陳孟權(quán)，單婷婷，黃蕊，孔萬仲

1.溫州市中醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院，浙江 杭州 310053

據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）和中華醫(yī)學(xué)會(huì)男性不育癥診療指南規(guī)定，夫婦雙方未采用任何避孕措施同居生活1年以上，其中男方因素導(dǎo)致女方不孕者，稱為男性不育癥。近年來由于環(huán)境污染嚴(yán)重、生活壓力大、飲食習(xí)慣不良和生活習(xí)慣變化等多因素共同作用，因不孕不育就診的患者逐年增加，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球有10%～15%的育齡夫婦存在不孕不育問題，甚至一些發(fā)展中國家的某些地區(qū)可高達(dá)30%，其中男性因素導(dǎo)致不育的占50%[1-3]。男性不育癥患者較為常見的臨床表現(xiàn)主要是弱精癥，即經(jīng)精液常規(guī)檢查主要表現(xiàn)為精子前向運(yùn)動(dòng)百分率＜32%或精子總活力＜40%[4]。

線粒體作為精子細(xì)胞中唯一的細(xì)胞器，在氧化磷酸化、細(xì)胞生長(zhǎng)、信息傳遞和遺傳等生理過程中均發(fā)揮重要的作用，其主要分布在精子尾部中段，為精子運(yùn)動(dòng)和功能提供能量保障。線粒體DNA（mtDNA） 作為線粒體的獨(dú)立遺傳物質(zhì)，存在于線粒體內(nèi)膜和基質(zhì)內(nèi)，是一條全長(zhǎng)為16 569 bp的環(huán)狀閉合雙鏈DNA分子，負(fù)責(zé)編碼37個(gè)基因，包括22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）以及13個(gè)組成呼吸鏈復(fù)合體部分亞基的多肽基因[5-7]。mtDNA由于缺乏組蛋白保護(hù)及完整有效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，容易受到活性氧（reactive oxygen species, ROS）及其他自由基的損傷，導(dǎo)致其突變率相比核基因組高出10～100倍[8-11]。

D-Loop區(qū)是mtDNA的非編碼區(qū)域，包含了mtDNA輕重鏈轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和重鏈復(fù)制起始點(diǎn)，在mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[12]。D-Loop區(qū)中存在高突變區(qū)域（hypervariable region）[13]，其高頻率的突變可能引起mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄功能出現(xiàn)異常，造成mtDNA數(shù)量減少、呼吸鏈相關(guān)蛋白和ATP合成不足以及線粒體功能障礙等，使得精子獲能不足、動(dòng)力下降等，最終將導(dǎo)致弱精癥[14]。本研究將通過對(duì)弱精癥患者精子mtDNA的D-Loop區(qū)基因進(jìn)行測(cè)序，分析其基因變異類型和變異頻率的差異，探討精子mtDNA D-Loop區(qū)基因突變和弱精癥的相關(guān)性及其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年7月至2021年3月溫州市中醫(yī)院診治的男性不育癥患者134例，年齡23～42歲，平均年齡33歲，有1年以上不育史，精液常規(guī)分析提示精子前向運(yùn)動(dòng)率＜32%，符合第五版《WHO人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中弱精癥的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且其配偶的婦產(chǎn)科相關(guān)檢查均正常。同時(shí)選取129例因女性不孕就診的健康男性精液作為對(duì)照組，年齡22～40歲，平均年齡32歲，精液常規(guī)等檢查結(jié)果均正常。

全部研究對(duì)象留取樣本時(shí)均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①禁欲時(shí)間為2～7 d；②無泌尿系統(tǒng)感染史、附睪炎病史、睪丸損傷史、精索靜脈曲張治療史及相關(guān)性腺器官發(fā)育異常史；③常規(guī)精液檢測(cè)相關(guān)參數(shù)均齊全；④符合本研究相關(guān)入組標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)溫州市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（WTCM-KT-2021045），所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 精液基因組DNA提?。壕簶颖窘?jīng)離心后收集精子細(xì)胞層，采用基因組DNA提取試劑盒[購于天根生化科技（北京）有限公司]提取精子總DNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 引物合成及PCR擴(kuò)增：根據(jù)已報(bào)道的mtDNA D-Loop區(qū)引物序列[12]，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，見表1。按要求配置20 μL的PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保存，產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）確 認(rèn)。

