王 曦，肖 康，劉文斌，戴永軍，郭慧星，汪茫茫，李向飛，張定東，蔣廣震

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇省水產(chǎn)營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

脂肪酸是魚類重要的結(jié)構(gòu)與能源物質(zhì)，同時(shí)還承擔(dān)了機(jī)體內(nèi)重要的生物學(xué)作用與生理學(xué)調(diào)控[1]。根據(jù)碳鏈長度，可分為短鏈、中鏈和長鏈脂肪酸3 類[2]。丁酸是極具代表性的短鏈脂肪酸之一，對改善動(dòng)物腸道微生物菌群及腸道組織結(jié)構(gòu)具有重要意義[3]。辛酸在椰子油中含量豐富，是較為理想的能源物質(zhì)[4]，在畜牧生產(chǎn)中常用作親本培育，以提高親代成活率。棕櫚酸分布廣泛，幾乎在所有植物油和動(dòng)物脂肪中均含有數(shù)量不等的組分，適量棕櫚酸能起到調(diào)控血清膽固醇含量的作用[5]。迄今，不同脂肪酸類型對魚類脂肪代謝和腸道菌群的影響已有廣泛研究，然而脂肪酸碳鏈長度對魚體肌纖維發(fā)育和肉質(zhì)影響的研究仍較為缺乏[6]。

肌肉組織是魚類的主要可食部分[7]，占胴體重的70%～80%。魚肉品質(zhì)包括質(zhì)地特性和營養(yǎng)品質(zhì)，直接與消費(fèi)者的接受程度掛鉤[8]。其中，魚類肌纖維的生長特性直接影響魚肉的質(zhì)地特性。質(zhì)地特性包括硬度、黏附性、彈性、咀嚼性等，是通過模擬感官特性評價(jià)魚肉口感的重要加工品質(zhì)指標(biāo)[9]，由其內(nèi)部成分及組織結(jié)構(gòu)決定。同時(shí)，魚肉的營養(yǎng)品質(zhì)與飼料營養(yǎng)密切相關(guān)，通過飼料原料比例的調(diào)節(jié)或微量營養(yǎng)素的添加，可以針對性地調(diào)控魚類肌纖維發(fā)育及營養(yǎng)組成[10]。研究表明，不同脂肪源飼料可以顯著影響魚體成分[11]，魚肉中脂肪酸組成及含量與飼料脂肪酸組成緊密相關(guān)。

隨著人們生活水平的提高和供給則改革的推進(jìn)，消費(fèi)者對水產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)注日益重視。團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)隸屬鯉科(Cyprinidae)魴屬(Megalobrama)。因生長速率快、產(chǎn)肉率高、肉質(zhì)風(fēng)味好，被作為一種較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值魚類在長江中下游水體中廣泛養(yǎng)殖[12]。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究飼料脂肪酸類型對魚體肌纖維生長發(fā)育的影響，并探究飼料脂肪酸通過沉積調(diào)控團(tuán)頭魴肉質(zhì)品質(zhì)的分子機(jī)制。以期為養(yǎng)殖魚類品質(zhì)調(diào)控提供理論依據(jù)，也為魚類肌肉品質(zhì)的營養(yǎng)強(qiáng)化提供全新模式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼料配方

實(shí)驗(yàn)參照任陽[13]的方法，設(shè)置對照、丁酸(C4H8O2,BA)、辛 酸(C8H16O2,OA)及棕櫚酸(C16H32O2,PA) 4 組，每組飼料配方根據(jù)團(tuán)頭魴基本營養(yǎng)需求設(shè)計(jì)為31%粗蛋白和6%粗脂肪，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組飼料中分別以BA、OA 及PA 替代1.5%豆油，其余飼料成分均保持一致。各原料均由江蘇省泰州市海普瑞飼料有限公司提供，經(jīng)由充分粉碎、冷卻、過80 目篩后遵從“先小后大”原則逐級混勻，參照表1 所示具體配方擠壓制粒(粒徑2 mm，長度8 mm)。常溫風(fēng)干，待完全干燥后密封貯藏于-20 ℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)飼料脂肪酸組成見表2。

表1 團(tuán)頭魴飼料配方表(干物質(zhì))Tab.1 Formulation of the experimental diets of M. amblycephala (dry matter) %

