檀興慧，王文義，盧淑珍，吳水生，李德森,*，周 奕,*

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學科技創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化中心，福建福州 350122）

衰老是醫(yī)學史上一個重大的課題，據(jù)統(tǒng)計，2020年中國老齡化人口約占比18.73%，2010～2022 年間，65 歲及以上老年人每年約增加717 萬人，年均增長率為4.83%[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，衰老與自由基、端粒酶等關聯(lián)[2]。自由基學說指出機體衰老、臟器衰化會伴隨集體防御系統(tǒng)中CAT、HO-1、SOD、GSHPx 等抗氧化酶的合成減少和活性降低，代謝產(chǎn)物MDA 過量生成，機體產(chǎn)生和清除自由基的平衡被破壞，自由基堆積[3]，可見，清除自由基是抗衰老的關鍵。

板栗在我國種植分布廣、產(chǎn)量大[4]，其產(chǎn)區(qū)北起遼寧、吉林，南至廣東、廣西均有分布[5]。板栗富含蛋白質(zhì)、淀粉、多糖、維生素C 等多種營養(yǎng)成分，其皮、果實等部位均可作藥用[6]，具有藥食兩用價值，長期食用板栗不僅養(yǎng)胃健脾、補腎養(yǎng)顏，對老年慢性疾病，如腰膝酸軟、腿腳不遂、筋骨疼痛等也有良好的作用[7]。此前，學者多圍繞板栗栽培[8]、種資源[9]、品質(zhì)評價[10]等方面開展研究。而其藥用價值開發(fā)與藥理作用研究尚處于探索階段，已有研究表明板栗中的三萜、多糖、黃酮苷等成分具有抗菌、抗糖尿病、抗炎、抗凝血、抗癌、抗疲勞等多種生物活性[6]，其中多糖、維生素C 等成分抗氧化效果良好[11]。多篇報道顯示，板栗有清除氧化自由基能力[12-13]，具有潛在延緩氧化衰老的價值。

目前，板栗主要加工產(chǎn)品包括板栗飲料、板栗酒、板栗糕點、板栗花純露等，但其易褐變、霉變，難以長期保存及深加工[14]，目前存在產(chǎn)品總量小，市場上占有率低等劣勢，亟需加大板栗功能食品研發(fā)。板栗的加工工藝多樣，不同產(chǎn)地、不同加工方式、不同產(chǎn)地和不同加工方式的交互作用對板栗的營養(yǎng)成分和質(zhì)構(gòu)特性均有極顯著影響[15-16]，現(xiàn)有的板栗產(chǎn)品研發(fā)注重其風味口感，對于其藥用價值的挖掘尚不深入。因此，如何改變加工方式保留其營養(yǎng)價值是開發(fā)板栗功能產(chǎn)品的關鍵。基于此，在中醫(yī)理論指導下，本研究通過搭配藥食兩用中藥（陳皮、黃精、山楂，分別為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco 的干燥成熟果皮、百合科黃精屬植物黃精Polygonatum sibiricumRed.的根莖、薔薇科山楂屬植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥果實），輔以中藥炮制技術蒸制加工，獲得新的板栗風味食品，增強其入腎、抗氧化應激作用，旨在獲得具有更好的抗氧化抗衰老作用的板栗加工品，為板栗開發(fā)利用提供參考，促進板栗抗氧化抗衰老功能的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮品栗仁 唐山食栗派有限公司，批號2022 0219；陳皮飲片、黃精飲片 均購自安國市一方藥業(yè)有限公司，批號分別為：21080902、21060203；山楂飲片 北京仟草中藥飲片有限公司，批號：220217008；SPF 級ICR 小鼠 78 只，雄性，6～8 周齡，體質(zhì)量22～25 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于SPF 級動物實驗室，許可證號：SCXK（閩）2014-0005，24±2 ℃屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，本實驗經(jīng)福建中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核通過；無水葡萄糖（批號：S22J12H137237）、D-半乳糖（批號：J07GS153840）均購自上海源葉生物有限公司；抗壞血酸（批號：J2112017） 阿拉丁試劑上海有限公司；小鼠HO-1 ELISA 試劑盒（批號：MH-55002M2）、小鼠GHS-Px ELISA 試劑盒（批號：MH-44117M2）、小鼠CAT ELISA 試劑盒（批號：MH-44125M2）、小鼠SOD ELISA 試劑盒（批號：MH-0389M2）、小鼠丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（批號：MH-0897M2） 均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；苯酚、硫酸等 均為分析純。

