據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會合理用藥專家委員會2016年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)報告，肺炎克雷伯菌僅次于大腸埃希菌占革蘭陰性桿菌臨床分離率第2位(達(dá)19.7%)。肺炎克雷伯菌對第3代頭孢菌素的耐藥率全國平均為 34.5%，對第3代頭孢菌素耐藥率最高的省份達(dá)為 58.1%。肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率全國平均為8.7%(較2015年上升了1.1%),肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥率最高的地區(qū)達(dá)23.6%[1]?？梢姺窝卓死撞R床分離率居高位,況且耐藥性突出。我們收集25株耐藥肺炎克雷伯菌進(jìn)行了62種耐藥元件基因檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2株不僅存在gyrA基因突變、同時又?jǐn)y帶了blaKPC、rmtB基因的對喹諾酮類藥物、碳青霉烯類藥物、第3代頭孢菌素、氨基糖苷類藥物均為耐藥肺炎克雷伯菌,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源及菌種鑒定 25株耐藥肺炎克雷伯菌均分離自2016-2017年江漢油田總醫(yī)院住院病人標(biāo)本。菌種鑒定為gyrA基因測序上網(wǎng)BLASTn比對法(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTn),實驗中非肺炎克雷伯菌已剔除。

1.2藥敏試驗 10種抗菌藥物藥敏試驗為K-B紙片擴散法。10種抗菌藥物依次為：頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美洛培南、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星。藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。藥敏試驗判斷依據(jù)為2016年發(fā)布的CLSI M100-S26文件。

1.3細(xì)菌DNA制備 為非離子去污劑裂解和蛋白酶K溶液法，試劑盒為無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.4獲得性耐藥元件基因檢測 25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因檢測均為PCR法。檢測項目見表1，引物序列由無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室提供。試劑盒為無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所產(chǎn)品。各種耐藥元件基因檢測體系為: 正向P1引物P1 1 μL(1.0 μmol/L)、反向P2引物P2 1 μL(1.0 μmol/L),預(yù)混的dNTPs 2 μL (dATP、dTTP、dCTP、dGTP均為2 mmol/L),緩沖液2 μL [MgCl22mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10 mmol/L]，重組的rTaq DNA聚合酶1單位,純水9 μL, DNA制備液5 μL,反應(yīng)容量20 μL。PCR擴增參數(shù)為： 93 ℃預(yù)變性2 min下同，然后93 ℃ 1 min→55 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min，循環(huán)30次，最后一個72 ℃延長至5 min，產(chǎn)物作2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線儀下觀察結(jié)果。

1.5基因測序與分析 DNA測序委托上海鉑尚生物技術(shù)公司完成。測得序列比對與分析在無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室協(xié)助下完成。

1.6菌株親緣關(guān)系分析 對62種耐藥元件基因檢測結(jié)果作UPGMA法樣本聚類分析,由無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室完成。

2 結(jié) 果

2.1藥敏檢測結(jié)果 25株耐藥肺炎克雷伯菌10種抗菌藥物藥敏試驗檢測結(jié)果見表2。

2.2耐藥元件基因檢測結(jié)果 25株耐藥肺炎克雷伯菌每株均檢出β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因(即β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因總陽性率達(dá)100.00%)；有24株菌檢出氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因(即氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因總陽性率達(dá)96.00%)；有20株菌檢出喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因gyrA突變(即突變率為80.00%)；每株均檢出可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記基因(即可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記基因總陽性率達(dá)100.00%),各類耐藥元件基因陽性率見表3。本研究25株耐藥肺炎克雷伯菌中20株存在喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因gyrA第83位密碼子發(fā)生了同樣的突變,且均無第87位密碼子的突變(見圖1),blaKPC、rmtB基因DNA測序見圖2、3。

表1 25株耐藥肺炎克雷伯菌耐藥元件基因檢測項目
Tab.1 Resistant determinants in 25 strains of drug-resistantKlebsiellapneumoniae