表2 飼料脂肪酸組成分析Tab.2 Fatty acid composition of the experimental diets g/kg

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及養(yǎng)殖條件

養(yǎng)殖全程在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)教學(xué)科研基地的開闊池塘中展開，確保模擬團(tuán)頭魴正常的生態(tài)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)用魚均由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心提供，取108 尾體質(zhì)健康、規(guī)格相近的個(gè)體[平均初始體重(77.89±0.81) g]，隨機(jī)分配于12 個(gè)尺寸為2 m×1 m×1 m (長×寬×高)的懸浮網(wǎng)箱。每組飼料設(shè)置3 個(gè)平行，每網(wǎng)箱9 尾。

歷經(jīng)2 周暫養(yǎng)，在此期間所有實(shí)驗(yàn)用魚以商業(yè)飼料(無錫通威飼料集團(tuán)有限公司)進(jìn)行初始馴化，使其更好地適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)培養(yǎng)其定時(shí)定點(diǎn)上浮采食的習(xí)慣。正式實(shí)驗(yàn)期間，以團(tuán)頭魴自由采食達(dá)到飽腹?fàn)顟B(tài)為準(zhǔn)，具體投餌量視天氣、水溫、進(jìn)食情況等因素而定，一日3 次定時(shí)定點(diǎn)手動(dòng)投喂(8:00,12:00,16:00)。養(yǎng)殖全程水體環(huán)境pH 值為7.4～7.6，溶解氧含量為5.0 mg/L，水溫28～34 ℃，氨氮濃度低于0.2 mg/L。本實(shí)驗(yàn)所有操作嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安全審查規(guī)范，并按照水產(chǎn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.3 樣品采集

實(shí)驗(yàn)為期57 d。養(yǎng)殖結(jié)束，停飼24 h 后對各網(wǎng)箱中團(tuán)頭魴尾數(shù)和總重量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每網(wǎng)箱隨機(jī)選取3 尾體格相當(dāng)?shù)膱F(tuán)頭魴，通過注射MS-222(100 mg/L,Sigma,美國)麻醉。解剖取內(nèi)臟團(tuán)稱重，以便胴體率和臟體比指標(biāo)的計(jì)算。緊接著刮去側(cè)線上方鱗片且剝?nèi)◆~皮，采集背肌樣品于液氮速凍，用于基因表達(dá)分析；另取3 塊背肌組織，1塊(0.5 cm×0.5 cm×2 cm)固定于4%多聚甲醛溶液用于組織形態(tài)分析，1 塊(1 mm×2 mm×3 mm)固定于2.5%戊二醛溶液用于超微結(jié)構(gòu)分析，1 塊(1 cm3)立方體鮮樣4 ℃保鮮用于24 h 內(nèi)質(zhì)構(gòu)分析。

1.4 測定指標(biāo)

生長指標(biāo) 相關(guān)指標(biāo)測定見以下公式。

特定生長率(SGR,%/d)=(lnWt-lnW0)/t×100%

增重率(WGR,%)=(Wt-W0)/W0×100%

飼料系數(shù)(FCR)=攝食量/(Wt-W0)

平均日采食量(AFI,g/尾)=日總采食量/總條數(shù)

胴體率(DP,%)=(Wt-Wi)/W×100%

臟體比(VSI,%)=Wi/W×100%

式中，Wt代表終末體重(g)，W0代表初始體重(g)，Wi代表終末魚體內(nèi)臟團(tuán)重(g)，W代表全魚體重(g)，t代表實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

飼料成分測定 參照AOAC 方法[14]檢測并分析了飼料常規(guī)成分。水分測定采用105 ℃烘干法；粗脂肪測定采用乙醚索式提取法；粗蛋白測定采用凱氏定氮法；粗灰分測定采用550 ℃灼燒法。

1.5 肌肉質(zhì)構(gòu)

引入一系列肌肉在變形、分解、流動(dòng)等方面的物理特性對魚肉口感、組織狀態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確評估。參考Hixson 等[15]對肌肉品質(zhì)測定參數(shù)的設(shè)定，將采集樣品置于50 mm 鋁板，通過質(zhì)構(gòu)儀(TA.XT Plus,Stable Micro Systems,英國)以5 mm/s 預(yù)測試速度、1 mm/L 測試速度和5 mm/s 后測試速度，肌肉厚度50%回彈，作用時(shí)長60 s 進(jìn)行全質(zhì)構(gòu)分析。

