劉慧，王小娟，王弛，劉華豐，翁秋生，葉乃興，謝勇，趙峰*

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122；2福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建福州 350025；3福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002；4閩江師范高等專(zhuān)科學(xué)校，福建福州 350109）

0 引言

【研究意義】寡肽是一種小分子多肽，因其功效特殊，能通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散等作用被小腸上皮細(xì)胞吸收（王寧和令狐恩強(qiáng)，2018），在近年的食品科學(xué)研究中廣受關(guān)注。相關(guān)研究顯示，當(dāng)一系列特殊的氨基酸序列存在于大分子蛋白中時(shí)，因活性中心被包埋，通常不表現(xiàn)活性，但其以寡肽形式存在時(shí)，活性中心暴露后會(huì)顯現(xiàn)出特殊活性，如免疫調(diào)節(jié)（何麗霞等，2015）、降血糖（孫彬等，2016）、降血脂（李迪等，2017）、抗氧化（任金威等，2017）等功效。此外，寡肽對(duì)食品的風(fēng)味品質(zhì)有重要貢獻(xiàn)，乳蛋白水解后產(chǎn)生的各種肽對(duì)其甜味、苦味和酸味均有影響（王永強(qiáng)等，2008）；大豆蛋白經(jīng)微生物發(fā)酵后，產(chǎn)生的大豆肽風(fēng)味獨(dú)特（劉新旗等，2020）；畜肉解僵期的蛋白質(zhì)降解會(huì)改善肉品的滋味（竇露等，2020）。對(duì)食品肽的系統(tǒng)研究已為新型食品添加劑或功能性食品研發(fā)提供了諸多關(guān)鍵理論支持，有力促進(jìn)傳統(tǒng)食品產(chǎn)業(yè)的升級(jí)，成為食品科學(xué)的重要發(fā)展方向之一（Ayim et al.，2018；Liu et al.，2021）。茶是風(fēng)靡全球的飲品，不但風(fēng)味極佳，而且保健功效突出。建立一種茶葉寡肽定量分析方法，分析不同茶類(lèi)寡肽含量的差異，對(duì)茶葉寡肽的相關(guān)研究和利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】茶葉中的含氮化合物占干重的20.00%~30.00%，其存在形式包括游離氨基酸、水溶性蛋白質(zhì)和水不溶性蛋白質(zhì)（顧謙等，2002；于鵬亮，2013）。茶葉中水溶性蛋白質(zhì)由少量水溶性大分子量蛋白質(zhì)和大量寡肽構(gòu)成（羅欽等，2012）。目前，茶葉水溶性蛋白質(zhì)的主要定量方法是考馬斯亮藍(lán)法，但G250染色劑對(duì)茶葉寡肽的顯色效果不佳（陳蓉等，2015）。其他常見(jiàn)的水溶性蛋白質(zhì)測(cè)定方法有福林酚法和雙縮脲法（張賢忠等，2013；衛(wèi)國(guó)等，2016；張玲等，2019），但這些方法通常會(huì)受到茶葉中酚類(lèi)物質(zhì)的干擾，也無(wú)法實(shí)現(xiàn)茶葉寡肽定量。目前關(guān)于寡肽定量方法的報(bào)道較少，大多以雙縮脲法和福林酚法檢測(cè)食品或藥物中多肽含量（衛(wèi)國(guó)等，2016；張玲等，2019），但此類(lèi)方法不適用于寡肽。目前關(guān)于寡肽的定量研究方法，羅欽等（2008，2012）利用甲醛滴定法和凱氏定氮法檢測(cè)魚(yú)粉中寡肽含量，并建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，為茶葉寡肽的定量分析提供了研究思路。【本研究切入點(diǎn)】本課題組前期研究已從白茶中發(fā)現(xiàn)了一系列具體寡肽（Zhao et al.，2019），并通過(guò)超高分辨液質(zhì)聯(lián)用等大型分析設(shè)備構(gòu)建了茶葉寡肽的高通量測(cè)序方法（Zhao et al.，2022），但關(guān)于茶葉寡肽定量分析方法的建立尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究立足于常規(guī)理化實(shí)驗(yàn)室硬件條件，根據(jù)食品寡肽測(cè)定的基本原理（曾哲靈等，2012），從提取液的水溶性蛋白質(zhì)組成切入，先以沉淀劑去除大分子量蛋白質(zhì)，再以凱氏定氮法測(cè)定其上清液的總氮（即游離氨基酸和寡肽總量），最后減去通過(guò)甲醛滴定法測(cè)得的上清液中游離氨基酸含量，即得寡肽含量，構(gòu)建簡(jiǎn)便可行的茶葉寡肽定量方法?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】三氯乙酸沉淀大分子量蛋白、甲醛滴定法測(cè)定游離氨基酸總量和凱氏定氮法測(cè)定總氮均為經(jīng)典且成熟的理化分析方法，本研究將上述方法按照食品寡肽測(cè)定的基本原則設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化提取條件；同時(shí)，通過(guò)一定數(shù)量樣本實(shí)測(cè)，檢測(cè)其可靠性和實(shí)用性，以期構(gòu)建適用于普通理化實(shí)驗(yàn)室操作、簡(jiǎn)便可行的茶葉寡肽定量方法，為茶葉寡肽研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試茶類(lèi)包括黑茶、白茶、綠茶、紅茶、黃茶和烏龍茶共六大類(lèi)，30份樣品，具體信息見(jiàn)表1。無(wú)水乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉、濃硫酸、鹽酸和甲醛均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司。主要儀器設(shè)備：SH420F石墨消解儀、K9840自動(dòng)凱氏定氮儀（山東海能科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3Eph計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；HH-6S恒溫水浴鍋［拓赫機(jī)電科技（上海）有限公司］；DL-4000C冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 混合樣制備30份參試樣品各取10 g，混合粉碎后，以四分法縮分制備代表性樣，用于方法優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.2 樣液提取及前處理.稱(chēng)取2.500 g粉碎樣置于錐形瓶，加入50 mL 50%（v/v）乙醇水溶液搖勻，接回流冷凝管后，置于80℃水浴鍋提取30 min，冷卻并重新定容至50 mL。

