性因子的表達(dá)升高，ICAM-1、VCAM-1 以及炎性因子進(jìn)一步相互作用，加劇了炎癥反應(yīng)，并對HUVEC 細(xì)胞造成損傷。SOP-1 可以通過抑制BaP 暴露所誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞中ICAM-1、VCAM-1 以及炎性因子的高表達(dá)，提高HUVEC細(xì)胞的活力，并發(fā)揮了保護(hù)作用。

NLRP3 炎性小體信號(hào)通路是AS 炎癥反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，NLPR3 受體識(shí)別細(xì)胞內(nèi)積累的脂肪酸、膽固醇結(jié)晶等物質(zhì)，形成激活的NLPR3 二聚體，進(jìn)而組成炎性小體結(jié)構(gòu)NLPR3/ASC/Caspase-1。該結(jié)構(gòu)能夠裂解炎癥因子前體并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)活性[23]。本研究結(jié)果表明，SOP-1 能有效抑制BaP 引發(fā)的HUVEC 細(xì)胞NLRP3 炎癥小體激活，從而進(jìn)一步抑制BaP 引起的HUVEC 細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌，并發(fā)揮保護(hù)作用。

線粒體功能障礙同樣與AS 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。自噬是細(xì)胞自我修復(fù)的重要途徑之一，其中線粒體自噬通過細(xì)胞自噬來清除受損的線粒體，維持線粒體數(shù)量和質(zhì)量的動(dòng)態(tài)平衡。線粒體自噬可以降解線粒體小碎片，從而減少ROS 釋放，減輕氧化應(yīng)激損傷[20]。Pink1 和parkin 是線粒體自噬關(guān)鍵因子。在正常情況下，Pink1 被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜并被泛素-蛋白酶系統(tǒng)剪切和降解。當(dāng)線粒體受損后，Pink1 在線粒體表面累積和激活，激活的Pink1會(huì)招募parkin到線粒體表面，并將其磷酸化，進(jìn)一步與LC3 適配體蛋白相互作用，最終降解受損的線粒體[24]。p62 是一個(gè)重要的蛋白負(fù)載體，可以促進(jìn)受損蛋白通過蛋白酶體和自噬體的清除。自噬激活后，p62 也會(huì)被大量清除，因此p62 的減少是自噬活躍的標(biāo)志[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BaP 的HUVEC細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)ROS 水平明顯上升，相應(yīng)的線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1和parkin的表達(dá)上調(diào)，而與自噬小體和溶酶體相關(guān)的LC3 蛋白的表達(dá)增加，p62 蛋白減少。推測BaP 的暴露通過激活Pink1/parkin 通路誘導(dǎo)線粒體自噬，從而對HUVEC 細(xì)胞造成氧化應(yīng)激和嚴(yán)重的氧化損傷。本研究結(jié)果提示SOP-1可以逆轉(zhuǎn)這個(gè)現(xiàn)象，這表明SOP-1能夠抑制Pink1/parkin 通路的激活，減少線粒體自噬，并減輕BaP 對HUVEC細(xì)胞的損傷。

本研究結(jié)果表明全蝎中存在的寡肽成分具有抑制由環(huán)境污染物BaP 暴露引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3 炎癥小體和Pink1/Parkin 信號(hào)通路激活的能力，從而減輕BaP 暴露引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化和炎性損傷，并發(fā)揮保護(hù)作用。全蝎中的寡肽類活性物質(zhì)具有抗氧化和抗炎活性，可以用于預(yù)防和治療AS，對功能性食品和藥物研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。