1.6 肌肉成分及飼料含量分析

樣品脂肪酸提取 分別稱取飼料及肌肉樣品1 g，采用氯仿-甲醇(2∶1，體積比)法提取樣品油脂。通過NaOH 甲醇酯化法制備脂肪酸甲酯混合物，待分析檢測。

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 正己烷稀釋37 種脂肪酸甲酯化混標(biāo)(10 mg/mL,Sigma,美國)為0.16、0.31、0.63、1.25、2.50 mg/mL 5 個(gè)濃度梯度，通過氣相色譜儀(8890 GC,Agilent Technologies Inc.,美國)測定各已知脂肪酸組分含量，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品脂肪酸含量測定 取樣品200 μL 上機(jī)檢測，通過統(tǒng)計(jì)色譜出峰面積計(jì)算每種脂肪酸的絕對含量。其中色譜柱(Agilent Technologies Inc.,USA)型號為HP-88 (100 m,0.25 mm ID,0.2 μm)，選擇后進(jìn)樣口流路進(jìn)樣，設(shè)定采集方法后，SS 進(jìn)樣口、色譜柱#1、后檢測器FID 溫度分別為270、100 和280 ℃。

1.7 肌肉組織形態(tài)分析

將采樣時(shí)固定于4%多聚甲醛的肌肉樣品依次置入乙醇梯度脫水(75%、85%、95%、100%)處理。修整樣品尺寸(3 mm×3 mm×5 mm)，通過二甲苯透明、石蠟浸透后，包埋成正方體蠟塊。用切片機(jī)(Leica,德國)制成厚度為6 μm 的石蠟切片，經(jīng)過蘇木精和伊紅(H.E)染色，最終樹脂封片，實(shí)現(xiàn)對肌肉組織學(xué)結(jié)構(gòu)的呈現(xiàn)。通過虛擬顯微鏡(Nikon,日本)觀察，于200 倍攝像捕捉(Nikon,DS-U2,日本)成像拍攝。每張切片選取3個(gè)不同視野，利用Image Pro Plus 圖像軟件(media cybernetics,美國)統(tǒng)計(jì)分析肌纖維特性。

1.8 肌肉超微結(jié)構(gòu)分析

采集樣品經(jīng)由2.5%戊二醛溶液24 h 固定處理，由磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 次，置于1%鋨酸中固定。歷經(jīng)乙醇梯度(50%、70%、80%、90%)脫水處理，通過丙酮浸透作用后完成包埋操作。最終制成厚度為70 nm 的超薄切片，經(jīng)由鈾和鉛雙染處理。電鏡放大倍數(shù)為8 000 倍，借助ATM 攝像系統(tǒng)(HATICHA,日本)進(jìn)行成像拍攝。每張切片選取3 個(gè)不同視野，每個(gè)視野讀取3 次，利用Image Pro Plus 圖像軟件(media cybernetics,美國)統(tǒng)計(jì)并分析肌節(jié)長度(SL)。

1.9 基因表達(dá)

使用TRIzol 試劑(Invitrogen,美國)提取肌肉組織中總RNA，通過RQ1 RNase-free DNase(Promega,美國)消除提取過程中可能存在的基因組DNA 降解。使用ExScriptTMRT-PCR 試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。目的cDNA 采用SYBR 稀釋擴(kuò)增，使用Green Ⅱ熒光試劑盒(TaKaRa,日本)進(jìn)行后續(xù)實(shí)時(shí)定量PCR 測定。以延伸系數(shù)1α(ef1α)作為目的基因轉(zhuǎn)錄水平相對量化參照[16]。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表3)。參照Livak 等[17]的方法，運(yùn)用2-ΔΔCt計(jì)算目的基因mRNA 的相對表達(dá)量。

表3 實(shí)時(shí)定量PCR 引物的核苷酸序列Tab.3 Nucleotide sequences of the primers for real-time quantitative PCR

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由Kolmogorov-Smirnov 和Levene 檢驗(yàn)評價(jià)正態(tài)性和同質(zhì)性。通過SPSS 16.0 軟件(SPSS,美國)進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析。數(shù)據(jù)的組間差異由Tukey 氏多程檢驗(yàn)確定，顯著性水平為P<0.05。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用3 重復(fù)(n=3)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 生長性能

與對照組相比，飼料中不同碳鏈長度脂肪酸的添加對團(tuán)頭魴終末體重、特定生長率、增重率、飼料系數(shù)、平均日采食量、胴體率及臟體比指標(biāo)均無顯著影響(P>0.05) (表4)。

表4 飼料不同碳鏈長度脂肪酸對團(tuán)頭魴生長的影響Tab.4 Effects of dietary fatty acids with different carbon-chain lengths on the growth of M. amblycephala