表1 mtDNA D-Loop區(qū)擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析：將PCR產(chǎn)物送尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，所有樣本采用雙向重復(fù)測(cè)序，保證測(cè)序的準(zhǔn)確性。以劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列（rCRS）為參照，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，查找突變位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組精子細(xì)胞mtDNA D-Loop區(qū)突變情況 通過對(duì)弱精癥組（n=134）和對(duì)照組（n=129）的D-Loop區(qū)進(jìn)行測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)247種突變，其中弱精癥組患者精子細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)178種，對(duì)照組精子細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)182 種，兩組顯示出相近的單核苷酸多態(tài)性（SNP） （2 232/134=16.66，2 259/129=17.51）。有62種突變的發(fā)生率＞5%，其中大多在HV-1區(qū)（55.31%）和HV-2區(qū)（32.47%）。D-Loop區(qū)域的4個(gè)新突變均為核苷酸缺失突變，見圖1、表2。

圖1 4種新突變的測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖

表2 4個(gè)D-Loop區(qū)域的新突變位點(diǎn)[例（%）]

2.2 兩組精子細(xì)胞mtDNA D-Loop區(qū)突變的差異性分析 對(duì)發(fā)生率＞5%的62種突變的分析顯示，突變以替換突變?yōu)橹鳎?7.03%），其中替換突變54個(gè)，缺失突變5個(gè)，插入突變3個(gè)，且替換突變數(shù)量與其他兩種突變的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；替換突變大多為T＞C（42.2%）、A＞G（23.03%）以及C＞T（22.78%）等，且不同替換類型在兩組間的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.389），見圖2。本研究發(fā)現(xiàn)有11種突變?cè)趦山M間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

圖2 兩組間不同類型替換突變的差異

表3 兩組精子細(xì)胞mtDNA D-Loop區(qū)突變分析[例（%）]

2.3 弱精癥患者精子活動(dòng)力水平與mtDNA D-Loop區(qū)突變的關(guān)系 根據(jù)精子細(xì)胞前向運(yùn)動(dòng)百分率將弱精癥患者分為輕度68例（20%～32%）、中度48例（10%～20%）及重度18 例（＜10%），其中mtDNA DLoop區(qū)基因突變發(fā)生率＞5%的有92種，分析發(fā)現(xiàn)有4種突變?cè)诓煌瑖?yán)重程度的弱精癥患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 不同嚴(yán)重程度弱精癥患者精子細(xì)胞mtDNA D-Loop區(qū)突變分析[例（%）]

3 討論

臨床上男性不育大多表現(xiàn)為弱精癥，即精子前向運(yùn)動(dòng)力減弱，從而引起不孕不育。作為細(xì)胞“動(dòng)力工廠”的線粒體，是精子細(xì)胞的重要能量來源，若線粒體功能發(fā)生障礙，將影響精子細(xì)胞正常的生命活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)能力[15]。mtDNA由于其特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)而具有較高的突變率[16]，尤其作為mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的D-Loop區(qū)，不僅包含了H鏈、L鏈轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和H鏈復(fù)制起始點(diǎn)，還存在兩個(gè)極具不穩(wěn)定性的高突變區(qū)域（HV-1、HV-2），這些區(qū)域的高頻突變可能導(dǎo)致復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等功能紊亂[16-19]。

本研究結(jié)果顯示所有研究對(duì)象在D-Loop區(qū)均有不同程度的突變，發(fā)生率＞5%的突變有62 種，其中位于HV-1區(qū)（55.31%）的突變明顯多于HV-2區(qū)（32.47%），替換突變數(shù)量（87.03%）明顯高于其他突變類型，替換突變中以T＞C占比最大（42.2%），其次為A＞G（23.03%）和C＞T（22.78%），同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)未見報(bào)道過的新突變。