DTA-27F 型超聲波清洗機 鼎泰（湖北）生化科技制造有限公司；TDL-40B 型低速離心機 上海安亭科學儀器廠；UV-5200 型紫外-可見分光光度計上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總多糖含量測定方法的建立

1.2.1.1 對照品溶液 精確稱取0.0100 g 無水葡萄糖于100 mL 容量瓶中，加超純水溶解定容至刻度，即得濃度為0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液。

1.2.1.2 供試品溶液 精密稱定1.000 g 板栗粉末于50 mL 離心管中，加入超純水30 mL，室溫下以超聲波功率100 W 提取1 h，3500 r/min 離心10 min，吸取上清液0.5 mL 于25 mL 容量瓶中，加超純水定容至刻度，備用。

1.2.1.3 標準曲線的制備 精確量取0.1、0.2、0.3、0.5、0.8 mL 葡萄糖標準溶液，分別置20 mL 具塞試管中，加超純水至1 mL，搖勻，加入5%苯酚1 mL，后迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，置冷水浴中降至室溫后，置沸水浴加熱15 min，再置冷水浴中降至室溫，于490 nm 測定吸光度[17]。以葡萄糖溶液濃度（x）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線：Y=0.01x-0.0232，R2=0.9992，x 的濃度單位為：μg/mL，線性范圍10～80 μg/mL，線性關系良好。

1.2.1.4 總多糖含量測定 分別準確量取各組供試品溶液0.5 mL 于20 mL 具塞試管中，加水至1 mL，后續(xù)按照“1.2.1.3”方法進行檢測，平行測定數(shù)值3 次。

注：A 為測得吸光度值；n 為稀釋倍數(shù)：3000。

1.2.2 正交試驗優(yōu)化板栗蒸制工藝

1.2.2.1 中藥蒸制板栗的制備 將陳皮、山楂、黃精剪碎約5 mm 大小，稱取適量，加入150 mL 20%食用乙醇，浸泡16 h，得藥食兩用中藥藥液；將鮮品板栗仁，洗凈瀝干，稱取120 g 置于藥液中，以超聲功率700 W、35 ℃的條件超聲30 min[18]，超聲結(jié)束后再室溫浸泡60 min。參考中藥熟地黃的加工方法，將浸泡好的板栗仁取出，平鋪于蒸制器皿中，待蒸鍋“圓汽”后，中火蒸制30 min，以上述方法重復浸泡、蒸制一次，即得黃精、陳皮、山楂中藥蒸制板栗。

1.2.2.2 對照組板栗的制備 以20%食用乙醇作為浸泡板栗的溶液，按“1.2.2.1”中的浸泡、蒸制條件加工生品板栗作為對照組板栗。

1.2.2.3 單因素實驗 按上述板栗蒸制工藝，以山楂3 g，陳皮6 g，研究不同劑量黃精（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）制得的提取液蒸制對板栗感官評價的影響；以黃精2 g，山楂3 g，研究不同劑量陳皮（1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g）制得的提取液蒸制對板栗感官評價的影響；以黃精2 g，陳皮4.5 g，研究不同劑量山楂1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g）制得的提取液蒸制對板栗感官評價的影響。

1.2.2.4 正交試驗設計 采用陳皮、山楂、黃精用量為考察因素，各取三個水平，按L9（34）進行正交試驗，見表1。評價指標：以感官評價和總多糖含量為評價指標，進行綜合評價；其中總多糖含量權(quán)重系數(shù)為0.7，感官評價權(quán)重系數(shù)為0.3。

表1 正交試驗設計因素與水平Table 1 Orthogonal experiment design factors and levels

1.2.2.5 感官評價標準 本研究參考文獻[19]制定感官評價標準見表2，分別對板栗的色澤、滋味與香氣等感官指標進行分值評定。感官評定人員20 名，均為食品科學專業(yè)學生，在評定前12 h 飲食清淡，每感官評定一個樣品后用清水漱口再評另一樣品，評定過程中不允許相互交談，同時填好評分表并簽名，由試驗人員收集評分表進行數(shù)據(jù)分析。

