鄭宗林，張 進(jìn)，徐靖琳，劉 偉，于文博，方媛林，張景森，段 聰，周朝偉

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；2.重慶市珍稀特有魚類國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，重慶 402260)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是一個(gè)參與脊椎動(dòng)物機(jī)體免疫的基因家族，具有豐富的等位基因位點(diǎn)，這種多態(tài)性可使每個(gè)個(gè)體結(jié)合并呈遞相當(dāng)數(shù)量的抗原多肽，從而為易感性/抗感性基因的篩選與標(biāo)記提供依據(jù)[1]。MHC基因編碼形成細(xì)胞表面糖蛋白，并與內(nèi)源抗原或外源抗原結(jié)合，將抗原呈遞給CD8+T 淋巴細(xì)胞或CD4+T 淋巴細(xì)胞的T 細(xì)胞受體識(shí)別，從而引起適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]。根據(jù)MHC基因結(jié)構(gòu)和功能的差異，可劃分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類3 個(gè)亞家族，其中，MHCⅡβ基因編碼的跨膜糖蛋白可構(gòu)成MHCⅡ類分子，間接參與MHCⅡ—抗原多肽復(fù)合物的形成，使得CD4+T 淋巴細(xì)胞結(jié)合主要來(lái)自寄生蟲、細(xì)菌、病毒等外源性抗原多肽，從而觸發(fā)細(xì)胞外病原的免疫反應(yīng)[3]。相關(guān)研究結(jié)果表明，在黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[4]、西伯利亞鱘(Acipernser baerii)[5]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[6]等水產(chǎn)動(dòng)物中，MHCⅡβ基因在應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染或病原菌刺激后的免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著十分重要的作用。

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科 (Cyprinidae)鮈鯽屬 (Gobiocypris)，具有生活史周期短、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、對(duì)環(huán)境毒物敏感性較高的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)稀有鮈鯽已基本實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化，是我國(guó)代表性的本土模式生物之一，在遺傳學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)、生態(tài)毒理學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域有著廣泛研究[7]。然而與斑馬魚(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)、金魚(Carassius auratus auratus)等模式魚類相比，稀有鮈鯽在免疫基因方面的研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少[8]，限制其在免疫防御研究領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究首先克隆了稀有鮈鯽MHCⅡβ基因，分析其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和功能結(jié)構(gòu)域，其次通過(guò)人工感染魯氏耶爾森菌建立的感染模型，分析稀有鮈鯽MHCⅡβ類基因在免疫組織中的相對(duì)表達(dá)情況，為揭示稀有鮈鯽的免疫應(yīng)答、響應(yīng)特征及適應(yīng)機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

稀有鮈鯽，由西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。稀有鮈鯽親本共9 對(duì)，按照雌雄各1 尾配對(duì)放入獨(dú)立的魚缸中飼養(yǎng)，水溫(24±1) °C，溶解氧≥6.3 mg/L，光周期為14 L∶10 D，每間隔48 h 換水三分之一。為減少因飼養(yǎng)條件所導(dǎo)致的個(gè)體差異以及滿足實(shí)驗(yàn)所需的動(dòng)物數(shù)量，采用干法授精方式進(jìn)行人工繁殖，子一代在4 個(gè)月后達(dá)到性成熟，隨機(jī)撈取健康魚5 尾冰上麻醉，將其解剖后分離腦、鰓、心臟、皮膚、頭腎、肝臟、腸、眼、脾臟、卵巢共10 個(gè)組織于液氮速凍。

1.2 建立人工感染模型

魯氏耶爾森菌(Yersinia ruckeri)由西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究室提供，使用LB 液體培養(yǎng)基活化菌株后，采用麥?zhǔn)媳葷岱ê推桨寰溆?jì)數(shù)法確定菌液濃度。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定正式實(shí)驗(yàn)的半致死濃度為3.16×105CFU/mL。將160尾健康魚(子一代)隨機(jī)分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，每組80 尾魚，實(shí)驗(yàn)組稀有鮈鯽采用腹腔注射的方式注射10 μL 魯氏耶爾森菌，對(duì)照組稀有鮈鯽注射同體積無(wú)菌生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組分別在6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、48、72 和96 h)，隨機(jī)選取3 尾魚分離脾臟、鰓、皮膚、肝臟和頭腎組織并液氮速凍，用于感染后MHCⅡβ基因表達(dá)變化研究。

