宋立立 ， 董旭芳， 張連水

（1.滄州師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 滄州 061001；2.河北省水產(chǎn)養(yǎng)殖微生物菌劑技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 滄州 061001）

目前，人們飲食和保健意識(shí)日益升高，在選擇食用禽類(lèi)、畜類(lèi)產(chǎn)品時(shí)，越來(lái)越注重安全、保健及無(wú)農(nóng)藥殘留。 而抗生素在動(dòng)物飼料的泛濫使用嚴(yán)重危害動(dòng)物及人類(lèi)健康，因此發(fā)酵安全飼料產(chǎn)品，利用合適的方法發(fā)酵禽畜飼料已成為當(dāng)前重點(diǎn)任務(wù)（高樹(shù)封，2014）?？莶菅挎邨U菌廣泛分布在土壤或腐敗物中，作為一種需氧型革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)飼料常用菌種（杜曉雨等，2020）。此菌種也廣泛應(yīng)用在改善動(dòng)物腸道菌群方面（盧超等，2020）。 利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵飼料可以產(chǎn)生大量活性物質(zhì)， 從而促進(jìn)轉(zhuǎn)化吸收和增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力（蘇偉光，2020），并且研究表明用發(fā)酵飼料飼養(yǎng)的反芻動(dòng)物效果更明顯（白海等，2020）。

銀杏屬銀杏科銀杏屬， 銀杏樹(shù)作為我國(guó)特有速生珍貴藥用植物多地區(qū)均有栽培。 銀杏葉及其提取物中含大量黃酮、有機(jī)酸、多酚、多糖及氨基酸等活性物質(zhì)，藥用價(jià)值廣泛，作為禽畜類(lèi)飼料的優(yōu)選來(lái)源，為動(dòng)物的代謝及生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)（李志平等，2021；宋立立等，2020）。 但若直接將銀杏葉添加到飼料中飼養(yǎng)動(dòng)物，因口感味道不佳，動(dòng)物取食性不高（高樹(shù)封，2014）。本試驗(yàn)采用從銀杏葉粉當(dāng)中直接提取黃酮、多酚、多糖與枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)室固態(tài)發(fā)酵銀杏葉，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，在最適發(fā)酵工藝條件下測(cè)定黃酮、多酚及多糖的含量對(duì)比，旨在改善銀杏葉口感來(lái)喂養(yǎng)動(dòng)物。 一方面發(fā)揮銀杏葉的價(jià)值，另一方面提高家禽、家畜的生產(chǎn)率及產(chǎn)品安全性， 為以后工業(yè)微生物發(fā)酵銀杏葉制備飼料添加劑做出理論指導(dǎo)。

1 試驗(yàn)材料及設(shè)備

1.1 試驗(yàn)菌株 枯草芽孢桿菌（保藏菌種）。

1.2 試驗(yàn)材料及藥品試劑 試驗(yàn)材料： 銀杏葉粉、豆粕、麩皮；藥品試劑：牛肉膏、瓊脂、酵母膏、蛋白胨、L-酪氨酸、干酪素、吐溫（20、40、60、80）、無(wú)水乙醇、NaOH、HCl、NaCl、NaNO2、Al （NO3）3、MgSO4、K2HPO4、KH2PO4、福林酚試劑、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等。

1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基： 牛肉膏、 蛋白胨、瓊脂、NaCl。 種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%（m/V）、pH 7.4、121 ℃滅菌20 min。 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：每個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)銀杏葉粉7 g、豆粕1.5g、麩皮1.5 g、營(yíng)養(yǎng)液20 mL、121 ℃滅菌30 min。接菌量5%。 營(yíng)養(yǎng)液：蛋白胨10.0 g/L、K2HPO46.0 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、酵母膏0.4 g/L、自然pH。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株活化和培養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)室的菌種轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基， 置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃條件下培養(yǎng)22 h，使其活化?；罨玫慕臃N于種子培養(yǎng)基37 ℃、160 r/min 進(jìn)行培育， 之后以5%接種量接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。

2.2 粗酶液的制取 將產(chǎn)物至于室內(nèi)通風(fēng)處風(fēng)干， 用分析天平量1 g 樣品至100 mL 錐形瓶中，20 mL 無(wú)菌生理鹽水和3 顆無(wú)菌小球， 放置搖床37 ℃、200 r/min 條件下30 min 后進(jìn)行離心，得粗酶液。

2.3 蛋白酶活測(cè)定 以酪蛋白為底物，參照國(guó)標(biāo)Folin-酚法測(cè)定蛋白酶活性（楊旭等，2014）。

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制：取適量L-酪氨酸和蒸餾水，配制濃度為0.1 mg/mL 的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液， 分別取0、1、2、3、4、5、6 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL。 分別依次加入NaCO3、Folin-酚試劑，搖勻，放入水浴鍋內(nèi)。 顯色20 min 后，測(cè)OD 值。 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)， 得回歸線(xiàn)方程：y=0.0466x+0.0233，R2=0.9969。