2.2 肌肉品質(zhì)測定

PA 組團(tuán)頭魴肌肉硬度較對照組顯著升高(P<0.05)；與對照組相比，BA 和OA 組也呈上升趨勢，盡管這種差異并不顯著(P>0.05)。對照組肌肉黏附性顯著高于BA、OA 和PA 組(P<0.05)。咀嚼性、膠黏性、內(nèi)聚性、彈性及回復(fù)性各物理指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，各組團(tuán)頭魴肌肉均無顯著差異(P>0.05) (表5)。

表5 飼喂實(shí)驗(yàn)飼料對團(tuán)頭魴肌肉質(zhì)構(gòu)的影響Tab.5 Effects of experimental diets on white muscle texture of M. amblycephala

2.3 肌肉脂肪酸組成

由于飼料中不同類型脂肪酸的添加，使得團(tuán)頭魴肌肉中脂肪酸含量存在一定的差異性(表6)。與對照組相比，PA 組團(tuán)頭魴肌肉C16:0、C18:0及C20:3n3 含量顯著升高(P<0.05)。與此同時(shí)，BA、OA 及PA 組C16:1 含量顯著高于對照組(P<0.05)，C18:1n9 含量也呈現(xiàn)出相似趨勢。OA 及PA 組C20:2 含量顯著高于對照組及BA 組(P<0.05)，C22:6n3 含量最高值出現(xiàn)在PA 組，且顯著高于對照組及BA 組(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組團(tuán)頭魴肌肉中其余脂肪酸含量間均無顯著差異(P>0.05)。

表6 飼喂實(shí)驗(yàn)飼料對團(tuán)頭魴肌肉脂肪酸組成的影響Tab.6 Effects of experimental diets on muscle fatty acid composition of M. amblycephala g/kg

2.4 肌肉組織形態(tài)分析

圖版Ⅰ為飼喂實(shí)驗(yàn)飼料團(tuán)頭魴肌肉橫截面，其中肌纖維橫截面呈不規(guī)則多邊形，白色間質(zhì)為肌內(nèi)膜，是包裹在每條肌纖維外的疏松結(jié)締組織。相較于對照組，飼料中添加不同碳鏈長度脂肪酸的3 組肌纖維數(shù)目明顯增多，肌纖維間空隙減少，肌纖維平均直徑減小(圖版Ⅰ)。從具體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看(表7)，PA 組團(tuán)頭魴肌纖維平均橫截面積顯著低于對照、BA 和OA 組(P<0.05)。BA、OA 和PA 組肌纖維數(shù)量、密度較對照組顯著增加(P<0.05)，且PA 組顯著高于其余兩種脂肪酸添加組(P<0.05)。與此同時(shí)，按照肌纖維直徑的比例劃分，發(fā)現(xiàn)隨著飼料添加的脂肪酸碳鏈長度的增加，較小直徑(<20 μm)肌纖維出現(xiàn)比例顯著增加(P<0.05)；較大直徑(>50 μm)肌纖維的最高比例出現(xiàn)在對照組，且顯著高于其他3 個(gè)脂肪酸添加組(P<0.05)。此外，BA 和OA 組肌纖維直徑分布在20～50 μm 的比例顯著高于其他兩組(P<0.05)。

圖版Ⅰ 飼喂實(shí)驗(yàn)飼料團(tuán)頭魴肌肉橫截面1～4 分別為對照組、丁酸組(BA)、辛酸組(OA)及棕櫚酸組(PA)，圖2 同，虛擬顯微鏡放大倍數(shù)為200 倍。Plate Ⅰ Transversal sections of white muscle in M. amblycephala fed experimental diets1-4.control group,butyric acid group (BA),octanoic acid group (OA),and palmitic acid group (PA),the same as Fig.2.The magnification of the virtual microscope is 200 times.

表7 飼喂實(shí)驗(yàn)飼料團(tuán)頭魴肌纖維結(jié)構(gòu)及肌節(jié)長度Tab.7 Muscle cellularity and sarcomere length of M. amblycephala fed experimental diets

2.5 肌肉超微結(jié)構(gòu)分析

兩條相鄰Z 線之間的一段肌原纖維稱為肌節(jié)，每個(gè)肌節(jié)由1/2 明帶+暗帶+1/2 明帶組成，是骨骼肌纖維結(jié)構(gòu)與功能的基本單位。圖版Ⅱ中肌節(jié)長度(SL)由雙向箭頭間的距離標(biāo)出。與對照組相比，BA、OA 和PA 組SL 長度顯著增加(P<0.05)，且隨著脂肪酸碳鏈長度的增加，SL 長度也呈現(xiàn)出同步上升趨勢(P<0.05) (表7)。

