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        豆粕飼料中添加丁酸鈉對(duì)大口黑鱸腸道菌群組成的影響

        2023-12-16 11:53:40高世陽(yáng)田二杰孫曉輝趙曉雨陳衛(wèi)軍
        中國(guó)飼料 2023年23期

        常 闊, 高世陽(yáng), 田二杰, 孫曉輝, 趙曉雨, 孫 平 , 陳衛(wèi)軍

        (1.河南科技大學(xué),河南 洛陽(yáng) 471000;2.洛陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,河南 洛陽(yáng) 471023)

        魚粉因富含蛋白質(zhì)、氨基酸組成平衡、適口性好等原因, 一直以來(lái)是肉食性魚類飼料中不可或缺的一種飼料原料(Hodar 等,2020)。 然而,隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展以及魚粉的資源量有限(Jannathulla 等,2019),導(dǎo)致魚粉供不應(yīng)求,價(jià)格飆升,養(yǎng)殖的成本也隨之提高。為了解決魚粉短缺和其價(jià)格高昂的問(wèn)題, 許多植物性原料被用于替代魚粉。豆粕是大豆提取油脂后的副產(chǎn)物,因蛋白質(zhì)含量高、來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉,被認(rèn)為是最有希望替代魚粉的植物性蛋白源(Robinson 等,1994)。豆粕替代魚粉降低了養(yǎng)殖成本, 在一定程度上緩解了魚粉短缺的壓力,然而,其在水產(chǎn)飼料中的添加也造成了一些問(wèn)題, 如改變魚類腸道內(nèi)微生物的菌群組成與結(jié)構(gòu),造成腸道菌群失調(diào)(Zhou 等,2018;Miao 等,2018)。 腸道菌群通過(guò)自身或其代謝產(chǎn)物參與魚類的營(yíng)養(yǎng)代謝、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程,其穩(wěn)態(tài)對(duì)魚體生長(zhǎng)和健康具有重要作用(Yukgehnaish 等,2020)。因此,在豆粕替代魚粉的過(guò)程中, 尋求改善魚類腸道菌群穩(wěn)態(tài)的營(yíng)養(yǎng)策略已迫在眉睫。

        丁酸鈉是丁酸的鈉鹽, 被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)飼料, 具有促進(jìn)魚體生長(zhǎng)、 抗菌、 抗炎等功效(Abdel-Latif 等,2020)。 研究表明,丁酸鈉可用于改善水產(chǎn)動(dòng)物的腸道菌群組成, 如羅非魚(Alves Jesus 等,2021)、大菱鲆(Liu 等,2019)和紅擬石首魚(Yamamoto 等,2021)等。大口黑鱸(Micropterus salmoides) 是一種具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和深受消費(fèi)者喜愛(ài)的淡水肉食性魚, 其對(duì)魚粉有著很強(qiáng)的依賴性, 飼料中魚粉的用量一般在40% ~ 55%(Yang 等,2022)。 已有研究結(jié)果表明, 豆粕替代30%魚粉會(huì)造成大口黑鱸腸道菌群紊亂 (He 等,2020)。為此,本研究以大口黑鱸為研究對(duì)象,擬在豆粕飼料中添加丁酸鈉, 研究丁酸鈉對(duì)其腸道菌群組成的影響, 以期為丁酸鈉在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)飼料 本試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)處理組: 對(duì)照組、豆粕組、丁酸鈉組。 豆粕組替代對(duì)照組飼料中30%的魚粉; 丁酸鈉組是在豆粕飼料的基礎(chǔ)上添加0.2%的丁酸鈉。 飼料組成與營(yíng)養(yǎng)水平見表1。各組原料均粉碎并通過(guò)60 目篩,逐級(jí)混合后,由環(huán)模顆粒機(jī)制成直徑為2.0 mm 的硬顆粒沉性飼料,室溫風(fēng)干并儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱備用。