1.3 總RNA 的提取及cDNA 模板的制備

各組織總RNA 提取方法參照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(TaKaRa，大連)說(shuō)明書，w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性，通過(guò)NanoDrop(ND-ONE-W，OD260/OD280比率，1.90～2.05)測(cè)定RNA 質(zhì)量。使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄合成第一條鏈cDNA。

1.4 稀有鮈鯽MHC Ⅱβ 基因克隆

根據(jù)已知報(bào)道中與稀有鮈鯽親緣性較高的魚類[9]，在Nucleotide (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中下載其對(duì)應(yīng)基因序列，利用DNAMAN 6.0.39 軟件比對(duì)高度保守區(qū)并設(shè)計(jì)引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 文庫(kù)為模板，擴(kuò)增稀有鮈鯽MHCⅡβ目的片段。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用1%濃度瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并切膠回收目的條帶?；厥諚l帶先與ExTaq連接酶反應(yīng)，再導(dǎo)入PMD 19-T 載體，最后轉(zhuǎn)化到TOP 10 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆菌株，培養(yǎng)后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究所用的主要引物Tab.1 Primers used in the study

1.5 基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果運(yùn)用DNAMAN 6.0.39 進(jìn)行拼接，運(yùn)用 ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找開放閱讀框、推導(dǎo)氨基酸序列。Signal IP 4.1 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)預(yù)測(cè)信號(hào)肽。使用 ExPASy服務(wù)器的NetNGlyc 1.0 server (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0) 和NetPhos 3.1 server (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1) 分別進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。使用SMART 在線軟件 (https://smart.embl.de/) 預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域。在GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載親緣物種MHCⅡβ的氨基酸序列。以MEGA 7.0 的鄰位相接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并選擇Bootstrap method 重復(fù)為1 000 次，計(jì)算分支上的置信度。

1.6 組織表達(dá)特異性分析

根據(jù)已驗(yàn)證獲得MHCⅡβ的模板序列，設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物，并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測(cè)腦、鰓、心臟、皮膚、頭腎、肝臟、腸、眼、肌肉、卵巢等組織中基因表達(dá)情況，以β-action為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。測(cè)定試劑為SYBR Green(TaKaRa，大連)，建立20 μL反應(yīng)體系：TB Green 10 μL，上下游引物、Rox Ⅱ各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，滅菌水6.8 μL，每個(gè)樣品均設(shè)置3 個(gè)技術(shù)性重復(fù)。反應(yīng)參數(shù)為95 °C 預(yù)變 性5 min，95 °C 變性30 s，95 °C 變性5 s，60°C 退火30 s，72 °C 延伸30 s，共45 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 稀有鮈鯽MHC Ⅱβ 基因的克隆及序列分析

通過(guò)設(shè)計(jì)的特異性引物，以稀有鮈鯽腸道cDNA 文庫(kù)為模板擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測(cè)序拼接后，得到810 bp 的MHCⅡβ片段，使用ORF Finder查詢到開放閱讀框的長(zhǎng)度為759 bp，共編碼252個(gè)氨基酸(圖1)，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)的分子量大小為28.13 ku，等電點(diǎn)(pI)為8.74。氨基酸序列中1～24 為信號(hào)肽，31～106 為MHCⅡβ(β-1)結(jié)構(gòu)域，131～202 為IGc1(β-2)結(jié)構(gòu)域，219～240 為跨膜螺旋區(qū)域，N-糖基化位點(diǎn)位于第60 位，包含26 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

圖1 稀有鮈鯽MHC Ⅱβ 基因部分cDNA 序列及其編碼的氨基酸序列起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)分別用灰色底框表示；三角形代表預(yù)測(cè)的N-糖基化位點(diǎn)；圓表示預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)；下劃線部分為信號(hào)肽區(qū)域；MHC Ⅱβ 結(jié)構(gòu)域用虛下劃線標(biāo)示；IGc1 結(jié)構(gòu)域用波浪線標(biāo)示；跨膜結(jié)構(gòu)域用點(diǎn)式下劃線標(biāo)示；實(shí)線方框表示MHC Ⅱβ-F1和MHC Ⅱβ-R1 引物識(shí)別位點(diǎn)；虛線方框表示MHC Ⅱβ-F2 和MHC Ⅱβ-R2 引物識(shí)別位點(diǎn)。Fig.1 Partial cDNA sequence of MHC Ⅱβ and its encoded amino acid sequence of G. rarusThe initiation codon (ATG) and stop codon (TAA) are indicated by grey bottom boxes,respectively;the triangle indicates the putative site for N-linked glycosylation;the circle indicates the putative site for phosphorylation;the putative signal peptide is underlined;MHC Ⅱβ domain is indicated by dashed underline;IGc1 domain is indicated by wave line;transmembrane region is indicated by dot underline;the solid line boxes indicate the MHC Ⅱβ-F1 and MHC Ⅱβ-R1 primer recognition sites;the dotted boxes indicate the MHC Ⅱβ-F2 and MHC Ⅱβ-R2 primer recognition sites.