圖版Ⅱ 飼喂實(shí)驗(yàn)飼料團(tuán)頭魴肌肉透射電鏡雙向箭頭表示肌節(jié)長度，單向箭頭所指的是Z 線，電子顯微鏡放大倍數(shù)為8 000 倍。Plate Ⅱ Transmission electron microscope of white muscle in M. amblycephala fed experimental dietsThe black distance between the two-way arrows indicates the sarcomere lengths (SL),the black line pointed by the one-way arrow is the Z disk.The magnification of the electron microscope is 8 000 times.

2.6 肌肉中的基因表達(dá)

飼喂不同脂肪酸類型飼料對團(tuán)頭魴肌肉中ampkα1 基因表達(dá)量無顯著影響(P>0.05) (圖1-a)。ampkα2 基因mRNA 表達(dá)量受BA 顯著上調(diào)(P<0.05)，與此同時(shí)，OA 和PA 組也較對照組呈現(xiàn)升高趨勢(P>0.05) (圖1-b)。BA 組sirt1 基因的表達(dá)量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，然而其表達(dá)不受飼料中OA 和PA 添加作用的影響(圖1-c)。不同碳鏈長度脂肪酸添加組團(tuán)頭魴肌肉中mstnb基因mRNA 表達(dá)量均有不同程度的降低，其中BA組顯著低于對照組(P<0.05)，而在mstna基因上沒有觀察到類似結(jié)果(P>0.05) (圖1-d～e)。此外，肌肉中myod、myog和mrf4 基因mRNA 表達(dá)量不受飼料中不同碳鏈長度脂肪酸添加的影響(P>0.05)(圖1-f～h)，而OA 組myf5 表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05) (圖1-i)。飼料中BA、OA 和PA 顯著上調(diào)了肌肉中camk基因的表達(dá)量(P<0.05)，所有實(shí)驗(yàn)組魚肉中can基因mRNA 表達(dá)量無顯著差異(P>0.05) (圖1-j～k)。

(圖1 Fig.1)

3 討論

3.1 飼料中不同碳鏈長度脂肪酸的添加對團(tuán)頭魴生長的影響

在本研究中，3 種不同碳鏈長度的脂肪酸添加對團(tuán)頭魴的生長均無顯著影響。晏顯芳等[18]發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉的濃度或劑型的改變對草魚(Ctenopharyngodon idella)幼魚生長均無顯著影響，這些與本研究結(jié)果一致。然而，Robles 等[19]對金頭鯛(Sparus aurata)的研究表明，丁酸鈉可顯著提升其平均增重。另一項(xiàng)研究顯示，飼料中添加0.15%的丁酸鈉在顯著提升大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚增重率的同時(shí)，也提升了表觀消化率[20]。導(dǎo)致這一不同結(jié)果的可能原因：①丁酸鈉對魚類生長的影響具有劑量效應(yīng)，即飼料中丁酸鈉添加劑量的過多或過少均無法引起生長的響應(yīng)[21]。②丁酸鈉主要通過促進(jìn)腸道發(fā)育和改善腸道健康狀況而影響生長，但這種促進(jìn)作用因動(dòng)物品種、日齡、腸道狀態(tài)而異[22]。由于碳鏈較長鏈脂肪酸短，因此中鏈脂肪酸具有更好的消化吸收特性，在機(jī)體內(nèi)主要履行供能作用[23]。目前，關(guān)于中鏈脂肪酸對動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響結(jié)果仍存在爭議，有實(shí)驗(yàn)表明了其對動(dòng)物生產(chǎn)性能的積極作用，但也有降低增重的反例出現(xiàn)[24]。聯(lián)系到以辛酸為代表的中鏈脂肪酸在機(jī)體內(nèi)的作用機(jī)制，其可以通過采食量、腸道免疫和Ghrelin 分泌等多種途徑影響動(dòng)物的生長，因此猜測辛酸的添加劑量可能是關(guān)鍵性因素。棕櫚酸常通過內(nèi)生途徑，在碳鏈延長酶和去飽和酶的協(xié)同作用下生成長鏈多不飽和脂肪酸[25]，并未發(fā)現(xiàn)棕櫚酸添加對斑馬魚(Danio rerio)雌魚體重與體長的顯著影響[3]。