        1.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)用大口黑鱸魚苗購(gòu)于廣東省某魚廠,為同一批繁殖的健康苗種。試驗(yàn)于河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院開展。對(duì)魚體進(jìn)行消毒后,于養(yǎng)殖間暫養(yǎng)7 d, 待其適應(yīng)環(huán)境后選取體質(zhì)量(6.30±0.01)g、 健康狀況良好的大口黑鱸180 尾,隨機(jī)分為3 組,每組3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20 尾。正式試驗(yàn)在透明玻璃缸(60 cm×40 cm×50 cm)中進(jìn)行,每日9:00 和17:00 投喂2 次,每次投喂至表觀飽食,養(yǎng)殖周期持續(xù)56 d。養(yǎng)殖期間水溫(25.5±0.6)℃,pH 為7.0 ~ 7.8, 溶氧量大于6 mg/L,氨氮和亞硝酸鹽濃度低于0.1 mg/L。

        1.3 樣品采集與分析測(cè)定

        1.3.1 樣品采集 投喂最后一餐后6 h, 每缸隨機(jī)取3 尾魚,使用三氯叔丁醇(5 g/L)安樂(lè)死。 隨后用消毒后的解剖剪剖腹,取出整個(gè)腸道。使用酒精棉擦拭腸管外壁后, 將全腸的內(nèi)容物收集在無(wú)菌凍存管中,液氮速凍,置于-80 ℃保存待測(cè)。

        1.3.2 基因組DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 采用十六烷基三甲基溴化銨/十二烷基硫酸鈉法提取樣品總基因組DNA。提取的DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 濃度和純度。 根據(jù)DNA 濃度用無(wú)菌水稀釋成1 ng/μL,用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。

        以16S rRNA 的V3 和V4 區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)合成帶有barcode 的特異引物。引物序列為338F(5′-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。 PCR 反應(yīng)在ABI GeneAmp9700 型上進(jìn)行,反應(yīng)總體積為30 μL, 包含15 μL PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix、0.2 μmol 正反向引物和10 ng 模板DNA。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s, 共30個(gè)循環(huán), 最后72 ℃延伸5 min。 將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后,用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),用Gene JET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific)純化,QuantiFlourTM-ST (Promega 公司)定量。 使用NEB NextUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 試劑盒生成測(cè)序文庫(kù), 并在Illumina MiSeq平臺(tái)上測(cè)序。

        使用QIIME 軟件對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用97%相似度的分類單元(OUT),利用mothur 軟件做樣品稀釋性曲線。 采用基于β 多樣性距離的聚類分析和非度量多維尺度分析(NMDS) 描述不同樣本間的相似性和差異關(guān)系。采用STAMP 軟件比較不同處理腸道微生物在門和屬水平上的相對(duì)豐度。 利用PICRUSt 菌群代謝功能預(yù)測(cè)工具比對(duì)基因功能譜數(shù)據(jù)庫(kù), 推測(cè)微生物群落的功能類別豐度信息。

        1.4 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。 使用SPSS v.20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析; 利用Turkey-Kramer 事后檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較。P<0.05 表示存在顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品測(cè)序質(zhì)量分析 每個(gè)處理隨機(jī)抽取三個(gè)樣本, 使用稀釋性曲線檢測(cè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性(圖1)。 當(dāng)測(cè)序數(shù)量大于4000 條時(shí),不同處理組大口黑鱸腸道菌群稀釋性曲線趨于平緩。測(cè)序覆蓋率≥97%, 表明對(duì)各組的大口黑鱸腸道微生物菌群的測(cè)序深度合理, 能覆蓋樣品中的絕大部分物種。

        圖1 樣品稀釋曲線

        2.2 菌群結(jié)構(gòu)相似性分析 如圖2 所示,從大口黑鱸腸道內(nèi)容物中共鑒定獲得細(xì)菌21 個(gè)綱,88個(gè)目, 374 個(gè)屬,691 個(gè)OTU。 對(duì)照組特有綱、目、屬和OUT 的數(shù)量分別為1、9、62 和162; 豆粕組特有綱、 目、 屬和OTU 的數(shù)量分別為1、6、39 和92;丁酸鈉組特有綱、目、屬和OTU 的數(shù)量分別為2、6、58 和151。 對(duì)照組和豆粕組共享12 個(gè)綱、48個(gè)目、134 個(gè)屬和181 個(gè)OTU。對(duì)照組和丁酸鈉組共享15 個(gè)綱、55 個(gè)目、154 個(gè)屬和202 個(gè)OTU。