2.2 MHC Ⅱβ 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步闡明稀有鮈鯽MHCⅡβ基因的進(jìn)化關(guān)系，從GenBank 下載其他物種的MHCⅡβ氨基酸序列，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，稀有鮈鯽MHCⅡβ基因與團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)MHCⅡβ基因親緣程度最高，與虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、斑馬魚(Danio rerio)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、長(zhǎng)吻鮠(Leiocassis longirostris)的進(jìn)化關(guān)系較近且在一個(gè)分支內(nèi)，而與哺乳類、兩棲類、鳥類之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)。

圖2 稀有鮈鯽MHC Ⅱβ 與其他物種MHC Ⅱβ 的系統(tǒng)進(jìn)化樹稀有鮈鯽；團(tuán)頭魴(AGV52144.1)；草魚(AEM75094.1)；斑馬魚(NP_001007207.2)；長(zhǎng)吻鮠(ADK38668.1)；虹鱒(AAD53026.1)；牙鲆(AII02004.1)；真鯛(A-AP20186)；大黃魚(ABV48909.1)；條紋狼鱸(AAA49380.1)；歐洲鱸(CAJ34344)；棘胸蛙(AHN50435.1)；原雞(AAS00716.1)；智人(AAA59777.1)；馬(AAA66940.1)；小鼠(AAD31755.1)。Fig.2 Phylogenetic tree based on the sequence of G. rarus MHC Ⅱβ and MHC Ⅱβ from other speciesG. rarus; M. amblycephala (AGV52144.1);C. idella (AEM75094.1);D. rerio(NP_001007207.2);L. longirostris (ADK38668.1);O.mykiss (AAD53026.1);P. olivaceus (AII02004.1);Pagrus major (A-AP20186)；Larimichthys crocea (ABV48909.1);Morone saxatilis (AAA49380.1)，Dicentrarchus labrax (CAJ34344);Quasipaa spinosa (AHN50435.1);Gallus gallus (AAS00716.1);Homo sapiens (AAA59777.1);Equus caballus(AAA66940.1);M. musculus(AAD31755.1).

2.3 MHC Ⅱβ 氨基酸序列的同源性分析

通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載不同物種MHCⅡβ的氨基酸序列，對(duì)稀有鮈鯽MHCⅡβ氨基酸序列與不同物種的同源性差異進(jìn)行了分析比較，檢索發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽MHCⅡβ與團(tuán)頭魴相似度最高，為80.56%，斑馬魚次之為64.57%，與歐洲鱸為51.78%，而與小鼠一致性最低為27.82% (圖3)。同源性結(jié)果分析表明，MHCⅡβ在不同動(dòng)物中均具有保守性。

圖3 MHC Ⅱβ 氨基酸序列多重比對(duì)陰影部分表示列表中70 %以上的多肽殘基序列都是保守的；*表示氨基酸序列完全一致；方框表示4 個(gè)保守的半胱氨酸殘基；---表示氨基酸的缺失；★表示GXXGXXXGXXXXXXG 框。Fig.3 Alignment of the amino acid sequences of MHC ⅡβResidues that are conserved in more than 70% of the listed peptides are shadowed；Identical amino acid is indicated by an asterisk；The Boxes indicate 4 conserved cysteine residues；Gaps used to maximize the alignment are shown by dashes；the black five pointed star designates the motifs of GXXGXXXGXXXXXXG.