1.2.3 提取條件單因素試驗(yàn).分別稱(chēng)取2.500 g樣品置于錐形瓶，加入50 mL提取溶劑并搖勻后，置于水浴鍋中，接回流冷凝管。

具體試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)：80℃水浴條件下，以不同濃度的提取溶劑（水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和100%乙醇），分別提取30 min；以50%乙醇作提取溶劑，在不同水浴溫度（60、70、80、90和100℃）下，分別提取30 min；以50%乙醇作提取溶劑，在80℃水浴條件下，分別提取不同時(shí)間（20、30、40、50和60 min）。

1.2.4 寡肽含量測(cè)定.提取液冷卻后，以對(duì)應(yīng)溶劑定容至50 mL，搖勻，移取20 mL溶液2份，分別加入20 mL 15%（m/v）三氯乙酸，搖勻，4℃靜置30 min后，離心取上清液。分別準(zhǔn)確移取20 mL溶液2份，一份以凱氏定氮法測(cè)定寡肽和游離氨基酸總量，另一份以甲醛滴定法測(cè)定游離氨基酸含量。

寡肽和游離氨基酸總量：向提取液中加入20 mL 15%三氯乙酸溶液，混合并靜置5 min，4000 r/min離心5 min，過(guò)濾，根據(jù)GB/T 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法操作，消解并測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

式中，T為寡肽和游離氨基酸總量（%），C為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L），V為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積（mL），V0為滴定空白體積（mL），m為折算后樣品質(zhì)量（g），6.25為蛋白質(zhì)換算系數(shù)。

游離氨基酸含量：向提取液中加入60 mL純凈水，按照GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的甲醛滴定法進(jìn)行操作，以NaOH溶液調(diào)節(jié)樣液pH至8.20后，加10 mL中性甲醛溶液，1 min后再以0.1 mo/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定樣液pH 9.20，記錄標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗量，計(jì)算游離氨基酸含量。

式中，A為游離氨基酸含量（%），C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L），V為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積（mL），V0為滴定空白體積（mL），m為折算后樣品質(zhì)量（g），7為氨基酸轉(zhuǎn)換系數(shù)。

寡肽含量計(jì)算：寡肽含量=寡肽和游離氨基酸總量-游離氨基酸含量，即：G（%）=T-A。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn).按照優(yōu)化后的提取方法，平行稱(chēng)取6份樣品，試驗(yàn)后計(jì)算結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），評(píng)估方法的穩(wěn)定性。

1.2.6 總蛋白質(zhì)含量.稱(chēng)取0.20 g樣品置于消化管中，按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)得總蛋白質(zhì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Office 2016和SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、差異顯著性檢驗(yàn)及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑濃度對(duì)茶葉中寡肽含量的影響

