李 萍，賈春曉，寧方堯，溫 韜，陳 延

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，廣西南寧 530004）

啤酒以麥芽為主要原料經(jīng)酵母發(fā)酵而成，富含 多種營養(yǎng)物質(zhì)（如維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物、氨基酸和酚類化合物），也被稱為液體面包，是世界上消費最廣泛和最受歡迎的酒精飲料[1]，是居民飲食的重要組成部分。與其他酒精飲料相比，啤酒中的嘌呤含量相對較高，為40～136 mg/L[2]。高嘌呤食品在體內(nèi)代謝變化容易導(dǎo)致人血液中尿酸含量增高，形成高尿酸血癥、痛風(fēng)、高血壓、糖尿病等多種代謝慢性疾病[3]。研究表明，啤酒的長期飲用是引起高尿酸血癥[4]的重要原因，啤酒與痛風(fēng)[5]之間存在高度依賴性。精釀啤酒作為高端啤酒市場的主要代表，是一種具有獨特風(fēng)味和釀造方式的個性化啤酒產(chǎn)品。近年來，我國精釀啤酒的銷量以每年40%的速度增長，很受消費者歡迎。因此，精釀啤酒中嘌呤的準確檢測具有重要意義，可為精釀啤酒的生產(chǎn)和消費提供科學(xué)指導(dǎo)。

目前，國內(nèi)外對啤酒中嘌呤的含量尚無精確、統(tǒng)一的測定方法。嘌呤主要以結(jié)合態(tài)形式存在于啤酒中，為了測定啤酒中的嘌呤含量，應(yīng)先水解4種嘌呤堿。嘌呤含量的主要檢測方法包括高效液相色譜、氣相色譜、反相離子對色譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和毛細管電泳[6-7]。其中，高效液相色譜（HPLC）是最常用的檢測啤酒等酒精飲料中4 種嘌呤的方法[8-9]。青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)營養(yǎng)研究所[10]建立了測定啤酒4 種嘌呤的高效液相色譜法，測得腺嘌呤25.95 mg/L、鳥嘌呤21.60 mg/L、次黃嘌呤435 mg/L，回收率分別為95.8 %、91.3 %、90.6 %和91.3%；江南大學(xué)[11]研究了反相離子對色譜法測定市售普通啤酒中4 種嘌呤的方法，方法的精密度為1.41 %～2.42 %，4 種嘌呤物質(zhì)的回收率為91.2%～100.3%。由于嘌呤屬弱堿性物質(zhì)，在液相色譜柱中的分離度差，僅依靠紫外檢測器的保留時間定性，會存在區(qū)分準確度低的問題。

本研究通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測了6 種市售精釀啤酒中的鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤4 種嘌呤物質(zhì)的含量。在探究樣品前處理條件的基礎(chǔ)上，通過實驗篩選適用于精釀啤酒嘌呤檢測的流動相種類、pH 值等色譜檢測條件，建立HPLC-MS/MS 測定精釀啤酒中嘌呤類物質(zhì)含量的方法，為開發(fā)低嘌呤精釀啤酒提供可靠的檢測方法和研究思路，以指導(dǎo)痛風(fēng)病人的健康膳食，同時為食品安全生產(chǎn)提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：6款精釀啤酒樣品（市售）。

試劑及耗材：腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤標準品（純度＞98.0%），中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純），美國Honeywell公司；甲酸、三氟乙酸、高氯酸、磷酸、鹽酸、硫酸（色譜純），阿拉丁試劑（上海）有限公司；試驗用水為超純水。

儀器設(shè)備：Agilent 1290 6460A 超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，美國Agilent 公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 嘌呤標準溶液的制備

將適量的腺嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤和次黃嘌呤標準品，分別置于刻度試管中，超聲溶解，制備濃度約1000 mg/L 的標準儲備溶液，在4 ℃下保存。取適量的4 種標準儲備溶液按5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L 的濃度梯度依次稀釋，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品中嘌呤酸法提取條件的優(yōu)化

將啤酒樣品進行超聲脫氣，1.0 mL 樣品放入10 mL 帶塞子的試管中，加入適量的酸溶液，搖勻，置于一定溫度下，水解一段時間后取出，冷卻至室溫。將pH 值調(diào)整為中性，定容，過0.22 μm 濾膜，保存以進行分析。