2.4 MHC Ⅱβ 基因的組織表達(dá)分析

以反轉(zhuǎn)錄合成的第一條鏈cDNA 為模板，以β-action為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR 分析了健康稀有鮈鯽各個(gè)組織MHCⅡβ基因的表達(dá)差異，將MHCⅡβ基因在心臟組織的表達(dá)水平設(shè)為1，結(jié)果顯示，脾臟表達(dá)量最高，頭腎、鰓、皮膚表達(dá)量較高，心臟表達(dá)水平較低，肝臟、腸道、腦、眼、卵巢表達(dá)水平最低(圖4)。

圖4 稀有鮈鯽MHC Ⅱβ mRNA 的組織分布1.肝臟，2.頭腎，3.心臟，4.鰓，5.皮膚，6.腸，7.腦，8.眼，9.脾臟，10.卵巢；不同字母者表示差異顯著(P<0.05)。Fig.4 Tissue expression of MHC Ⅱβ mRNA of G. rarus1.liver,2.head kidney,3.heart,4.gill,5.skin,6.intestin,7.brain,8.eye,9.spleen,10.ovary;different letters mean significantly difference(P<0.05).

稀有鮈鯽被魯氏耶爾森菌感染后，不同免疫組織(肝臟、皮膚、鰓、頭腎、脾臟)中MHCⅡβmRNA 水平發(fā)生了不同程度的變化。從圖5 可知，肝臟中MHCⅡβ的表達(dá)量最高的時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)在感染后的12 h(P<0.01)，隨后逐漸降低并低于正常水平，但96 h 高于正常水平；皮膚中MHCⅡβ的表達(dá)量在6 h 開始升高，在24 h 達(dá)到峰值(P<0.05)，隨后逐漸降低且72 h 為最低值(P<0.01)，在72～96 h 逐漸升高且低于正常水平；脾臟6 h 時(shí)表達(dá)水平極顯著下降(P<0.01)，24 h 表達(dá)水平降到最低(P<0.01)，之后表達(dá)水平逐漸升高，在96 h時(shí)接近正常水平(P<0.05)。鰓MHCⅡβ的表達(dá)水平在6～24 h 呈上升趨勢(shì)，24 h 達(dá)到峰值(P<0.01)，隨后逐漸降低，但96 h 高于正常水平。頭腎被感染6 h 時(shí)表達(dá)水平最高(P<0.05)，隨后逐漸降低至24 h(P<0.05)，48～96 h 表達(dá)量恢復(fù)到0 h 時(shí)相當(dāng)水平，表明魯氏耶爾森菌脅迫下MHCⅡβ基因在不同組織的應(yīng)答時(shí)間和表達(dá)水平存在差異。

圖5 注射魯氏耶爾森菌后稀有鮈鯽MHC Ⅱβ 在肝臟(a)、頭腎(b)、鰓(c)、脾臟(d)、皮膚(e)的表達(dá)量變化*表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)量有差異顯著(P <0.05)；**表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)量有極差異顯著(P <0.01)。Fig.5 Expression changes of MHC Ⅱβ mRNA in liver (a),head kidney (b),gill (c),spleen (d) and skin (e) of G. rarus injected with Y. ruckeri*means infection group expression level compared with control group has significant difference(P <0.05);**means infection group expression level compared with control group has extremely significant difference(P <0.01).

3 討論

3.1 MHC Ⅱβ 基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，稀有鮈鯽MHCⅡβ序列具有已知物種β-1 和IGc1(β-2)結(jié)構(gòu)域的4 個(gè)保守半胱氨酸殘基和N-糖基化位點(diǎn)。半胱氨酸的存在有利于分子內(nèi)二硫鍵的形成，而N-糖基化位點(diǎn)的存在會(huì)影響MHCⅡ類分子α-β二聚體的形成以及MHC分子與T 細(xì)胞的相互作用[10]。根據(jù)氨基酸序列的多重序列比對(duì)結(jié)果，稀有鮈鯽與鯉科魚類具有較高的相似性，與兩棲類和哺乳類的氨基酸序列相似性較低，說(shuō)明稀有鮈鯽MHCⅡβ基因的氨基酸序列與親緣關(guān)系較近物種的氨基酸功能結(jié)構(gòu)域具有高度的保守性，其中的β-1和IGc1(β-2)亞基多位于抗原呈遞細(xì)胞表面，如B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞，具有高度多態(tài)性，發(fā)揮著外源性抗原識(shí)別與呈遞的重要作用[11]。序列對(duì)比還發(fā)現(xiàn)，稀有鮈鯽MHCⅡβ基因氨基酸序列具有與其他魚類相同特征的GXXGXX XGXXXXXXG 序列結(jié)構(gòu)，這被認(rèn)為是MHCII 類分子中彼此正確相互作用的重要因素[12]，Cosson 等[13]認(rèn)為，此結(jié)構(gòu)中的G 殘基對(duì)α-β二聚體的形成起重要作用。從系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支層次分析，稀有鮈鯽與草魚、斑馬魚和團(tuán)頭魴的分支置信度較高且親緣關(guān)系近，與馬和小鼠等哺乳動(dòng)物的同源性較低且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明了脊椎動(dòng)物之間的MHCⅡβ同源性與它們的親緣關(guān)系一致，同時(shí)MHCⅡβ基因系統(tǒng)進(jìn)化樹基本反映了各脊椎動(dòng)物在經(jīng)典分類系統(tǒng)中的地位。