由圖1可知，從寡肽和游離氨基酸總量（T）及游離氨基酸含量（A）的提取結(jié)果來(lái)看，隨著提取溶劑中乙醇占比的增加，二者均呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，即以50%乙醇作提取溶劑時(shí)，提取含量均達(dá)峰值，寡肽和游離氨基酸總量為8.07%，游離氨基酸含量為4.02%，與提取溶劑為水和無(wú)水乙醇（100%乙醇）時(shí)的含量相比，均存在顯著差異（P＜0.05，下同）。

圖1 不同濃度提取溶劑對(duì)寡肽含量的影響Fig.1 Effects of extraction solvents of different concentrations on oligopeptide content

寡肽含量的變化趨勢(shì)雖然與寡肽和游離氨基酸總量、游離氨基酸含量相似，但提取溶劑為水、25%乙醇和50%乙醇時(shí)，增長(zhǎng)趨勢(shì)并不明顯，當(dāng)乙醇比例繼續(xù)增加，寡肽含量開(kāi)始下降。綜合寡肽和游離氨基酸總量與游離氨基酸含量的結(jié)果，當(dāng)以水和25%乙醇為提取溶劑時(shí)，寡肽和游離氨基酸總量與游離氨基酸含量的提取尚不充分，尤其是游離氨基酸含量的溶出率低，由此導(dǎo)致寡肽含量結(jié)果略高。

進(jìn)行溶劑優(yōu)化的最終目的是確保目標(biāo)物質(zhì)（T和A）的提取效率最高。當(dāng)以50%乙醇為提取溶劑時(shí)，寡肽和游離氨基酸總量與游離氨基酸含量均達(dá)最大值，考慮到二者的變化趨勢(shì)基本一致，故認(rèn)為此時(shí)對(duì)應(yīng)的寡肽含量更可靠，因此選擇50%乙醇作為提取溶劑，此時(shí)寡肽含量為4.05%。

2.2 提取溫度對(duì)茶葉中寡肽含量的影響

由圖2可知，提取溫度對(duì)寡肽和游離氨基酸總量無(wú)顯著影響（P＞0.05，下同），總量在8.02%~8.49%；游離氨基酸含量則在60、70、80和100℃間無(wú)顯著差異，含量在3.81%~4.37%，提取溫度為90℃時(shí)，游離氨基酸含量達(dá)峰值，與60和70℃的游離氨基酸含量間無(wú)顯著差異，但與80和100℃存在顯著差異；寡肽含量在60~90℃無(wú)顯著差異，含量在3.71%~4.46%，呈先升后降的變化趨勢(shì)，其中80℃時(shí)寡肽含量最高；100℃時(shí)寡肽含量突然上升，是由于100℃時(shí)游離氨基酸含量低，導(dǎo)致寡肽含量相對(duì)較高。

圖2 不同提取溫度對(duì)寡肽含量的影響Fig.2 Effects of different extraction temperatures on the content of oligopeptide

綜上結(jié)果，70和80℃均為可行的提取溫度條件，以寡肽含量為判斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇寡肽含量高的溫度條件，確定以80℃為優(yōu)化后提取溫度。

2.3 提取時(shí)間對(duì)茶葉中寡肽含量的影響

如圖3所示，在20~50 min范圍時(shí)，寡肽和游離氨基酸總量、游離氨基酸含量及寡肽含量均呈先升后降的變化趨勢(shì)，提取時(shí)間為60 min時(shí)，三者含量又有所上升。提取時(shí)間對(duì)寡肽和游離氨基酸總量、游離氨基酸含量及寡肽含量均無(wú)顯著影響，其中寡肽含量在3.71%~4.68%；提取時(shí)間為30和40 min時(shí)，寡肽含量分別為4.43%和4.42%，二者相差小，在時(shí)間因素對(duì)寡肽含量無(wú)顯著影響的情況下，選擇30 min為優(yōu)化后的提取時(shí)間，保證提取效率的同時(shí)，縮短提取時(shí)間。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)寡肽含量的影響Fig.3 Effects of different extraction times on oligopeptide content

2.4 方法穩(wěn)定性結(jié)果

本研究中寡肽為多種寡肽混合物，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此僅考慮重復(fù)性試驗(yàn)，驗(yàn)證其穩(wěn)定性。結(jié)果（表2）顯示，重復(fù)試驗(yàn)的RSD均小于5.00%，寡肽含量測(cè)定方法的穩(wěn)定性良好。