2.4 單因素試驗(yàn) 以蛋白酶的活性為指標(biāo)，探究固態(tài)發(fā)酵銀杏葉的溫度、時(shí)間、接菌量、營(yíng)養(yǎng)液酸堿度以及表面活性劑因素的關(guān)系。

2.4.1 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酶活力的影響 參照原始條件，分別設(shè)置四批發(fā)酵，溫度分別為31、34、37、40 ℃。 做三組平行，檢測(cè)每個(gè)發(fā)酵溫度條件下培養(yǎng)基的蛋白酶活， 確定培養(yǎng)基的最適發(fā)酵溫度。

2.4.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酶活力的影響 參照原始條件，設(shè)定發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60 h，做三組平行， 檢測(cè)每個(gè)發(fā)酵時(shí)間條件下培養(yǎng)基蛋白酶活，確定培養(yǎng)基的最適發(fā)酵時(shí)間。

2.4.3 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酶活力的影響 參照原始條件，改變接菌的數(shù)量分別為6%、8%、10%、12%，做三組平行。分別檢測(cè)各種條件下的蛋白酶性質(zhì)，確定出發(fā)酵條件的最適接菌數(shù)量。

2.4.4 營(yíng)養(yǎng)液pH 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酶活力的影響參照原始條件， 改變營(yíng)養(yǎng)液酸堿度的值分別為6.5、7.0、7.5、8.0。 分別檢測(cè)各種條件下蛋白酶活，從而找出最優(yōu)的發(fā)酵酸堿度（冒鑫哲等，2020）。

2.4.5 不同表面活性劑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酶活力的影響 參照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加0.5%的不同系列吐溫；分別檢測(cè)不同系列吐溫下的酶活力，確定出培養(yǎng)基的最適發(fā)酵活性劑（王東等，2016）。

2.5 黃酮、多酚含量的提取及測(cè)定方法

2.5.1 黃酮、多酚提取方法 分別取出3 g 發(fā)酵后的產(chǎn)物和銀杏葉粉，以C2H5OH 作為萃取劑，在1:30的料液比條件下180 W 超聲30 min，將所得混合液進(jìn)行抽濾， 即得到待測(cè)樣品溶液 （成宏斌等，2021）。

2.5.2 黃酮含量的測(cè)定 量取待測(cè)液5 mL 于玻璃試管中。 各試管中分別加入1 mL 亞硝酸鈉搖勻靜置6 min。 加入1 mL 硝酸鋁溶液，搖勻放置6 min，再加入NaOH 10 mL，用蒸餾水定容至25 mL，放置15 ～20 min。 設(shè)置波長(zhǎng)為510 nm，測(cè)OD 值（A）。 根據(jù)y=8.3884x+0.002，R2=0.9993 得黃酮濃度，計(jì)算含量（圖1）。

2.5.3 多酚含量得測(cè)定 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：取沒(méi)食子酸配制濃度為0.1 mg/mL 的液體。 用儀器分別取0 ～1.0 mL （等差為0.2 mL） 溶液于試管中， 分別添加1 mL Folin-酚試劑， 搖勻放置5 min。 加入NaCO33 mL，混勻定容至10 mL。 遮光30 min，760 nm 處測(cè)吸光度（姜湘英等，2020），得出回歸方程y=189.1x-0015， 相關(guān)系數(shù)R2=0.9978（圖2）。 取樣品1 mL 于試管，空白管加蒸餾水做對(duì)照，分別添加1 mL Folin-酚試劑、20%NaCO33 mL，定容至10 mL。搖勻遮光30 min。將測(cè)得的OD 值代入方程得多酚濃度，找出含量。

圖2 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.6 多糖的提取及測(cè)定 取葡萄糖配制成0.04mg/mL溶液，分別取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于8 支試管， 分別加水至2.0 mL， 添加1 mL 苯酚，混勻。再加入濃H2SO4，靜置20 min，測(cè)OD 值。曲線(xiàn)圖和方程見(jiàn)圖3。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

分別稱(chēng)取2 g 發(fā)酵產(chǎn)物和銀杏葉粉，加入20 mL蒸餾水煮沸1 h， 八層紗布過(guò)濾后5000 r/min 離心。 取上清液加等體積20% CCl3COOH 后搖勻于冰箱冷藏30 min。 高速離心后取上清液按1：4 加入80% C2H5OH， 混勻放置24 h。 繼續(xù)離心留沉淀，用無(wú)水C2H5OH 洗下并烘干。 將干燥后的物質(zhì)溶解至100 mL， 取2 mL 液體， 加入6%苯酚1 mL，混勻。 添加濃H2SO4，依照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方法，測(cè)OD 值代入方程，查出濃度，計(jì)算多糖含量（秦令祥等，2018）。