3.2 MHC Ⅱβ 基因的組織表達(dá)

Kaastrup 等[14]通過(guò)鯉(Cyprinus carpio)皮膚移植實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了魚類具有類似于高等脊椎動(dòng)物MHC的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)。隨后開展的多種魚類研究表明，脾臟、鰓和頭腎等組織中MHCⅡβ基因的表達(dá)量較其他組織具有顯著差異性[15-16]。Juul-Madsen 等[17]在虹鱒的脾臟與頭腎中檢測(cè)到MHCⅡβ基因的表達(dá)信號(hào)，而在心臟和肝臟沒有獲得數(shù)據(jù)。Ono 等[18]從鯉的肝胰腺、脾臟、頭腎和腸道等已知有大量造血(淋巴)細(xì)胞的器官中檢測(cè)到了MHCⅡβ基因的表達(dá)，從心臟、骨骼肌、大腦和卵巢未檢測(cè)到該基因的表達(dá)。Koppang 等[19]在研究大西洋鮭(Salmo salar)時(shí)，發(fā)現(xiàn)頭腎、脾臟、后腸和鰓均有較高水平表達(dá)，心臟、肝臟和前腸呈中等水平表達(dá)，而腦和肌肉的表達(dá)水平低或可忽略。本研究表明，稀有鮈鯽MHCⅡβ在各個(gè)組織中均檢測(cè)到表達(dá)水平，但具有一定的組織特異性：脾臟表達(dá)量最高，頭腎、鰓、皮膚呈中等程度表達(dá)，心臟的表達(dá)量較低，而肝臟、腸道、腦、眼和卵巢的表達(dá)量是極低的。脾臟和頭腎均是魚類淋巴系統(tǒng)組織發(fā)生中主要的免疫器官，在適應(yīng)性免疫和先天性免疫發(fā)揮著重要作用[20]，頭腎不依賴抗原刺激就可產(chǎn)生B 淋巴細(xì)胞，脾臟則是魚類中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)生、貯存和成熟的主要場(chǎng)所，本研究與MHCⅡβ在團(tuán)頭魴[21]、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)[22]、西伯利亞鱘[5]頭腎和脾臟組織表達(dá)水平結(jié)果較相似。鰓、皮膚中包含淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和各類粒細(xì)胞，是黏膜免疫系統(tǒng)的組成部分，表明兩者具有識(shí)別、處理和呈遞抗原的細(xì)胞基礎(chǔ)[23-24]。因此，MHCⅡβ在不同免疫器官中較高水平表達(dá)說(shuō)明了MHCⅡβ對(duì)參與免疫響應(yīng)機(jī)制的重要性。