表2 方法穩(wěn)定性結(jié)果Table 2 Stability test result of method

2.5 各茶類(lèi)寡肽含量測(cè)定結(jié)果

按照最終確定的樣品提取及測(cè)定方法，對(duì)六大茶類(lèi)樣品（共30份）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示；按照其所屬茶類(lèi)，進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析（表4）。從總蛋白質(zhì)含量、寡肽和游離氨基酸總量、游離氨基酸含量及寡肽含量測(cè)定結(jié)果來(lái)看，不同茶類(lèi)、不同品種茶之間的變化趨勢(shì)基本一致，總蛋白質(zhì)含量高的茶葉，其寡肽含量也高。不同品種烏龍茶的總蛋白質(zhì)含量為17.82%~28.87%，其中大紅袍的總蛋白質(zhì)含量最高，其寡肽含量也最高（3.93%），鐵觀音的寡肽含量最低，僅有0.70%；烏龍茶的總蛋白質(zhì)和寡肽含量均值在六大茶類(lèi)中均為最低。不同品種紅茶中總蛋白質(zhì)含量為22.29%~27.55%，紅茶1的總蛋白質(zhì)含量最低，寡肽含量也最低，為1.90%，紅茶2的總蛋白質(zhì)含量最高，寡肽含量也最高，為4.84%，是紅茶1寡肽含量的2.5倍。不同品種白茶的總蛋白質(zhì)含量為26.00%~36.15%，寡肽含量為3.88%~6.00%，牡丹皇寡肽含量是白牡丹寡肽含量的1.5倍。不同品種黑茶中總蛋白質(zhì)含量為24.33%~30.55%，寡肽含量為3.11%~6.53%，其中六堡茶和普洱熟茶的寡肽含量分別為6.53%和5.42%，明顯高于其他品種黑茶，六堡茶的總蛋白質(zhì)含量最高，普洱熟茶的總蛋白質(zhì)含量（26.10%）較高；雖然黑毛茶1總蛋白質(zhì)含量較低，但其游離氨基酸和寡肽總量及游離氨基酸含量均最高。不同品種綠茶中總蛋白質(zhì)含量為23.98%~33.95%，其中云霧康花茶的總蛋白質(zhì)含量最低，其寡肽含量也僅有2.45%，約為茉莉花茶寡肽含量的二分之一。六大茶類(lèi)中，黃茶的總蛋白質(zhì)含量最高，為30.79%~38.11%，寡肽含量為4.73%~5.76%，均值分別為33.64%和5.31%，且各品種黃茶之間的總蛋白質(zhì)含量、游離氨基酸和寡肽總量、游離氨基酸含量及寡肽含量差異小。

表3 參試樣品總蛋白質(zhì)含量、寡肽和游離氨基酸總量（T）、游離氨基酸含量（A）及寡肽含量（G）的測(cè)定結(jié)果（%）Table 3 Determination results of total protein content，oligopeptide and free amino acid content（T），total free amino acid content（A）and oligopeptide content（G）in tested samples（%）

表4 各茶類(lèi)樣品總蛋白質(zhì)含量、寡肽和游離氨基酸總量（T）、游離氨基酸含量（A）及寡肽含量（G）的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（均值±偏差）（%）Table 4 Statistical results of total protein content，oligopeptide and free amino acid content（T），total free amino acid content（A）and oligopeptide content（G）of different teas（mean±SD）（%）

各茶類(lèi)有其相應(yīng)的鮮葉采摘標(biāo)準(zhǔn)，一般而言，鮮葉原料嫩度高的茶，其總蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量高于粗老原料加工的茶（李兵等，2019）。由表3和表4可知，參試樣品的總蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量大致分為兩類(lèi)：一類(lèi)是黃茶、白茶和綠茶，其原料嫩度高，總蛋白質(zhì)平均含量為30.85%~33.64%，游離氨基酸平均含量為5.00%~6.22%；另一類(lèi)是烏龍茶、紅茶和黑茶，其原料相對(duì)較粗老，故總蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量均稍低，分別為21.16%~26.81%和2.83%~4.57%。寡肽含量測(cè)定結(jié)果顯示，黃茶和白茶相對(duì)較高，可達(dá)5.31%和5.20%；其次為黑茶和綠茶，分別為4.42%和4.28%；紅茶和烏龍茶較低，分別為3.31%和2.24%。