3 結(jié)果分析

3.1 單因素分析

3.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)蛋白酶活力的影響 由圖4 可見(jiàn)，從31 ℃到37 ℃，隨著發(fā)酵溫度的上升，蛋白酶活逐漸升高。 到37 ℃表現(xiàn)最高酶活力為42.41 U/mL。繼而隨著培養(yǎng)箱設(shè)置溫度越來(lái)越高， 酶活力開(kāi)始逐漸下降。 由此確定發(fā)酵銀杏葉最合適的培養(yǎng)箱溫度為37 ℃。

圖4 溫度對(duì)蛋白酶活的影響

3.1.2 時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響 設(shè)定發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間分別為20 ～60 h（等差為12 h）四個(gè)梯度，從前兩天的48 h 期間，活力顯著提高，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至60 h， 蛋白活力由最高46.98 U/mL 下降至40.55 U/mL。由此確定枯草芽孢桿菌影響銀杏葉發(fā)酵的最佳時(shí)長(zhǎng)為48 h（圖5）。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蛋白酶活的影響

3.1.3 接種量對(duì)蛋白酶活力的影響 改變種子液接菌數(shù)量， 發(fā)現(xiàn)不同接種量相對(duì)于發(fā)酵時(shí)間和溫度來(lái)說(shuō)， 其對(duì)酶的活力影響較大。 從6%升高到10%的接菌標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，酶活力持續(xù)上升。接菌數(shù)量達(dá)到10%的時(shí)候，活力達(dá)頂峰為83.64 U/mL（圖6）。隨著接菌量的提高， 推測(cè)錐形瓶?jī)?nèi)營(yíng)養(yǎng)或氧氣含量不足，其可能為酶活變低的原因。 由此，可確定出發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)接菌的數(shù)量為10%。

圖6 接種量對(duì)蛋白酶活的影響

3.1.4 營(yíng)養(yǎng)液pH 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酶活力的影響由圖7 可知， 關(guān)系到蛋白活力的最顯著營(yíng)養(yǎng)液酸堿度為7.5。 調(diào)節(jié)不同pH，由pH 6.5 時(shí)的蛋白酶活為44.36 U/mL，營(yíng)養(yǎng)液pH 調(diào)節(jié)到7.5 時(shí)的蛋白酶活為64.36 U/mL。 繼續(xù)提高酸堿度為8 時(shí)，蛋白酶活反而下降。

圖7 營(yíng)養(yǎng)液pH 對(duì)蛋白酶活的影響

3.1.5 活性劑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品中酶活力的影響 由圖8 可知， 不同系列的吐溫產(chǎn)品對(duì)蛋白酶活的影響不明顯，添加吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60 發(fā)酵條件下，測(cè)得蛋白酶活相似。 吐溫-80 效果較顯著，此時(shí)蛋白酶活力為53.61U/mL。

圖8 表面活性劑對(duì)蛋白酶活的影響

3.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)， 對(duì)發(fā)酵銀杏葉的結(jié)果影響最顯著的三個(gè)因素，分別為接種量、營(yíng)養(yǎng)液pH 和發(fā)酵時(shí)間。 因此， 借助Desgin Expert 11 軟件對(duì)響應(yīng)面進(jìn)行設(shè)計(jì)，進(jìn)而對(duì)三因素三水平進(jìn)行分析（表1）。

表1 響應(yīng)面因素與水平

對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵銀杏葉產(chǎn)酶的三個(gè)因素進(jìn)行17 組分析試驗(yàn)， 繼續(xù)測(cè)定蛋白酶活。 使用Desgin Expert 11 對(duì)測(cè)驗(yàn)所得的響應(yīng)值蛋白酶活力進(jìn)行二次多變量回歸擬合，得二次多元方程為Y =103.86 +0.24A -0.4025B +1.6C -0.885AB -1.84AC+0.755BC-6.82A2-9.08B2-3.72C2。 其中Y為預(yù)測(cè)的蛋白酶活值，A 為接種量，B 為營(yíng)養(yǎng)液pH，C 為發(fā)酵時(shí)間。

根據(jù)軟件分析結(jié)果顯示，如表2，預(yù)測(cè)蛋白酶活的最大值可達(dá)到104.033 U/mL，各因素分別為A=-0.0103%、B=-0.0124、C=0.2149， 換算實(shí)際值為：接種量9.9763%、營(yíng)養(yǎng)液pH 7.4924、發(fā)酵時(shí)間50.6633 h。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