基因分類基因名稱β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因(β-內(nèi)酰胺酶基因,35種)1.A類β-內(nèi)酰胺酶基因:blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1群、blaCTX-M-2群、blaCTX-M-8群、blaCTX-M-9群、blaCTX-M-25群、blaPER、blaVEB、blaGES、blaCARB、blaRTG、blaLAP、blaKPC;2.B類β-內(nèi)酰胺酶基因:blaIMP、blaVIM、blaDIM、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blaAIM、blaNDM、blaKHM、blaTMB ;3.C類β-內(nèi)酰胺酶基因:blaLEN、blaOKP、blaDHA群、blaACT/MIR群、blaLAT/CMY群、blaMOX/CMY群、blaFOX群、blaACC群;4.D類β-內(nèi)酰胺酶基因:blaOXA-1群、blaOXA-2群、blaOXA-10群氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因(15種)1.氨基糖苷類修飾酶基因:aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb、aac(6’)-Ⅱ、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、ant(4’)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、aadA5;2.靶位16S rRNA甲基化酶基因:armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因(1種)gyrA基因突變可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記基因(11種)1.整合子遺傳標(biāo)記基因:intⅠ1、intⅠ2、intⅠ3;2.轉(zhuǎn)座子遺傳標(biāo)記基因:tnpU、tnp513;3.插入序列遺傳標(biāo)記基因:ISEcp1、IS26、IS903、ISKpn6、ISKpn7;質(zhì)粒遺傳標(biāo)記基因:trbC

表2 25株耐藥肺炎克雷伯菌10種抗菌藥物藥敏試驗檢測結(jié)果
Tab.2 Result of drug sensitivity test of 25 drug-resistantKlebsiellapneumoniato 10 antimicrobial agents

藥物名稱敏感中介耐藥株數(shù)敏感率/%株數(shù)中介率/%株數(shù)耐藥率/%頭孢呋辛00.00520.002080.00頭孢噻肟00.00520.002080.00頭孢他啶00.00520.002080.00哌拉西林/他唑巴坦1560.0000.001040.00亞胺培南2392.0000.0028.00美洛培南2392.0000.0028.00慶大霉素14.0000.002496.00阿米卡星14.0000.002496.00環(huán)丙沙星520.0000.002080.00左氧氟沙星520.0000.002080.00

2.3菌株親緣關(guān)系分析 25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因的檢測結(jié)果作樣本聚類分析顯示,可分A與B 2個簇群，2個簇群中均有克隆傳播(見圖4)。

3 討 論

肺炎克雷伯菌不僅在臨床標(biāo)本中分離率高,近幾年對抗菌藥物耐藥率不斷上升，甚至出現(xiàn)了耐多粘菌素的菌株[1-6]。因此耐藥肺炎克雷伯菌是國內(nèi)感染學(xué)領(lǐng)域研究與追蹤熱點[7-14]。

本文25株耐藥肺炎克雷伯菌對第3代頭孢菌素(頭孢噻肟、頭孢他啶)、氨基糖苷類藥物(慶大霉素、阿米卡星)、喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)的敏感性均較低(敏感性均不足20.0%,見表2)，

表3 25株耐藥肺炎克雷伯菌耐藥元件基因檢測陽性率
Tab.3 Positive rates of resistance determinants in 25 drug-resistantKlebsiellapneumonia

分類基因名稱陽性株數(shù)%β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因blaTEM25100.00blaLAP1 4.00blaKPC2 8.00blaDHA群936.00blaOXA-1群312.00氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因aac(3)-Ⅱ1872.00aac(6’)-Ⅰb624.00ant(3”)-Ⅰ1560.00aph(3’)-Ⅰ936.00aadA52 8.00rmtB832.00喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因gyrA突變2080.00可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記基因intⅠ125100.00tnpU1144.00tnp5131664.00ISEcp11872.00IS262288.00IS9032288.00ISKpn62 8.00trbC1768.00

注： 未列出檢測結(jié)果者均為檢測呈陰性。

對復(fù)合制劑氨(哌拉西林/他唑巴坦)敏感率為60%尚可。對碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美洛培南)均為敏感,敏感率均達(dá)92.00%。

注：gyrA基因喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)常見為密碼子第83,87位2個位點發(fā)生突變,本文20株gyrA突變菌株均為第83位發(fā)生突變,第87位無突變發(fā)生。圖1 喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因gyrA突變分析Fig.1 gyrA mutation analysis of resistant genes to quinolones

本文菌株作了β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因共35種β-內(nèi)酰胺酶基因檢測,結(jié)果A類β-內(nèi)酰胺酶基因檢出blaTEM、blaLAP、blaKPC；B類β-內(nèi)酰胺酶基因沒有檢出；C類β-內(nèi)酰胺酶基因檢出blaDHA群；D類β-內(nèi)酰胺酶基因檢出blaOXA-1群(各項檢出率詳見表2)。25株均檢出β-內(nèi)酰胺酶基因。A類β-內(nèi)酰胺酶基因中blaKPC表達(dá)具碳青霉烯類藥物水解活性的β-內(nèi)酰胺酶,因此產(chǎn)KPC酶的菌對碳青霉烯類藥物耐藥。本研究菌株有2株呈陽性(8.00%),與碳青霉烯類藥物耐藥率相符(8.00%)。C類β-內(nèi)酰胺酶基因表達(dá)AmpC型β-內(nèi)酰胺酶，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對該類酶無抑制作用。