3.2 飼料中不同碳鏈長度脂肪酸的添加對團(tuán)頭魴肌肉脂肪酸組成的影響

飼料脂肪酸是影響?zhàn)B殖魚類肉質(zhì)的重要因素。眾所周知，脂肪酸在肌肉中的沉積受飼料脂肪酸類型的直接影響[26-27]。通過飼料中脂肪酸種類的調(diào)節(jié)，可以改進(jìn)魚肉營養(yǎng)組成，實(shí)現(xiàn)對肉質(zhì)的調(diào)控。本研究中，團(tuán)頭魴肌肉并未檢測出十二碳以下脂肪酸含量，原因可能是短、中鏈脂肪酸對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)增強(qiáng)了機(jī)體脂肪酸的利用；也可能是其鏈長較短，在機(jī)體中更容易被消化水解造成的[28]，截至目前，關(guān)于丁酸和辛酸對魚類肌肉成分的作用尚未見報(bào)道，具體原因仍有待進(jìn)一步研究。棕櫚酸可以顯著提升團(tuán)頭魴肌肉中的C16:0含量，李新等[29]在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)上的相關(guān)研究也得到了類似結(jié)果。然而，Mata-Sotres 等[30]發(fā)現(xiàn)，幼年加州黃尾鰤(Seriola lalandi)飼料中脂肪酸類型均按比例沉積，除SFA(主要是16:0)以外，肌肉組織在很大程度上反映了飼料的脂肪酸組成。這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，其原因可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品種和生理階段等有關(guān)。通常認(rèn)為，魚類具有內(nèi)源性合成并利用C16:0 和C18:0 的能力，并且在去飽和酶Δ9 的催化下可進(jìn)一步合成C16:1 及C18:1n9 等脂肪酸類型[31]。在本研究中，添加丁酸、辛酸、棕櫚酸顯著提升了團(tuán)頭魴肌肉中C16:1 和C18:1n9 含量，這可能是不同碳鏈長度脂肪酸的補(bǔ)充通過機(jī)體內(nèi)源性代謝的結(jié)果。魚體脂肪酸組成取決于飼料攝入和內(nèi)源性代謝的共同作用，同時(shí)伴隨消化與吸收，最終以另一種脂肪酸或脂肪酸衍生物形式積累[29]。值得注意的是，肌肉中C20:2、C20:3n3 及C22:6n3的沉積量也在棕櫚酸作用下顯著提升。飼料中飽和脂肪酸的添加增加了魚肉中不飽和脂肪酸的總量，與此同時(shí)，C22:6n3 (DHA)還是對人體有益的脂肪酸類型，因此用不同碳鏈長度脂肪酸飼喂可以有效調(diào)控魚肉脂肪酸組成和含量，滿足人類對養(yǎng)殖魚類的品質(zhì)需求。目前，不同碳鏈長度脂肪酸在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用尚不廣泛，不同碳鏈長度脂肪酸在魚類肌肉中的沉積作用及提升肌肉營養(yǎng)品質(zhì)的相關(guān)機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

3.3 飼料中不同碳鏈長度脂肪酸的添加對團(tuán)頭魴肌肉特性的影響

魚類骨骼肌是人類食物的重要蛋白來源[32]。然而，魚肉品質(zhì)的評估并非一項(xiàng)簡單工作。魚肉品質(zhì)由內(nèi)在因素(質(zhì)地、化學(xué)組成、顏色和脂肪含量等)決定[33]，其中質(zhì)地直接影響消費(fèi)者對魚肉的感官特性[8]。Choi 等[34]發(fā)現(xiàn)，魚肉質(zhì)地與肌纖維特性密切相關(guān)，因此分析肌纖維密度、橫截面積及直徑變化等是探究肌纖維發(fā)育的重要方法[35]。肌纖維密度包含了肌纖維數(shù)量和肌纖維大小等信息，與硬度和咀嚼性特征呈正相關(guān)；平均肌纖維橫截面積/直徑與硬度呈負(fù)相關(guān)性，即較小平均肌纖維橫截面積/直徑的魚肉具有較大的感官硬度[36]。本研究中，飼料中棕櫚酸的添加顯著提升了魚肉硬度，這可能是棕櫚酸通過提升團(tuán)頭魴肌纖維數(shù)量和密度、降低平均肌纖維橫截面積的共同作用，實(shí)現(xiàn)了對魚肉質(zhì)地的改善。Johnston 等[37]在對比大西洋鮭(Salmo salar)兩個(gè)不同品系時(shí)發(fā)現(xiàn)，高肌纖維密度的魚肉具有更好的質(zhì)地特性。Hurling 等[38]認(rèn)為平均肌纖維橫截面積越小，魚肉越容易獲得較高感官硬度，這些都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。與此同時(shí)，根據(jù)脊椎動(dòng)物骨骼肌生長發(fā)育特點(diǎn)，常以直徑<20 μm 肌纖維的比例決定肌肉的生長狀態(tài)[35]。本研究中，飼料不同碳鏈長度脂肪酸的添加顯著提升了直徑<20 μm 肌纖維的比例，代表肌纖維處于較為活躍的生長模式[39]。與哺乳動(dòng)物不同，魚類骨骼肌可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)肌纖維的肥大和增生[40]。因此，不同碳鏈長度脂肪酸顯著促進(jìn)了團(tuán)頭魴肌肉的增殖，展現(xiàn)了肌肉對肌纖維較強(qiáng)的募集作用。

