鄭燕燕，顏利，郝吉福，何玉靜

［山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院/先進(jìn)藥物遞送系統(tǒng)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 271000］

維A 酸（retinoic acid，RA）屬于維生素A 類化合物，用于治療尋常痤瘡、扁平苔蘚、白斑、老年性皮膚萎縮等，也作為銀屑病的輔助治療藥物，被稱為皮膚科治療學(xué)的“第三個(gè)里程碑”[1-2]。該化合物含有多共軛雙鍵的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性差，對光熱極為敏感，易氧化和異構(gòu)化失效，對皮膚有強(qiáng)烈的刺激性[3]。維A 酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和不良反應(yīng)對常用的維A 酸外用制劑造成局限，如維A 酸軟膏劑、霜劑、凝膠等制劑中維A 酸易氧化失效且生物利用度較低[4]。

脂質(zhì)體（liposomes）是指藥物被類脂雙分子層包封成的微小囊泡，對藥物的包封效果較好，具有良好的生物相容性，能夠有效增加藥物的透皮吸收[5]。與傳統(tǒng)劑型相比，脂質(zhì)體具有靶向性、高效長效、降低藥物不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是皮膚外用藥物的理想載體[6-7]。乳膏劑系指原料藥物溶解或分散于乳狀液型基質(zhì)中形成的均勻半固體制劑。乳膏劑中乳化劑的表面活性作用使其對油、水均具有一定親和力，既不影響皮膚表面分泌物的分泌，也不影響水分蒸發(fā)，為皮膚病治療的常用外用制劑[8]。將維A 酸包封于脂質(zhì)體內(nèi)可減輕皮膚刺激性，提高透皮吸收速率和生物利用度。本研究擬將維A 酸制成脂質(zhì)體后再制作成乳膏劑，旨在為維A 酸用于皮膚病的治療提供新的方法[9]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA1104N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；UV-1800PC 型紫外可見分光光度計(jì)[翱藝儀器（上海）有限公司]；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SHC-2 型智能數(shù)顯恒溫水浴鍋（鞏義市英欲高科儀器廠）；JY92-2D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；RYJ-6B 型藥物透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

維A酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，上海麥克林生化科技有限公司）；膽固醇（CH，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；卵磷脂（SPC，石家莊寧諾商貿(mào)有限公司）；透析袋（北京索萊寶科技有限公司）；液體石蠟（純度：化學(xué)純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

雄性SPF 級健康昆明小鼠，體質(zhì)量（22±5）g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20220006。所有動物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為202004038。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取維A 酸1.02 mg，置于10 mL 容量瓶中加入異丙醇至刻度，所得溶液移至50 mL 容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，得到20 μg/mL 的維A 酸溶液，精密量取該溶液加入甲醇最終稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.5 μg/mL 的系列溶液，紫外分光光度法分別測定其在350 nm 處吸光度值，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.135 5x-0.020 9，R2=0.999 9。

2.2 維A酸脂質(zhì)體的制備

參考文獻(xiàn)[10]采用乙醇注入法制備維A 酸脂質(zhì)體：精密稱取CH、SPC、維A 酸，于適量無水乙醇中超聲使其充分溶解；配制pH=6.5 的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為水合介質(zhì)；取適量水合介質(zhì)置于磁力攪拌器上，在一定水浴溫度下攪拌，轉(zhuǎn)速350 r/min，用5 mL 注射器吸取脂質(zhì)溶液將其緩慢勻速地注入到水合介質(zhì)中，繼續(xù)恒溫?cái)嚢? h，使乙醇完全揮發(fā)即得。

2.3 包封率和載藥量測定

采用透析法測定包封率和載藥量[11]。精密吸取維A 酸脂質(zhì)體混懸液2 mL 于透析袋中密封，置于100 mL 純水中透析6 h，分別于0.5、2、4 h 更換透析介質(zhì)。精密量取未經(jīng)透析的脂質(zhì)體混懸液和透析后的脂質(zhì)體混懸液各0.5 mL，分別加入甲醇破乳，紫外分光光度法測得維A 酸藥物總量和脂質(zhì)體包封維A酸的量。按以下公式計(jì)算包封率和載藥量：

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)篩選維A酸脂質(zhì)體制備處方工藝

2.4.1 SPC 質(zhì)量濃度的影響 固定其他因素不變，改變SPC 投藥量，使SPC 質(zhì)量濃度分別為4、8、16、32、64 mg/mL，考察包封率和載藥量隨SPC 質(zhì)量濃度變化的情況，結(jié)果見圖1?？梢?，維A 酸的包封率和載藥量均受SPC 質(zhì)量濃度的影響，當(dāng)SPC 質(zhì)量濃度為32 mg/mL時(shí)，包封率和載藥量最高。

圖1 SPC質(zhì)量濃度對包封率和載藥量的影響Figure 1 The effect of SPC mass concentration on encapsulation rate and drug loading capacity