        圖2 大口黑鱸腸道菌群Venn 圖

        為了進(jìn)一步比較不同處理組腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異, 采用基于菌群β 多樣性的聚類分析和NMDS 分析各處理組腸道菌群樣品。聚類分析中,對(duì)照組和豆粕組樣品間的距離較遠(yuǎn), 而對(duì)照組和丁酸鈉組樣品間的距離較短(圖3A)。與聚類樹結(jié)果類似,NMDS 分析中,對(duì)照組和丁酸鈉組樣品分布于坐標(biāo)軸的左側(cè), 而豆粕組樣品分布于坐標(biāo)軸的右上側(cè)(圖3B)。

        圖3 大口黑鱸腸道菌群相似性分析

        2.3 菌群組成及其相對(duì)豐度分析 各處理組腸道所含的菌門主要為藍(lán)藻門 (Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)(圖4A)。 相比于對(duì)照組,豆粕組厚壁菌門、 擬桿菌門、 綠彎菌門(Chloroflexi)和糖化細(xì)菌門(Saccharibacteria)的相對(duì)豐度分別降低了89.4%、81.7%、87.7%和100.0%(P<0.05), 軟壁菌門的相對(duì)豐度升高了4797.0%(P<0.05)。 相比于豆粕組,丁酸鈉組軟壁菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度分別降低和升高了98.3%和442.8%(P<0.05)(圖4B)。

        圖4 大口黑鱸腸道菌群在門水平上的相對(duì)豐度

        大口黑鱸所含的菌屬主要為支原體屬(Mycoplasma)、虛構(gòu)芽孢桿菌屬(Fictibacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、 魏斯氏菌屬(Weissella)、Alpinimonas 屬、紅球菌屬(Rhodococcus)、束村氏菌屬(Tsukamurella)、戈登氏菌屬(Gordonia)、 糞桿菌屬 (Faecalibacterium) 和擬桿菌屬(Bacteroides)(圖5A)。 相比于對(duì)照組,豆粕組虛構(gòu)芽孢桿菌屬、 乳桿菌屬、 魏斯氏菌屬和片球菌屬(Pediococcus) 相對(duì)豐度分別降低了90.0%、95.6%、71.2%和73.9%(P<0.05),支原體屬相對(duì)豐度增加了5073.0%(P<0.05)。 相比于豆粕組, 丁酸鈉組支原體屬相對(duì)豐度降低了98.3%(P<0.05), 擬桿菌屬和葡萄球菌屬(Staphylococcus)相對(duì)豐度分別升高了911.1%和569.0%(P<0.05)。

        圖5 大口黑鱸腸道菌群在屬水平上的相對(duì)豐度

        2.4 腸道菌群功能預(yù)測(cè) 利用PICRUSt 將不同處理組大口黑鱸腸道菌群的16S RNA 基因比對(duì)到EggNOG (Evolutionary Genealogy of Genes:Non-supervised Orthologous Group)數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行菌群功能預(yù)測(cè)。 COG 功能分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,相比對(duì)照組,豆粕組大口黑鱸腸道菌群在“氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝”“細(xì)胞運(yùn)動(dòng)”“RNA 加工修飾”“脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)代謝”“細(xì)胞骨架”“翻譯后修飾, 蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白”“能量生成和轉(zhuǎn)換”“翻譯、 核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成” 等功能類群的相對(duì)豐富顯著升高,在“抵御機(jī)制”“碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)代謝”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”“復(fù)制、重組和修復(fù)”功能類群的相對(duì)豐富顯著降低(P<0.05)。 相比于豆粕組,丁酸鈉組大口黑鱸腸道菌群在 “復(fù)制、 重組和修復(fù)”功能類群的相對(duì)豐度顯著升高,在“次級(jí)代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝”功能類群的相對(duì)豐度顯著降低(圖6)(P<0.05)。