圖2 blaKPC測序(部分) Fig.2 Part sequence of bla KPC

圖3 rmtB測序(部分) Fig.3 Part sequence of rmtB

圖4 25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因檢測結(jié)果的樣本聚類分析(圖中數(shù)字為菌株號) Fig.4 Sample cluster analysis of 62 resistance determinants in 25 drug-resistant Klebsiella pneumonia

本組菌株9株檢出C類β-內(nèi)酰胺酶基因blaDHA群(36.00%),與哌拉西林/他唑巴坦復(fù)合制劑耐藥率40.00%大體一致。

本研究25菌株中有24株菌檢出氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因(即氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因總陽性率達(dá)96.00%),與氨基糖苷類藥物耐藥率一致。氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因有氨基糖苷類修飾酶和靶位16S rRNA甲基化酶基因二類。氨基糖苷類修飾酶的耐藥機制為, 修飾酶對氨基糖苷類藥物的化學(xué)基團進(jìn)行修飾,導(dǎo)致氨基糖苷類藥物完全失效或部分失效。氨基糖苷類藥物新藥研發(fā)思路即為改變已知氨基糖苷類修飾酶修飾部位的化學(xué)基團,使得原先氨基糖苷類修飾酶無法修飾新的氨基糖苷類藥物。16S rRNA甲基化酶的耐藥機制為, 甲基化酶對氨基糖苷類藥物作用的靶位甲基化,導(dǎo)致氨基糖苷類藥物無法作用而失效。亦即16S rRNA甲基化酶引起的耐藥較氨基糖苷類修飾酶引起的耐藥更為嚴(yán)重。16S rRNA甲基化酶的出現(xiàn)直接導(dǎo)致原先的氨基糖苷類藥物新藥研發(fā)思路無用了。本研究25菌株中有8株菌(32.00%)檢出16S rRNA甲基化酶基因rmtB,即該8株對未來的氨基糖苷類藥物新藥亦將耐藥。

喹諾酮類藥物耐藥主要原因為細(xì)菌的藥物作用靶位DNA回旋酶編碼基因gyrA突變,變異后的DNA回旋酶不與喹諾酮類藥物結(jié)合,藥物無效。gyrA基因突變常見發(fā)生于密碼子第83、87位2個位點。本文25菌株中有20株gyrA發(fā)生突變(均為第83位發(fā)生突變,第87位無突變)。

近年國內(nèi)有較多耐藥肺炎克雷伯菌耐藥基因研究報道,但主要涉及β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因和氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因的報道較多[7-14]。涉及喹諾酮類藥物耐藥相關(guān)基因的報道較少[13-14]。

本文菌株可移動遺傳元件遺傳標(biāo)記基因檢出率較高, 整合子遺傳標(biāo)記基因、轉(zhuǎn)座子遺傳標(biāo)記基因、插入序列遺傳標(biāo)記基因、質(zhì)粒遺傳標(biāo)記基因均有檢出,檢出率詳見表3。可移動遺傳元件是β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥相關(guān)基因和氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因的載體,本文菌株該三者檢出率高能互為佐證。

本文對25株耐藥肺炎克雷伯菌62種耐藥元件基因檢測結(jié)果作了樣本聚類分析,從圖4可見菌株分A與B二簇群, 2個簇群中均有克隆傳播。A簇群中有2個克隆,分別為2號株-3號株-5號株-16號株等4株、13號株-14號株等2株；B簇群中有1個克隆,為19號株-20號株等2株。其中A簇群中13號株和14號株均存在gyrA突變,同時攜帶了blaKPC、rmtB、ant(3”)-Ⅰ、intⅠ1、tnp513、ISEcp1、IS26、IS903、ISKpn6基因。13號株和14號株的gyrA突變決定它們對喹諾酮類藥物耐藥,攜帶blaKPC導(dǎo)致對碳青霉烯類藥物、第3代頭孢菌素耐藥,攜帶rmtB導(dǎo)致對氨基糖苷類藥物耐藥。這3個基因?qū)е戮陮σ痪€抗菌藥物均為耐藥。