2.4.2 SPC 與CH 質(zhì)量比的影響 固定其他因素不變，改變SPC 與CH 投藥量的比值（SPC∶CH），使SPC∶CH 分別為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（質(zhì)量比，下同），考察包封率和載藥量隨SPC∶CH 變化的情況，結(jié)果見圖2。可見，維A 酸的包封率和載藥量均受SPC∶CH 質(zhì)量比的影響，當(dāng)SPC∶CH=4∶1 時(shí)，包封率和載藥量最高。

圖2 SPC∶CH比值對包封率和載藥量的影響Figure 2 The effect of SPC：CH ratio on encapsulation rate and drug loading capacity

2.4.3 維A 酸與脂質(zhì)（SPC+CH）的質(zhì)量比（藥脂比）的影響 固定其他因素不變，改變藥脂比的比值，使藥脂比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，考察包封率和載藥量隨藥脂比變化的情況，見圖3。可見，維A 酸的包封率和載藥量均受藥脂比的影響，當(dāng)藥脂比為1∶20 時(shí)包封率最高，藥脂比1∶10 時(shí)載藥量最高。

圖3 藥脂比對包封率和載藥量的影響Figure 3 The effect of drug lipid ratio on encapsulation rate and drug loading capacity

2.4.4 水浴溫度的影響 固定其他因素不變，改變水浴溫度，使水浴溫度分別為45、50、55、60、65 ℃，考察包封率和載藥量隨水浴溫度變化的情況，結(jié)果見圖4?？梢?，維A 酸的包封率和載藥量均受水浴溫度影響，當(dāng)水浴溫度為60 ℃時(shí)，包封率和載藥量最高。

圖4 水浴溫度對包封率和載藥量的影響Figure 4 The effect of water bath temperature on encapsulation rate and drug loading capacity

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化維A酸脂質(zhì)體的制備工藝

2.5.1 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，以SPC 濃度（A）、SPC∶CH（B）、藥脂比（C）、水浴溫度（D）為4 個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3 個(gè)不同水平（見表1），以包封率比重30%和載藥量比重70%為綜合評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行考察，以L9（34）正交實(shí)驗(yàn)法篩選最佳制備工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

2.5.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，結(jié)果表明各因素對綜合評價(jià)指標(biāo)的影響效果依次為C>A>B>D，確定最優(yōu)制備工藝為A1B3C3D3，即SPC 質(zhì)量濃度為16 mg/mL，SPC∶CH=5∶1，藥脂比=1∶40，水浴溫度60 ℃。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.5.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按“2.5.2”項(xiàng)篩選的最優(yōu)制備工藝制備3 批維A 酸脂質(zhì)體，按“2.3”項(xiàng)方法測定包封率和載藥量，結(jié)果顯示包封率為（89.27±1.12）%（n=3），載藥量為（2.30±0.53）%（n=3），表明篩選的最優(yōu)制備工藝穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好。

2.6 維A酸脂質(zhì)體的質(zhì)量評價(jià)

維A 酸脂質(zhì)體混懸液呈現(xiàn)均勻淡黃色，具有明顯的丁達(dá)爾效應(yīng)（見圖5），平均粒徑為（154.6±2.5）nm，PDI 為（0.171±0.028），Zeta 電位（-37.7±0.59）mV，pH=6.3，脂質(zhì)體在4、25 ℃條件下粒徑和PDI變化見圖6?？梢姡胶蚉DI 變化較小，所得脂質(zhì)體在4 ℃和25 ℃條件下穩(wěn)定性良好。

圖5 維A酸脂質(zhì)體混懸液的外觀及丁達(dá)爾效應(yīng)Figure 5 Appearance and Dingdall effect of retinoic acid liposome suspension

圖6 維A酸脂質(zhì)體的粒徑和PDI值Figure 6 Particle size and PDI value of retinoic acid liposomes

2.7 維A酸脂質(zhì)體乳膏的制備

維A 酸脂質(zhì)體乳膏采用乳化法制備[12]，取硬脂醇、白凡士林、液體石蠟加熱至80 ℃熔化為油相，將甘油及純化水加熱至80 ℃，再加入十二烷基硫酸鈉溶解為水相。然后將水相緩緩加入油相中，邊加邊攪拌，直至冷凝，即得乳劑型基質(zhì)。取5 mL 以最佳制備工藝制得的維A 酸脂質(zhì)體加入上述基質(zhì)中，攪拌均勻即得。

2.8 維A酸脂質(zhì)體乳膏的質(zhì)量評價(jià)

從圖7 可見，維A 酸乳膏色澤均勻、質(zhì)地細(xì)膩、無污物，易涂于皮膚，無粗糙感和顆粒感。

圖7 維A酸脂質(zhì)體乳膏外觀性狀Figure 7 Appearance characteristics of retinoic acid liposome cream

小鼠腹部脫毛處理24 h 后對照組涂布生理鹽水，給藥組涂布維A 酸脂質(zhì)體乳膏，進(jìn)行皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)。48 h 內(nèi)小鼠皮膚表面均未見紅腫，未出現(xiàn)過敏現(xiàn)象，結(jié)果見圖8。