3 討論

3.1 茶葉寡肽提取方式

通過(guò)單因素試驗(yàn)，分別證實(shí)提取溶劑、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)茶葉中寡肽含量的影響。由于寡肽含量為寡肽和游離氨基酸總量與游離氨基酸含量的差值，在單因素試驗(yàn)中，需綜合考慮這2個(gè)指標(biāo)的含量。

乙醇和水是常用的中藥材提取溶劑，主要用于提取極性物質(zhì)。隨著乙醇比例的增加，游離氨基酸含量、寡肽和游離氨基酸總量及寡肽含量均呈先升后降的變化趨勢(shì)，在提取溶劑為50%乙醇時(shí)，3種物質(zhì)含量均達(dá)最大值，因此選擇50%乙醇作為最優(yōu)提取溶劑，但提取溶劑為25%、50%和75%乙醇時(shí)，寡肽和游離氨基酸總量及游離氨基酸含量均無(wú)顯著差異。提取溫度對(duì)游離氨基酸和寡肽總量無(wú)顯著影響，提取溫度為80℃時(shí)，寡肽含量高，但提取溫度為60~90℃時(shí)，寡肽含量均無(wú)顯著差異。乙醇的沸點(diǎn)是78.4℃，提取溫度為60和70℃時(shí)，未達(dá)到乙醇的沸點(diǎn)，無(wú)法達(dá)到回流條件，游離氨基酸和寡肽不能完全溶出。提取時(shí)間對(duì)于寡肽和游離氨基酸的提取無(wú)顯著影響，因此在選擇提取時(shí)間時(shí)，從提取效率考慮，選擇30 min為宜。

寡肽含量是將提取液中測(cè)得的游離氨基酸和寡肽總量減去游離氨基酸含量所得。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，提取溶劑種類(lèi)對(duì)游離氨基酸和寡肽總量及游離氨基酸含量存在明顯且不同的影響趨勢(shì)，但由于寡肽含量是二者相減的結(jié)果，從實(shí)際的計(jì)算結(jié)果來(lái)看，除提取溶劑種類(lèi)外，提取溫度和提取時(shí)間并未對(duì)寡肽含量造成明顯影響。分析其原因，可能是由于試驗(yàn)所采用的熱回流提取方法中回流提取溫度較高，已能確保茶葉寡肽的充分溶出，故而認(rèn)為沒(méi)有必要進(jìn)一步開(kāi)展正交試驗(yàn)。

3.2 茶葉游離氨基酸測(cè)定方法

目前常見(jiàn)的氨基酸定量分析方法有茚三酮顯色法、甲醛滴定法和AQC柱前衍生法。由于寡肽的化學(xué)性質(zhì)與游離氨基酸較為接近，存在暴露的氨基端和羧基端，因此也具備兩性電解質(zhì)特征，還原性茚三酮除了與氨基酸的氨基端反應(yīng)生成紫色化合物，還會(huì)與寡肽暴露的氨基端發(fā)生反應(yīng)。AQC柱前衍生法是目前公認(rèn)的較準(zhǔn)確可靠的游離氨基酸測(cè)定方法，需通過(guò)各具體氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，配合柱前或柱后衍生處理后，借助自動(dòng)氨基酸分析儀、色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀等大型分析系統(tǒng)開(kāi)展（陳思肜等，2019；Zhou et al.，2019），操作方法較復(fù)雜。本研究采用甲醛滴定法測(cè)定游離氨基酸，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便易行，不需要色譜質(zhì)譜等大型儀器即可完成，其利用氨基酸兩性電解質(zhì)的特性，常溫下，過(guò)量甲醛可迅速與氨基酸的氨基端結(jié)合生成羥甲基化合物，導(dǎo)致反應(yīng)平衡右移，使溶液的酸度增加，通過(guò)堿滴定即可計(jì)算游離氨基酸含量（王斯維等，2019）。對(duì)于甲醛滴定法、茚三酮和色譜法測(cè)得的游離氨基酸含量間是否存在差異，需進(jìn)一步探究。

3.3 茶葉寡肽研究

一直以來(lái)，茶葉化學(xué)對(duì)茶湯中水溶性蛋白質(zhì)作用的認(rèn)識(shí)較模糊，僅一般性地認(rèn)為其與滋味的醇厚度密切相關(guān)。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中通過(guò)高分辨質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)白茶加工過(guò)程中的寡肽變化進(jìn)行了較系統(tǒng)研究（Zhao et al.，2019），證實(shí)了茶葉中寡肽的存在。通過(guò)本研究構(gòu)建的茶葉寡肽含量測(cè)定理化方法，測(cè)得茶葉中寡肽含量為3.00%~5.00%，該結(jié)果說(shuō)明除大分子水溶性蛋白質(zhì)外，寡肽也是茶葉中水溶性肽的重要存在形式。