酸種類的篩選：分別采用三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液、高氯酸、鹽酸、磷酸、硫酸5 種酸溶液對樣品進行酸水解，水解結(jié)束后保存以分析嘌呤總含量。

嘌呤提取工藝的單因素試驗：分別往樣品中加入3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL 酸溶液，搖勻，分別置于80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃下，水解0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，水解結(jié)束后保存以分析嘌呤總含量。

嘌呤提取工藝的響應(yīng)面實驗：酸種類及其最佳條件通過單因素實驗確定后，以嘌呤總含量為響應(yīng)值，使用Box-Behnken 設(shè)計方法設(shè)計響應(yīng)面法，采用Design expert 8 軟件進行數(shù)據(jù)處理和回歸分析[12]。研究了酸處理條件對總嘌呤含量的影響，探索最佳工藝條件。

1.2.3 液相色譜條件優(yōu)化

將水解后的樣品，使用液相色譜儀進行分離。采用Shim-pack GIST C18（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）[13]色譜柱。在該色譜柱上，考察流動相種類（甲醇-含0.1 %甲酸和0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液、甲醇-0.5 mmol/L 乙酸銨水溶液、甲醇-水）和pH 值（3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）對分離效果的影響，流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量20 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件[14]

離子源：電噴霧離子源（ESI）。掃描模式：正離子模式。檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。離子源參數(shù)：霧化器流量3.0 L/min，加熱器流量10.0 L/min，接口溫度300 ℃，脫溶劑溫度250 ℃，DL 溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃，干燥器流量10 L/min。

1.2.5 方法學(xué)驗證

測試嘌呤標準溶液，用峰面積(Y)和樣品濃度(X)進行線性回歸。將4 種嘌呤標準溶液稀釋到不同濃度，上機檢測，以相應(yīng)濃度為3 倍信噪比(S/N)的檢測限(LOD)。根據(jù)所建立的方法，以10 μL 的注射量，將相同的混合標準劑連續(xù)注射6 次，測定方法的精密度(RSD)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 2.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析以及最小顯著差數(shù)法統(tǒng)計學(xué)顯著性分析（P＜0.05），，采用Origin8.5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸種類的選擇

本研究分別考察了精釀啤酒經(jīng)過三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液、高氯酸、鹽酸、磷酸、硫酸5 種酸溶液處理后的總嘌呤含量。如圖1 所示，采用三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液處理后，總嘌呤的含量高于其他4 種酸溶液，這說明經(jīng)過三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液水解后，樣品中嘌呤損失小，與林欽恒研究結(jié)果一致[15]。研究表明[16]，高濃度的高氯酸會降解嘌呤，磷酸只能提取鳥嘌呤和腺嘌呤，鹽酸處理會對嘌呤造成損傷。因此，采用三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液作為精釀啤酒的酸處理溶液。

圖1 酸的種類對總嘌呤含量的影響

2.2 嘌呤提取工藝的單因素實驗

選擇三氟乙酸與甲酸（1∶1）混合液對啤酒中的總嘌呤類物質(zhì)進行提取。嘌呤水解時具有不穩(wěn)定性，為了使其既能被充分水解而又不會被水解過度，需要對水解條件進行優(yōu)化。研究表明[17]，酸的用量、水解時間和水解溫度對嘌呤提取有顯著影響。如圖2A 所示，總嘌呤含量隨著料液比的增加而增加，在1∶5 時達到最高，然后趨于穩(wěn)定，因此，添加的酸的量是樣品體積的5 倍。水解時間對總嘌呤含量的影響如圖2B 所示，隨著水解時間的延長，樣品中總嘌呤含量先升高后降低，這可能是由于水解時間過長時嘌呤過度水解，導(dǎo)致總含量降低。當(dāng)水解時間為1 h 時總嘌呤含量最高，因此精釀啤酒的水解時間選擇為1 h。水解溫度對總嘌呤含量的影響如圖2C 所示，樣品中總嘌呤含量隨著水解溫度的增加而升高，并于95 ℃時達到最高，之后略有下降，可能是由于一些嘌呤堿在高溫下會被破壞。

