小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinaenterocolitica)、假結核耶爾森菌(Yersinapseudotuberculosis)和鼠疫耶爾森菌(Yersinapestis)是耶爾森菌屬中對人類致病的3個種[1]。小腸結腸炎耶爾森菌感染可引起自限性腸道疾病和腸外自身免疫性并發(fā)癥，全球都有分布，近些年來備受重視。小腸結腸炎耶爾森菌在自然界中宿主動物繁多，在野生和家養(yǎng)的溫血動物中均能發(fā)現。鼠疫的主要宿主嚙齒動物與指示動物犬類也都是小腸結腸炎耶爾森菌的重要天然宿主[2]。在鼠疫自然疫源地的小腸結腸炎耶爾森菌的嚙齒動物帶菌率內呈現以豬為中心的同心圓分布現象，并與鼠疫耶爾森菌的分布具有密切關聯[3]。

近年來，齊氏姬鼠-大絨鼠鼠疫疫源地內鼠間鼠疫持續(xù)流行，為研究該疫源地內致病性耶爾森菌的生態(tài)分布特征，對該疫源地內鼠疫主要宿主動物和指示動物的小腸結腸炎耶爾森菌帶菌情況進行調查。

1 材料與方法

1.1樣本來源 設鼠籠捕捉鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村西坡腳耕地內鼠疫主要宿主動物，解剖采集回盲部腸段；采集鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村、新峰村、沙子坪和古城區(qū)七河鎮(zhèn)西哨村、新民村、后山村農家犬的肛拭子。標本直接置于改良PBS增菌液(英國OXOID公司)內，低溫轉運回實驗室，4 ℃冷增菌20 d。

1.2菌株分離與鑒定 根據文獻[2]，將增菌液中的培養(yǎng)物接種至CIN瓊脂(Cefsulondin-Irgasan-NovobiocinAgar)選擇培養(yǎng)基(英國OXOID公司)，經26 ℃培養(yǎng)48 h后，挑選疑似小腸結腸炎耶爾森菌菌落(菌落較大，扁平，中間為深紅色，周圍有半透明圓環(huán)，邊緣明顯，呈“公牛眼”狀)，進行純培養(yǎng)，然后用法國梅里埃全自動細菌鑒定儀和API-20E生化鑒定條(法國Bio-Merieux公司)按照使用說明進行菌種的鑒定。

1.3 小腸結腸炎耶爾森菌生物分型和血清分型

1.3.1生物分型小腸結腸炎耶爾森菌根據文獻[4]生化反應可分為1A、1B、2、3、4、5共6個生物型。

1.3.2七葉苷代謝反應鑒定將純培養(yǎng)的菌株點種于膽鹽-七葉苷(英國OXOID公司)平板，在25 ℃培養(yǎng)24 h。若菌株能分解七葉苷，使接種點周邊培養(yǎng)基變?yōu)楹谏?，此菌株生物型?A型；若菌株不分解七葉苷，接種點周邊培養(yǎng)基不變色，則為其他生物型菌株。

1.3.3使用玻片凝集法進行血清分型分型血清(O∶3型)購買自日本生研株式會社；血清特異性單克隆抗體(O∶3型)由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所應急室景懷琦研究員研制。

1.4小腸結腸炎耶爾森菌毒力基因檢測 使用文獻[5-6]的方法對小腸結腸炎耶爾森菌毒力基因進行鑒定, 判斷致病性。普通PCR儀為德國senso梯度PCR儀，LabCycler Standard plus型；細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自天根生化(北京)有限公司。

2 結 果

2.1樣本分離菌株鑒定結果 捕獲鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村西坡腳耕地內齊氏姬鼠、大絨鼠、黃胸鼠共62只，采集鼠類回盲部腸段樣本62份。其中齊氏姬鼠11只，有3只攜帶小腸結腸炎耶爾森菌；大絨鼠50只，有18只攜帶小腸結腸炎耶爾森菌；黃胸鼠1只攜帶小腸結腸炎耶爾森菌。嚙齒動物小腸結腸炎耶爾森菌的攜帶率為35.5%(22/62)。采集鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村、新峰村、沙子坪和古城區(qū)七河鎮(zhèn)西哨村、新民村、后山村農家犬171只，采集肛拭子樣本共171份。其中，小型犬30份，有3份攜帶小腸結腸炎耶爾森菌；中型犬119份，有36份攜帶小腸結腸炎耶爾森菌；大型犬22份，有6份攜帶小腸結腸炎耶爾森菌。犬類小腸結腸炎耶爾森菌的攜帶率為26.3%(45/171)。共分離到非鼠疫耶爾森菌的菌株139株，鑒定為耶爾森菌屬菌株具體結果見表1。

2.2小腸結腸炎耶爾森菌生物分型及血清分型結果 對分離到的139株小腸結腸炎耶爾森菌的菌株做七葉苷代謝反應試驗，其中有138株被鑒定為生物1A型，占99.3%；將1株非1A型小腸結腸炎耶爾森菌菌株采用活菌抗原做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水自然凝集試驗做對照，鑒定為生物3型、O∶3血清型。