茶葉中的寡肽含量不低，但之前未被重視。一方面是以往多通過(guò)考馬斯亮藍(lán)顯色法測(cè)定茶葉的水溶性蛋白質(zhì)總量，而考馬斯藍(lán)G-250雖然能很好地與大分子水溶性蛋白質(zhì)絡(luò)合顯色，但對(duì)低分子量寡肽的結(jié)合能力差，無(wú)法通過(guò)紫外光譜法直接測(cè)定寡肽含量；另一方面，寡肽含量雖不低，但種類(lèi)繁多，化學(xué)性質(zhì)接近，單一寡肽的絕對(duì)含量有限，尤其是其極性接近游離氨基酸，而傳統(tǒng)的研究手段需通過(guò)分離制備獲取純品后才能開(kāi)展后續(xù)工作，極大地制約了寡肽研究。但當(dāng)前食品滋味肽和生物活性肽的發(fā)展極其迅速，對(duì)茶葉肽開(kāi)展系統(tǒng)性研究，將有助于從全新的角度探究茶葉保健功效和風(fēng)味品質(zhì)構(gòu)成機(jī)理。

對(duì)于不同茶類(lèi)中寡肽的含量變化，以粗老原料加工的黑茶，其寡肽含量接近鮮嫩原料加工的綠茶。說(shuō)明除了原料的嫩度，加工工藝會(huì)對(duì)茶葉的寡肽有明顯影響。雖然原料粗老的黑茶總蛋白質(zhì)含量和游離氨基酸含量不高，但寡肽含量較高，可能是后發(fā)酵過(guò)程中，由于外源微生物的作用，茶葉中原有的非水溶性大分子蛋白質(zhì)被降解為水溶性較好的小分子肽段。該結(jié)果可為黑茶的保健功效研究提供全新思路。

烏龍茶的寡肽含量最低，推測(cè)除了受原料嫩度的影響，烏龍茶的焙火工藝也會(huì)造成其寡肽含量偏低。焙火是烏龍茶精制中的重要工序，在該過(guò)程中，茶葉中所含氨基酸類(lèi)與還原糖類(lèi)物質(zhì)加溫后會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，賦予烏龍茶特殊的風(fēng)味（江山等，2012；王麗等，2020）。從化學(xué)性質(zhì)上看，寡肽的化學(xué)性質(zhì)與氨基酸接近，因此，經(jīng)焙火后，寡肽與氨基酸一樣，也會(huì)與還原糖類(lèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成風(fēng)味物質(zhì)，由此導(dǎo)致其含量下降。之前由于茶葉中寡肽含量和具體種類(lèi)尚不明確，故未見(jiàn)關(guān)于茶葉寡肽及其相關(guān)美拉德反應(yīng)生成物對(duì)茶葉品質(zhì)影響的報(bào)道，本研究結(jié)果可為烏龍茶風(fēng)味品質(zhì)形成的相關(guān)研究提供新的切入點(diǎn)。

本研究所使用的紅茶是按照傳統(tǒng)采摘標(biāo)準(zhǔn)及加工工藝而制備的樣品，故其鮮葉為達(dá)到一定成熟度的原料，其游離氨基酸含量和寡肽含量不低，說(shuō)明在紅茶的加工過(guò)程中，茶葉原有的內(nèi)源酶極可能參與大分子蛋白質(zhì)的降解過(guò)程。目前的數(shù)據(jù)雖然尚不充分，但可為紅茶加工過(guò)程的大分子蛋白質(zhì)降解及其對(duì)風(fēng)味品質(zhì)的作用研究提供參考。

本研究結(jié)果顯示，白茶、黃茶和綠茶的寡肽含量均較高且較接近。從原料角度分析，這三類(lèi)茶對(duì)原料嫩度的要求較接近。目前難以推斷萎凋、悶黃、炒青等工藝對(duì)寡肽含量的具體影響趨勢(shì)，下一步可有針對(duì)性地開(kāi)展研究。

4 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化提取方法，得到適合茶葉寡肽定量分析的方法，且通過(guò)對(duì)比不同茶類(lèi)的寡肽含量，推測(cè)茶葉的鮮嫩度、不同加工過(guò)程和焙火方式影響茶葉寡肽的積累。