圖2 水解條件對總嘌呤含量的影響

2.3 嘌呤提取工藝的響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取A-料液比為1∶5、B-水解溫度95 ℃、C-水解時間為1 h，采用Box-Behnken 設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面實驗，對各因素水平進行編碼，并以Y-總嘌呤含量作為響應(yīng)值。設(shè)計試驗因素及水平見表1，結(jié)果見表2。采用Design-Expert 8 軟件對表2 中的數(shù)據(jù)進行極性多元回歸擬合，得到以總嘌呤含量為響應(yīng)值的二次回歸方程模型：

表1 Box-Behnken設(shè)計的因素和水平

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

Y-總嘌呤=95.77+10.59*A+1.46*B+7.27*C+0.53*A*C+1.42*B*C-23.67*A2-2.93*B2-13.81*C2+2.86*A2*B-1.09*A*B2-5.13*A*C2

回歸方程的方差分析如表3 所示，相關(guān)系數(shù)R2為0.9112，說明嘌呤總含量的二次回歸方程與實驗結(jié)果吻合較好；模型的P 值（＜0.0001）遠小于0.01，說明響應(yīng)回歸模型已經(jīng)達到了極顯著的水平；失擬項P=0.0694＞0.05，差異不顯著，說明方程擬合良好，實驗誤差較??；該模型的校正系數(shù)R2為0.9975，表明方程擬合程度較好；模型的修正系數(shù)RAdj2=0.9906 表明該模型可以很好地反映總嘌呤含量的關(guān)系。

表3 以總嘌呤含量為響應(yīng)值的回歸方程方差分析表

在該模型中，A-料液比、B-水解溫度和C-水解時間極顯著影響總嘌呤含量（P＜0.01）；二次項A2、B2和C2極顯著影響總嘌呤含量（P＜0.01）；AB顯著影響總嘌呤含量（P＜0.05），AC 和BC 對總嘌呤含量的影響不顯著（P＞0.05）。各因素對總嘌呤含量的影響顯著情況：A-料液比＞C-水解時間＞B-水解溫度。

圖3 為由Design Expert 8 軟件繪制的三組因素交互作用的響應(yīng)面曲面和等高線。響應(yīng)面圖越陡，兩個因素對響應(yīng)值的交互作用就越明顯，反之不明顯。從圖3 中可以看出，交互項中A-料液比和B-水解溫度引起總嘌呤含量變化幅度較大，表明二者交互作用對總嘌呤含量影響顯著；A-料液比和C-水解時間、B-水解溫度和C-水解時間的交互作用引起總嘌呤含量變化幅度較小，表明二者交互作用對總嘌呤含量影響不顯著。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，得到酸水解的最佳條件為料液比1∶5.22(v/v)、溫度89.04 ℃、水解時間1.2 h。在此條件下，總嘌呤含量最大值為97.64 μg/L，優(yōu)化后的總嘌呤含量為96.77 μg/L，與模型預(yù)測值接近，較優(yōu)化前提高了近12%，說明回歸方程能準確反映各因素對嘌呤總含量的影響。

圖3 三因素交互作用對總嘌呤含量影響的響應(yīng)面結(jié)果圖

2.4 色譜條件的優(yōu)化

采用高效液相色譜法（HPLC）分離了混標中的4 個嘌呤，本研究探索了不同流動相類型和流動相的pH 值對分離效應(yīng)的影響。如表4 所示，在不同種類的流動相條件下，混標經(jīng)過色譜柱后，從左到右依次為腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤。與甲醇-水流動相體系相比，腺嘌呤和鳥嘌呤在甲醇-0.1 %甲酸、0.5 mM 乙酸銨和甲醇-0.5 mM 乙酸鈉流動相體系中的保留時間相對接近，難以完全分離。甲醇可以調(diào)節(jié)體系的極性，改變嘌呤與流動相的結(jié)合能力，破壞嘌呤物質(zhì)和配體基團的親和力，增加流動相的洗脫強度，從而提高分離精度[18]。

表4 不同流動相種類下4種嘌呤的保留時間 (min)

嘌呤屬于生物堿，均具有弱堿性，流動相的pH值對4 種嘌呤的分離效果影響較大。如表5 所示，采用甲醇-水作為流動相，分別在pH 值為3.4、3.6、3.8、4.0、4.2的條件下考察4種嘌呤的分離效果。當(dāng)pH4.0 時，分離效果較佳，因此，選擇pH4.0 作為色譜分離條件。