圖8 小鼠皮膚過敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 8 Results of skin allergy experiment in mice

2.9 體外經(jīng)皮滲透速率的測定

2.9.1 離體鼠皮的制備 先用剃毛刀剔去小鼠腹部的毛，再用脫毛膏除去殘留碎毛，用濕棉球擦洗干凈，正常喂養(yǎng)24 h 后將小鼠脫臼處死，將腹部皮膚剝下，并刮除皮下脂肪組織及粘連物，檢查皮膚完整性，用生理鹽水反復(fù)沖洗。

2.9.2 體外透皮試驗(yàn) 將小鼠皮膚角質(zhì)層面向給藥池，真皮層面向接收池固定在Franz 擴(kuò)散池兩半池之間，接收池中加入異丙醇-pH7.4 PBS 溶液（體積比3∶7）混合溶液作為接收介質(zhì)，排凈氣泡，給藥池中加入制得的維A 酸脂質(zhì)體乳膏，溫度34 ℃，攪拌速度300 r/min，置于透皮擴(kuò)散儀中，于0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h 取出接收液5 mL，立即補(bǔ)加相同體積的接收液。取出的接收液用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液測定維A 酸濃度。按以下公式計(jì)算藥物的累積滲透量（Qn）：

式中：Qn為藥物的累積滲透量；V為接受池總體積（7 mL）；Cn為第n次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度；Ci為第n-1 次取樣時(shí)所檢測到的藥物的質(zhì)量濃度；Vi為取樣體積；A為有效擴(kuò)散面積（0.785 cm2）。以藥物累積滲透量（Qn）對取樣時(shí)間（t）進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，并對曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求得直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js[13]。

2.9.3 體外透皮試驗(yàn)結(jié)果 體外經(jīng)皮滲透速率曲線如圖9 所示，結(jié)果顯示維A 酸脂質(zhì)體乳膏的滲透速率和24 h 累積滲透量均高于普通維A 酸乳膏。維A 酸脂質(zhì)體平均透皮滲速率為（0.655 8±0.031 9）（μg·h）/cm2，高于普通維A酸乳膏[（0.442 7±0.034 5）（μg·h）/cm2]；維A 酸脂質(zhì)體乳膏24 h 累積滲透量為（17.18±1.96）μg/cm2，高于普通維A 酸乳膏[（8.964 6±0.394 2）μg/cm2]。

圖9 透皮吸收曲線圖Figure 9 The transdermal absorption curves

3 討論

本文采用乙醇注入法制備脂質(zhì)體，以包封率和載藥量作為評價(jià)指標(biāo)篩選了最優(yōu)處方。將以最優(yōu)處方制備的維A 酸脂質(zhì)體制備成乳膏并考察了其體外透皮滲透速率。結(jié)果表明，維A 酸脂質(zhì)體乳膏的滲透速率和24 h 累計(jì)滲透量均高于普通維A 酸乳膏，借助脂質(zhì)體較好的生物相容性，可提高維A酸的透皮吸收速率和生物利用度。本研究解決了以往研究中藥物聯(lián)用或復(fù)合乳膏難以實(shí)現(xiàn)劑量調(diào)整和個(gè)體化用藥的問題[14]，與逆向蒸發(fā)法和醋酸鈣梯度法制備相比，乙醇注入法制備工藝更加簡便，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

在維A 酸脂質(zhì)體的制備過程中，乙醇注入應(yīng)緩慢進(jìn)行以保證藥液能夠均勻分散在PBS 注入介質(zhì)中，避免藥物大量聚集析出，以保證制得的脂質(zhì)體粒徑較小且均勻。維A 酸穩(wěn)定性差，易氧化異構(gòu)化，因此實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)盡量避光且水浴溫度不宜過高。在制備乳膏時(shí)，本文采用等量遞加法將維A 酸脂質(zhì)體加入到乳膏基質(zhì)中以保證混合均勻[15]。體外透皮實(shí)驗(yàn)雖然能夠直觀地評價(jià)藥物的透過量，但在體外透皮滲透速率的測定中，皮膚的來源和完整性以及接收介質(zhì)的極性和pH 值等因素均會影響最終結(jié)果。一直以來嚙齒類動物皮膚應(yīng)用最為廣泛。此外，接收介質(zhì)的用量應(yīng)盡可能達(dá)到“漏槽條件”。但受到接收池容積和藥物溶解度的限制，常用吸收介質(zhì)生理鹽水和PBS 很難達(dá)到漏槽條件，故常加入一定比例的乙醇、異丙醇等有機(jī)溶劑[16]。

本文提供了一種維A 酸應(yīng)用的新思路，即維A酸脂質(zhì)體乳膏。但若要作為上市成品投入使用還應(yīng)該加入保濕劑維持乳膏的濕度，并通過失水率的測定進(jìn)行乳膏劑處方優(yōu)化，篩選出保濕劑的最佳用量。對于乳膏的黏度、長期穩(wěn)定性以及貯藏條件的探索也需要進(jìn)一步探索。