肌節(jié)是肌纖維收縮的基本功能單位。有研究表明，肌節(jié)長度與肌肉嫩度呈正相關(guān)，即肌節(jié)長度越長，肌肉品質(zhì)越嫩。Herring 等[41]對比了約束和自由狀態(tài)下牛肉的肌節(jié)長度后發(fā)現(xiàn)，肌節(jié)越長肉片嫩度也越高。曾勇慶等[42]在探究萊蕪豬不同部位肌肉超微結(jié)構(gòu)與肉質(zhì)的關(guān)系時(shí)也得到了相同結(jié)論。這與在鳥類[43]和其他哺乳類動(dòng)物[44]上的研究結(jié)果一致。本研究中，肌節(jié)長度在丁酸、辛酸及棕櫚酸的作用下顯著增加，魚肉也更加柔嫩，可能的解釋是脂肪酸促進(jìn)了肌節(jié)高度有序的裝配過程，從而使肌節(jié)長度變長；也有可能是脂肪酸提升了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，加速了肌鈣蛋白和Ca2+結(jié)合的效率。值得注意的是，與追求哺乳動(dòng)物肉片的柔嫩質(zhì)地相反，消費(fèi)者在選擇魚肉制品時(shí)總是更傾向于魚肉的緊湊質(zhì)地[45]。因此，不同碳鏈長度脂肪酸對團(tuán)頭魴魚肉品質(zhì)的改善是兩方面的，既包括硬度的提升，又包括嫩度的改善。不同碳鏈長度脂肪酸對肌纖維發(fā)育的綜合影響對改善魚肉質(zhì)地有積極作用，但是具體的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

3.4 飼料中不同脂肪酸添加對團(tuán)頭魴肌纖維發(fā)育相關(guān)基因mRNA 的影響

肌源性調(diào)節(jié)因子(MRFs)包括myod、myog、mrf4 和myf5[46]，自胚胎階段開始協(xié)同調(diào)控骨骼肌的生長和發(fā)育過程[47]，與魚肉品質(zhì)密切相關(guān)。然而家族各成員的時(shí)空表達(dá)具有特異性，myod和myf5 在肌肉發(fā)育早期扮演生肌決定因子的角色[48]；后期由myog和mrf4 共同承擔(dān)成肌細(xì)胞的融合與分化功能[49]。盡管如此，決定MRFs 基因活化與表達(dá)與否并非易事，除了個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞生長狀態(tài)等內(nèi)部因素的作用外，也可能受營養(yǎng)水平等外界因素調(diào)控[50]。Huang 等[51]發(fā)現(xiàn)高脂飼料通過上調(diào)團(tuán)頭魴肌肉中myog、mrf4 和myf5 表達(dá)量促進(jìn)團(tuán)頭魴肌纖維發(fā)育。黃河鯉(Cyprinus carpio)飼料中n-3/n-6 脂肪酸比例的變化直接影響肌肉中的myod表達(dá)量[52]。本研究中，辛酸通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子myf5 參與團(tuán)頭魴肌纖維發(fā)育的增殖過程，而myod的相對表達(dá)量沒有受到不同碳鏈長度脂肪酸的影響，可能是因?yàn)榕cmyf5 二者在功能上存在重疊區(qū)域，可以協(xié)同啟動(dòng)魚類肌源細(xì)胞的分化功能[53]。當(dāng)myod表達(dá)阻遏時(shí)，myf5 出現(xiàn)了代償性表達(dá)，因此并不影響團(tuán)頭魴肌肉的發(fā)育狀況[54]。與此同時(shí)，飼料中不同碳鏈長度脂肪酸的添加提高了myog和mrf4 基因的相對表達(dá)量，盡管差異并不顯著，這可能與團(tuán)頭魴肌纖維發(fā)育尚未到達(dá)成熟期，甚至大部分仍處于成肌細(xì)胞增殖階段有關(guān)。當(dāng)肌纖維發(fā)育處于分化/融合期時(shí)，myf5 與myod尚且具有互補(bǔ)能力，同時(shí)myog和mrf4 的高表達(dá)階段還未達(dá)到，具體肌纖維發(fā)育所處階段仍需進(jìn)一步探討。此外，肌肉生長抑制素(mstn)是重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子，起到抑制超彈性骨骼肌的生長作用。目前利用多技術(shù)手段證實(shí)，mstn的降調(diào)在斑馬魚發(fā)育過程中對肌纖維具有增生或肥大的作用[55]。本研究中，丁酸組mstna基因表達(dá)降低，這與該組肌纖維密度和較小直徑(<20 μm)肌纖維比例的增加結(jié)果相符。以上這些結(jié)果都表明了不同碳鏈長度脂肪酸在肌纖維持續(xù)補(bǔ)充和肥大過程中的促進(jìn)作用。