表5 不同pH下的嘌呤保留時間 (min)

2.6 標準曲線

將配制好的4 種嘌呤的混合標準溶液在優(yōu)化后的色譜條件下依次進樣，在正離子檢測模式下進行電離和一級質(zhì)譜掃描，得到不同濃度的混標溶液總離子流圖，見圖4。4 種嘌呤分離度良好，響應(yīng)靈敏，出峰順序和保留時間分別為腺嘌呤0.852 min、鳥嘌呤0.969 min、次黃嘌呤1.334 min、黃嘌呤1.598 min。以標準品的質(zhì)量濃度（X，μg/L）作為橫坐標，定量離子峰的面積（Y）作為縱坐標，通過線性回歸分析得出回歸方程。如表6 所示，4 種嘌呤的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.9998 以上，具有良好的相關(guān)性；檢出限為0.08～1.5 μg/L，相比于目前常用的高效液相色譜法[19]，檢測靈敏度得到了提高。

表6 4種嘌呤的標準曲線擬合情況

圖4 不同濃度的嘌呤混標總離子流圖

圖5 市售精釀啤酒中嘌呤總離子流圖

2.7 加標回收率與精密度

隨機選擇一種精釀啤酒進行加標回收試驗，在測得樣品本底值的基礎(chǔ)上，加入相對本底值20%～100%濃度的嘌呤標準品，平行測定6 次，通過IBM SPSS Statistics 2.0 計算平均回收率和相對標準偏差（δRSD）。如表7 所示，相對標準偏差（δRSD）在0.9 %～2.4 %之間。次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤的加標回收率分別為95.38 %、87.64%、79.54%、87.50%，優(yōu)化后的方法準確度符合一般檢測的要求[20]。

表7 樣品的加標回收率和精密度

2.8 樣品含量的檢測

采用優(yōu)化后的HPLC-MS/MS 方法對6 種市售精釀啤酒進行4 種嘌呤含量的測定，結(jié)果見表8。6種市售精釀啤酒中的鳥嘌呤含量最高，為1.78～3.21 mg/L，次黃嘌呤為0.42～1.05 mg/L，腺嘌呤為1.01～1.50 mg/L，黃嘌呤為0.38～1.35 mg/L，總嘌呤含量均為3.57～5.68 mg/L。相比較普通啤酒的40～136 mg/L 的總嘌呤含量[21]，精釀啤酒屬于低嘌呤飲料，更加安全可靠，適合中老年人飲用。

表8 市售精釀啤酒中嘌呤含量 (mg/L)

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC-MS/MS 法同時檢測精釀啤酒中4 種嘌呤含量的方法，經(jīng)方法學(xué)驗證，本方法完全適用于精釀啤酒中4 種嘌呤含量的測定。通過單因素和響應(yīng)面實驗優(yōu)化了嘌呤酸水解條件，研究發(fā)現(xiàn)采用三氟乙酸與甲酸(1∶1)的混合物水解樣品，料液比為1∶5.22(v/v)，溫度為89.04 ℃，水解時長為1.2 h時，精釀啤酒總嘌呤含量最高。在pH4的甲醇-水流動相體系中，4 種嘌呤的分離效果最好，HPLC-MS/MS 法同時測定精釀啤酒中次黃嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤4 種嘌呤含量最精確。該方法加標回收率大于80 %，相對標準偏差（δRSD）在0.9 %～2.4 %之間。相較HPLC 法，HPLC-MS/MS 操作方便、準確度和精密度高，并且可以一次性檢測全部嘌呤類物質(zhì)，是分析精釀啤酒中嘌呤類物質(zhì)的理想方法。

隨著人們生活質(zhì)量的提高，研究安全穩(wěn)定的低嘌呤食品符合當(dāng)下綠色飲食的發(fā)展方向，快速、靈敏的嘌呤檢測方法可為大眾健康飲食提供科學(xué)依據(jù)。采用HPLC-MS/MS 法對6 種市售精釀啤酒中4 種嘌呤含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)市售精釀啤酒中的總嘌呤含量均為3.57～5.68 mg/L，相比較普通啤酒的40～100 mg/L 的總嘌呤含量，精釀啤酒更加安全可靠，適合中老年人飲用。