        圖6 大口黑鱸腸道微生物COG 功能分析

        3 討論

        魚體腸道微生物菌群及其代謝產(chǎn)物與腸道功能密切相關(guān),在宿主代謝、營(yíng)養(yǎng)、生理和免疫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用(Gerritsen 等,2011)。 本研究中,豆粕替代魚粉嚴(yán)重改變了腸道菌群組成,這與大口黑鱸(He 等,2020)和烏鱧(Miao 等,2018)的研究結(jié)果一致。 然而, 豆粕替代魚粉飼料中添加0.2%丁酸鈉,在一定程度上恢復(fù)了腸道菌群的組成。 菌群Venn 圖、聚類樹和NMDS 分析結(jié)果均表明, 丁酸鈉組和對(duì)照組魚體腸道菌群的組成更加接近,這表明丁酸鈉有助于腸道菌群的恢復(fù)。

        厚壁菌門是魚類腸道菌群的主要門類, 可增強(qiáng)腸道屏障功能,減輕炎癥反應(yīng),包括乳桿菌、虛構(gòu)芽孢桿菌、糞桿菌、魏斯氏菌片球菌和葡萄球菌等菌屬(Yukgehnaish 等,2020;Kaur 等,2019)。 乳桿菌、虛構(gòu)芽孢桿菌、魏斯氏菌、片球菌和葡萄球菌是重要的乳酸菌 (Ringo/等, 1998;Vandenbergh等,1993);糞桿菌能夠產(chǎn)生丁酸(Macfarlane 等,2012)。 擬桿菌也可產(chǎn)生乳酸。 乳酸菌和丁酸與魚體腸道健康密切相關(guān), 可增強(qiáng)魚體生長(zhǎng)和免疫(Abdel-Latif 等,2020;Ringo 等,2010)。 本研究中, 豆粕替代魚粉顯著降低了厚壁菌門、 乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和片球菌屬的相對(duì)豐度。然而豆粕飼料中添加0.2%的丁酸鈉顯著增加了厚壁菌門、擬桿菌屬和萄球菌屬的相對(duì)豐度, 表明丁酸鈉可增加腸道有益菌含量,改善腸道健康。

        支原體屬于軟壁菌門, 是已知最小的能夠自我復(fù)制的自由生活微生物之一(Sellyei 等,2021),也是導(dǎo)致腸道相關(guān)疾?。ㄈ缒c炎)的潛在致病細(xì)菌(Gnanadurai 等,2020;Razin 等,1998)。 豆粕替代魚粉顯著提高了大口黑鱸腸道菌群中支原體的相對(duì)豐度, 這與大口黑鱸之前的研究結(jié)果一致(Yang 等,2022;He 等,2020)。 支原體相對(duì)豐度升高在魚類中已被證明與炎癥存在極顯著正相關(guān)(Chen 等,2023),可能是造成豆粕誘導(dǎo)性腸炎的主要因素。本研究中,相比對(duì)照組,豆粕飼料大口黑鱸在“抵御機(jī)制”功能類群的相對(duì)豐度顯著降低,這可能與豆粕飼料易引起腸炎和降低魚體疾病抵抗力等現(xiàn)象有關(guān) (Urán 等,2008;Krogdahl等,2000)。 本研究中,豆粕飼料添加丁酸鈉顯著降低了支原體相對(duì)豐度,表明丁酸鈉可能具有緩解豆粕誘導(dǎo)性腸炎的作用。丁酸鈉降低支原體相對(duì)豐度的現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他水產(chǎn)動(dòng)物中,如鯽魚(Li 等,2022) 和攝食高脂飼料的大口黑鱸(Chen等,2023)。

        4 結(jié)論

        本研究結(jié)果表明,在豆粕日糧中添加0.2%的丁酸鈉可以有助于大口黑鱸腸道菌群恢復(fù), 增加腸道有益菌含量,抑制腸道有害菌增殖,保護(hù)腸道健康。

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