3.5 飼料中不同脂肪酸添加對能量感知通路相關(guān)AMPK/Ca2+基因mRNA 的影響

AMP 依賴的蛋白激酶(AMPK)作為機(jī)體的能量傳感器，具有在細(xì)胞水平平衡能量進(jìn)出的重要功能。通過運(yùn)動(dòng)或能量等外部條件的激活作用，AMPK 獲得磷酸化實(shí)現(xiàn)對下游靶向通路的調(diào)節(jié)，其中就包括骨骼肌組織[56]。Sirt1 是AMPK 信號通路中重要的下游受體，已有研究表明，Sirt1 對營養(yǎng)的可用性和能量的增減均能做出敏捷反應(yīng)[57-58]。Wang 等[59]發(fā)現(xiàn)DHA 可以通過AMPK/Sirt1 途徑調(diào)節(jié)MRFs 的表達(dá)進(jìn)而影響肌纖維的增殖與分化；暴露在高脂環(huán)境的團(tuán)頭魴原代肝細(xì)胞中AMPK 及Sirt1 蛋白水平顯著增加[51]。這也就意味著，脂肪酸的攝入可以通過AMPK 上調(diào)細(xì)胞中NAD+的離子水平，進(jìn)一步激活下游沉默信息調(diào)節(jié)器(Sirt1)[60]。CAM 激酶家族成員在骨骼肌功能中起重要作用，更有多功能激酶可以實(shí)現(xiàn)肌肉塑形[61]。鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(CAMK)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)通過動(dòng)作電位靈敏感知細(xì)胞中的Ca2+濃度變化[62]，與此同時(shí)，這種變化使得CAMK 激活CaN 進(jìn)而顯著促進(jìn)調(diào)控肌肉發(fā)育基因的表達(dá)[61]。AMPK 和Ca2+依賴的信號通路是影響哺乳動(dòng)物肌纖維類型轉(zhuǎn)化的重要途徑[63]。本研究中，飼料丁酸的添加提升了ampkα2 和sirt1 基因mRNA 的表達(dá)量，暗示其激活了AMPK/Sirt1 通路；同時(shí)不同碳鏈長度脂肪酸的添加顯著上調(diào)了camk基因的相對表達(dá)量，Ca2+依賴的信號通路也呈現(xiàn)激活狀態(tài)?？傊?，飼料中不同碳鏈長度脂肪酸的添加促進(jìn)了團(tuán)頭魴肌肉的增生和肥大過程，這一調(diào)控機(jī)制可能通過AMPK 及Ca2+依賴的信號通路共同實(shí)現(xiàn)。目前，AMPK 及Ca2+依賴的信號通路在魚類肌纖維發(fā)育上的研究較少，不同類型脂肪酸對魚類肌纖維發(fā)育機(jī)制的影響仍有待補(bǔ)充完善。

4 結(jié)論

綜上所述，飼料中丁酸、辛酸、棕櫚酸的添加可能通過AMPK 和Ca2+依賴的信號通路提升團(tuán)頭魴肌肉質(zhì)地、肌纖維密度以及較小直徑肌纖維(<20 μm)比例，從而實(shí)現(xiàn)對團(tuán)頭魴肌肉品質(zhì)的改善。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）