3.2.1 回歸分析 針對(duì)二次多變量回歸方程顯著性和方差結(jié)果進(jìn)行分析（表3）。 此模型P=0.0005（P＜0.01），擬失項(xiàng)P=0.8503（P＞0.05）。 此結(jié)果可以得出結(jié)論，此模型回歸極為顯著，而擬失項(xiàng)不顯著。該模型的R2=0.9572，表示擬合程度較好，可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)不同發(fā)酵條件下所產(chǎn)生的蛋白酶活。

表3 二次模型方差分析

3.2.2 各因素等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面 使用軟件Design-Expert 11 對(duì)三個(gè)因素分析， 導(dǎo)出關(guān)于接種量、營(yíng)養(yǎng)液pH 以及時(shí)間三個(gè)因素之間模型的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面圖。交互作用的顯著性可以利用等高線(xiàn)圖來(lái)反映。 等高線(xiàn)圖結(jié)果顯示越扁，代表交互作用越顯著；等高線(xiàn)圖越近乎圓環(huán)時(shí)，則代表其交互作用不顯著（陳作國(guó)等，2018；王東等，2016）。

因此由圖9 ～11 可以看出， 交互作用中，營(yíng)養(yǎng)液pH 和發(fā)酵時(shí)間最為顯著， 接種量和發(fā)酵時(shí)間影響次之，而接種量和營(yíng)養(yǎng)液pH 則最不顯著。

圖9 接種量-營(yíng)養(yǎng)液pH影響蛋白酶活等高線(xiàn)圖、響應(yīng)曲面圖

圖10 接種量-發(fā)酵時(shí)間影響蛋白酶活等高線(xiàn)圖、響應(yīng)曲面圖

圖11 營(yíng)養(yǎng)液pH-發(fā)酵時(shí)間影響蛋白酶活等高線(xiàn)圖、響應(yīng)曲面圖

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了檢測(cè)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化后近似值的培養(yǎng)基（接種量10%、營(yíng)養(yǎng)液pH 7.5、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間50.67 h）做3 組平行發(fā)酵試驗(yàn)， 并繼續(xù)測(cè)定枯草芽孢桿菌發(fā)酵銀杏葉培養(yǎng)基的蛋白酶活力大小， 結(jié)果分別為104.48、101.19、100.38 U/mL，平均值為102.02 U/mL。 驗(yàn)證結(jié)果表明， 發(fā)酵后測(cè)得蛋白酶活實(shí)際值與此響應(yīng)面優(yōu)化預(yù)測(cè)值相差較小。 該優(yōu)化后的模型非常好地預(yù)測(cè)了實(shí)際蛋白酶活力值，預(yù)測(cè)結(jié)果可信。

3.4 最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)物及直接測(cè)定銀杏葉黃酮、多酚、多糖含量 結(jié)合單因素試驗(yàn)，選取最優(yōu)條件下的發(fā)酵培養(yǎng)基，再次進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。取發(fā)酵產(chǎn)物和銀杏葉粉，提取并測(cè)定黃酮、多酚、多糖三者的含量。 結(jié)果表明，最優(yōu)發(fā)酵條件下，黃酮、多酚、多糖含量分別為13.94、1.2、6.26 mg/g；對(duì)銀杏葉粉直接提取黃酮、多酚、多糖，其三者含量分別為15.43、1.37、7.2 mg/g。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌發(fā)酵銀杏葉制備飼料添加劑，可以很好地利用銀杏葉的價(jià)值。 黃酮類(lèi)化合物可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育， 影響動(dòng)物體內(nèi)性激素的分泌和代謝及其他激素的調(diào)節(jié)，可提高免疫機(jī)能，促進(jìn)健康。 多酚可以改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、預(yù)防疾病，屬于純天然無(wú)污染無(wú)耐藥性的抗生素代替物，多糖可以提高飼料的適口性。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)銀杏葉粉直接提取黃酮、多酚、多糖并測(cè)定其含量， 以及利用枯草芽孢桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室固態(tài)發(fā)酵， 改變發(fā)酵工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)初步對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，利用Design-Expert 11軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化。 最終得出結(jié)果，對(duì)銀杏葉粉直接提取黃酮、多酚、多糖，其三者含量分別為15.43、1.37、7.2 mg/g；枯草芽孢桿菌發(fā)酵銀杏葉的蛋白酶活最佳條件為接種量9.98%、營(yíng)養(yǎng)液pH 7.49、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間50.66 h，結(jié)合單因素試驗(yàn)， 發(fā)酵溫度為37 ℃， 表面活性劑為0.05%的吐溫-80， 該發(fā)酵狀態(tài)下測(cè)得蛋白酶活為106.78 U/mL，提取并測(cè)得黃酮、多酚、多糖含量分別為13.94、1.2、6.26 mg/g。試驗(yàn)結(jié)果顯示，發(fā)酵后物質(zhì)含量有所下降，但是相差不大。而且發(fā)酵后的飼料適口性更好， 有利于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。