此前，已有多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)mtDNA D-Loop區(qū)在各類腫瘤、慢性肝腎疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病中表現(xiàn)出高突變率。SULTANA等[20]提出D-Loop區(qū)突變可能抑制電子傳遞鏈的進(jìn)行，造成高水平ROS釋放堆積，是腫瘤的誘發(fā)劑及啟動(dòng)劑。DRAGONI等[21]發(fā)現(xiàn)腦部病變時(shí)D-Loop區(qū)的甲基化水平明顯增高。ALTAFI等[22]通過比較腦腫瘤組織及其相鄰組織的mtDNA序列，發(fā)現(xiàn)兩者D-Loop區(qū)突變存在明顯差異。WANG等[23]研究發(fā)現(xiàn)mtDNA D-Loop區(qū)突變與胃腸道腫瘤進(jìn)展存在相關(guān)性。位于D310區(qū)的微衛(wèi)星序列，表現(xiàn)為多聚C單核苷酸重復(fù)序列，目前已被證實(shí)與乳腺癌有關(guān)[24-25]。研究[26-29]顯示mtDNA D-Loop區(qū)突變與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病年齡、慢性腎功能衰竭、潰瘍性結(jié)腸炎以及喉癌之間均存在相關(guān)性。這些研究表明，D-Loop區(qū)突變的積累可能導(dǎo)致呼吸鏈環(huán)節(jié)發(fā)生異常，ROS大量堆積，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷和疾病發(fā)生[12]。

有不少研究報(bào)道弱精癥患者存在mtDNA拷貝數(shù)異常[30-32]和大片段缺失現(xiàn)象[33-34]，本課題組前期研究[35]提示弱精癥組mtDNA拷貝數(shù)降低，但未發(fā)現(xiàn)大片段缺失，而D-Loop區(qū)與mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄過程息息相關(guān)，在弱精癥相關(guān)研究中卻較少被提及，在弱精癥發(fā)生發(fā)展過程中的表現(xiàn)和作用亦不明確。本研究通過分析發(fā)現(xiàn)，有11種突變?cè)谌蹙Y患者和對(duì)照組之間存在顯著性差異，其中T16172C、CAA16179C、C16257A、C16261T、T16304C可能會(huì)增加弱精癥風(fēng)險(xiǎn)，而CA16179C、A16182C、A16183C、A16230G、T16249C、G16319A則相反。此前有報(bào)道T16172C和A16183C在子宮內(nèi)膜異位癥中亦呈現(xiàn)相同的表現(xiàn)[36]， T16304C與卵巢癌發(fā)病年齡有關(guān)[37]，C16179T與精子活力和濃度下降顯著相關(guān)[38]，本研究中CAA16179C、CA16179C、A16182C和A16183C在弱精癥患者中均有顯著差異，可能與緊鄰16184-16193的微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)（C5TC4）有關(guān)，這些突變可能造成該微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的多胞嘧啶單核苷酸重復(fù)模式改變，增加其不穩(wěn)定性。C16257A和C16261T作為弱精癥的風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)也被報(bào)道參與組成漢族人群II型糖尿病和中重癥新冠肺炎的風(fēng)險(xiǎn)因素（G5417A/C16257A/C16261T），參與ROS堆積和線粒體破壞[39-40]。此外，本研究通過比較發(fā)現(xiàn)4種突變?cè)诓煌潭热蹙Y之間存在顯著性差異，其中T16140C、C16291T可能是弱精癥患者精子活力進(jìn)一步下降的風(fēng)險(xiǎn)因素，T16092C和T16311C則可能是弱精癥患者病情進(jìn)展的保護(hù)性因素，需要進(jìn)一步研究明確其相關(guān)性。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，弱精癥患者精子細(xì)胞mtDNA D-Loop區(qū)存在顯著差異，可能在弱精癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，對(duì)弱精癥的臨床診療具有一定提示意義，同時(shí)也為線粒體DNA點(diǎn)突變?cè)谌蹙Y機(jī)制研究方面提供新的思路和證據(jù)。