2.3小腸結腸炎耶爾森菌毒力基因檢測結果 利用小腸結腸炎耶爾森菌黏附侵襲位點基因(ail基因)對樣本菌株進行毒力基因檢測，檢測結果為：138株生物1A型菌株陰性，屬于非致病性小腸結腸炎耶爾森菌；1株生物3型菌株為陽性，屬于致病性小腸結腸炎耶爾森菌。

表1 分離鑒定的耶爾森菌屬菌株名稱及數量
Tab.1 Name and quantity ofYersiniastrain isolated and identified

菌種嚙齒動物(62只)、陽性率 (%)犬類(171只)、陽性率 (%)齊氏姬鼠(11只)大絨鼠(50只)黃胸鼠(1只)小型犬(30只)中型犬(119只)大型犬(22只)小腸結腸炎耶爾森菌7(4.8)34(29.0)2(1.6)6(1.8)80(21.1)10(3.5)假結核耶爾森菌0(0)1(1.6)0(0)0(0)0(0)0(0)克氏耶爾森菌1(1.6)2(1.6)0(0)0(0)0(0)0(0)弗氏/中間型耶爾森菌2(1.6)0(0)0(0)2(0.6)7(1.8)2(0.6)

3 討 論

小腸結腸炎耶爾森菌菌株的生物分型與其致病性密切相關，在臨床上具有重大意義。小腸結腸炎耶爾森菌生物分型的鑒定主要依據生化反應。有報道稱小腸結腸炎耶爾森菌生物1A型均為非致病性菌株[7]，本研究中的138株生物1A型菌株經ail基因檢測全為陰性，這與該報道一致，為分離的小腸結腸炎耶爾森菌的優(yōu)勢菌型。有1株生物3型菌株，這與學者研究認為我國致病性菌株的生物型以生物2型和3型為主的報道一致[8]。小腸結腸炎耶爾森菌可分為6種生物型，而本研究只發(fā)現了生物1A型和生物3型兩種型別的菌株，這可能與菌株的生物型分布具有獨特地域性特征有關。雖然僅從犬肛拭子中分離到1株生物3型菌株，占7‰(1/139)，但仍然可能存在動物致病與傳染給人類的潛在能力及流行危險，因為小腸結腸炎耶爾森菌主要依靠糞-口途徑傳播，人類感染主要是通過接觸被感染動物糞便污染的食物和水[9]。

小腸結腸炎耶爾森菌的血清型眾多，在世界上已發(fā)現小腸結腸炎耶爾森菌的血清型有60多個，而我國已報道的血清型有58個[2]，但具有致病性的血清型僅占少數，現已證實對人類有致病性的血清型有 O∶3、O∶5、O∶8等多種[4]。小腸結腸炎耶爾森菌血清型的分布也呈現獨特地域性的特征。本研究中僅發(fā)現1株血清O∶3型菌株，這與國內學者研究認為我國分離的致病性菌株僅分布于O∶3和O∶9兩個血清型別的報道一致[6,10]。該血清O∶3型菌株同時也是生物3型，這和肖玉春等[8]研究證實的生物3型是我國致病性O∶3血清型菌株的優(yōu)勢生物型的說法一致。

對致病性小腸結腸炎耶爾森菌來說，侵襲性涉及到許多基因的表達。通過組織培養(yǎng)侵襲實驗的研究，確定了粘附侵襲位點基因(attachmentinvasionlocus,ail)是一種侵襲相關基因[11]，只存在于致病性小腸結腸炎耶爾森菌菌株中。ail表達的蛋白與侵襲素相似，可以介導小腸結腸炎耶爾森菌的侵襲性，與小腸結腸炎耶爾森菌的致病性密切相關。

動物的耶爾森菌感染只限于初感染，在小腸結腸炎耶爾森菌流行的區(qū)域鼠疫耶爾森菌的流行相對較弱，這佐證了近幾年內齊氏姬鼠-大絨鼠鼠疫疫源地內鼠疫疫情的流行態(tài)勢：僅局限于流行鼠間鼠疫，甚至出現活鼠帶菌的現象。本研究還分離、檢測到克氏耶爾森菌、弗氏/中間型耶爾森菌。雖然這兩種耶爾森菌均為非致病性的，但能為從菌屬水平上探討不同耶爾森菌菌種之間的相互關系提供生態(tài)學數據，為進一步深入研究該疫源地內鼠疫菌的保存相關機制提供數據支持。

總之，研究鼠疫疫源地內致病性耶爾森菌的分布及生物學特征具有重大意義，尤其對小腸結腸炎耶爾森菌的研究不容忽視，有助于探討致病性耶爾森菌在自然界長期保存、變化的機理以及相互關系，為制訂防治耶爾森菌所致相關疾病的策略提供科學依據。