3.3 魯氏耶爾森菌感染后MHC Ⅱβ 基因的表達(dá)模式

MHCⅡβ分子分布在淋巴細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞表面，而在病毒、細(xì)菌等外源性抗原的刺激下，會(huì)形成MHCⅡβ-抗原多肽復(fù)合物并呈遞給T 淋巴細(xì)胞激活特異性免疫反應(yīng)[25]。Li 等[26]在圓斑星鰈(Verasper variegatus)被鰻弧菌(Vibrio anguillarum)感染后，發(fā)現(xiàn)肝臟和血液分別在4 和16 h 出現(xiàn)顯著上調(diào)。Zhang 等[27]對(duì)大菱鲆(Scophthalmus maximus)用鰻弧菌攻毒后，肝臟和頭腎感染后24～48 h中MHCIIβmRNA 的表達(dá)顯著降低，隨后上升，脾臟在感染后24～72 h 內(nèi)MHCIIβmRNA 的表達(dá)顯著下降。Xu 等[12]在鮸(Miichthys miiuy)用鰻弧菌感染過(guò)后，脾臟、肝臟、腎臟中MHCIIβ變化趨勢(shì)相似，在感染后的6～36 h 內(nèi)都呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且在12 h 時(shí)達(dá)到峰值，36～72 h 又再次呈上升趨勢(shì)。在尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)中，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)與無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的感染都能夠引起MHCⅡβ基因的顯著上調(diào)，其中嗜水氣單胞菌主要引起在肝臟、鰓和頭腎中的表達(dá)上調(diào)，而無(wú)乳鏈球菌能夠引起在鰓、頭腎、腸和脾臟中的上調(diào)[28-29]。本研究顯示，稀有鮈鯽在感染魯氏耶爾森菌后，MHCⅡβmRNA 水平發(fā)生了明顯變化，且在不同組織中有顯著差異。在6 h 時(shí)，頭腎MHCⅡβ首先出現(xiàn)顯著上調(diào)并達(dá)到峰值，之后降低并在24 h 為最低值(為0 h 的0.12 倍)，隨后在96 h 接近正常水平。Zhang 等[27]發(fā)現(xiàn)用鰻弧菌感染后大菱鲆肝臟和頭腎組織MHCⅡβ表達(dá)在24～48 h 顯著降低，96 h 后恢復(fù)正常水平，認(rèn)為半致死濃度的致病菌在早期就會(huì)發(fā)生對(duì)細(xì)胞功能的關(guān)鍵干擾，也體現(xiàn)出肝臟和頭腎是MHCⅡβ功能的重要敏感組織。同時(shí)，作為硬骨魚類主要免疫器官的頭腎對(duì)抗原刺激能夠快速反應(yīng)，其存在的抗體產(chǎn)生細(xì)胞出現(xiàn)增殖促進(jìn)了特異性免疫反應(yīng)。在12 h 時(shí)，肝臟MHCⅡβ表達(dá)水平極顯著上調(diào)，且出現(xiàn)最大表達(dá)量(為0 h 的91 倍)，隨后24 h(P<0.01)至48 h 逐漸降低，96 h 仍有顯著上調(diào)變化。周芬娜[30]發(fā)現(xiàn)在尼羅羅非魚注射嗜水氣單胞菌后，肝臟組織在24 h 內(nèi)首先呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，24 h 到48 h 間迅速下降，48 h 后又開始緩慢上升，96 h 表達(dá)量高于正常水平，認(rèn)為肝臟MHCⅡβ表達(dá)水平的變化體現(xiàn)了機(jī)體在對(duì)抗病原菌入侵的應(yīng)答過(guò)程。在24 h 內(nèi)，皮膚和鰓表達(dá)量逐漸升高，且24 h 時(shí)出現(xiàn)極顯著上調(diào)，到96 h 時(shí)兩者無(wú)顯著變化及接近正常表達(dá)水平，這表明作為黏膜相關(guān)淋巴組織的皮膚和鰓，會(huì)產(chǎn)生溶菌酶、免疫球蛋白、蛋白酶等物質(zhì)，在清除細(xì)菌的非特異性免疫反應(yīng)中也發(fā)揮著一定作用[24]。在96 h 內(nèi)，脾臟在感染后出現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，且變化顯著，96 h 接近正常表達(dá)水平，說(shuō)明MHCⅡβ的表達(dá)水平在一段時(shí)間后逐漸被激活，使得脾臟內(nèi)特異性免疫調(diào)節(jié)機(jī)制開始發(fā)揮作用，Hansen 等[31]發(fā)現(xiàn)虹鱒在感染傳染性造血器官壞死病病毒(infections hematopoietic necrosis virus，IHNV)后，頭腎和脾臟中MHCⅡβ的表達(dá)水平72 h 內(nèi)下調(diào)，在192 h 時(shí)部分恢復(fù)，認(rèn)為急性感染引起脾臟和頭腎中生成MHCⅡβ基因的細(xì)胞數(shù)量減少，或者是由于病毒的誘導(dǎo)作用使得細(xì)胞遷移，因此開始一段時(shí)間內(nèi)表達(dá)量降低。值得注意的是，頭腎在24 h 出現(xiàn)了與脾臟相似的顯著下調(diào)和最低表達(dá)量，這可能是因?yàn)榇罅糠敝车募?xì)菌對(duì)免疫器官產(chǎn)生了嚴(yán)重的破壞，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究?？梢?，MHCIIβ表達(dá)水平的變化對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用，表明其在不斷協(xié)助B 淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞免疫因子的分泌，這為稀有鮈鯽MHC家族在免疫防御研究領(lǐng)域的發(fā)展提供了參考依據(jù)。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）