表2 板栗感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standard of chestnut

本試驗采用10 分制，各感官指標權(quán)重分別為：色澤40%、滋味與香氣60%。各項評價之和為該樣品的最終得分。感官評價分值采用算數(shù)平均值法進行。

1.2.3 板栗蒸制前后對小鼠小腸運動的影響

1.2.3.1 板栗水溶液制備 取板栗與蒸制板栗120 g，分別加入3 倍量水，置料理機內(nèi)打成糊狀物，加水定容，制成0.3 g/mL 的板栗水溶液，備用。

1.2.3.2 分組及干預 取SPF 級ICR 小鼠18 只，雄性，體質(zhì)量22～25 g。隨機分為空白組、板栗組和蒸制板栗組，每組6 只。各給藥組分別按體質(zhì)量10 mL/kg 灌胃板栗水溶液，空白組灌胃生理鹽水，2 次/d，給藥間隔時間為12 h，同時將板栗組、蒸制板栗組飼料換成相對應的板栗，連續(xù)灌胃3 d。

1.2.3.3 炭末推進法 末次給藥前，禁食不禁水12 h，將含有5%炭末的板栗水溶液按體質(zhì)量10 mL/kg灌胃，30 min 后按“炭末推進試驗法”，脫頸椎處死小鼠，剖開腹腔，分離腸系膜，剪取上端至幽門，下端至回盲部的腸管，以直尺測定腸管長度作為小腸總長度，從幽門至炭末前沿的距離作為炭末在腸內(nèi)推進距離[20]，計算炭末推進率。

1.2.4 板栗總多糖抗氧化應激作用

1.2.4.1 板栗多糖的提取 分別稱取板栗、蒸制板栗240.0 g，加超純水2400 mL（料液比1:10），以超聲波提取功率100 W，常溫常壓超聲提取35 min，再以80 ℃水浴加熱1 h[21]，離心，取上清液，旋蒸濃縮，濃縮液加95%乙醇，醇沉濃度80%，4 ℃靜置16 h，沉淀抽濾、洗滌，置蒸發(fā)皿冷凍干燥，得板栗多糖12.414 g，得率5.17%；蒸制板栗多糖18.735 g，得率7.81%。凍存至-20 ℃，備用。

1.2.4.2 D-半乳糖誘導小鼠氧化應激及板栗多糖干預 取6～8 周齡的SPF 級ICR 雄性小鼠60 只，體質(zhì)量22～25 g，隨機分為：空白組、模型組、維生素C 組、板栗多糖組、蒸制板栗多糖組，每組10 只。除空白組外，其余各組每日按10 mL/kg 腹腔注射2.5%D-半乳糖（D-galactose，D-gal）溶液，連續(xù)注射5 周。空白組及模型組灌胃等體積生理鹽水，陽性對照組灌胃100 mg/mL 維生素C 溶液[22]，板栗多糖組、蒸制板栗多糖組按劑量相當于12 g/kg 生藥材配成溶液灌胃給藥，以上各組均按體質(zhì)量10 mL/kg 進行干預，1 d/次，連續(xù)5 周；采用1%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，摘眼球取血，血液經(jīng)3500 r/min、4 ℃離心15 min，取上清用于后續(xù)生化檢測。

1.2.4.3 氧化應激小鼠血清抗氧化酶活性測定 采用酶聯(lián)免疫法，參照試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠血清中CAT、HO-1、SOD、GSH-Px 活性水平及MDA 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計學分析，結(jié)果以Mean±SD 表示。應用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行組間比較，P＜0.05 或P＜0.01 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 黃精用量對感官評價的影響 如圖1 所示，蒸制板栗感官評價的得分隨黃精的添加的增加呈先增加后下降趨勢，當添加量大于2.0 g 后開始下降。這是由于中藥黃精本身存在藥味會干擾蒸制板栗的味道，使藥味掩蓋板栗本身香味，從而導致感官評價得分降低，故選取黃精的添加量為2.0 g 進行下一步試驗。

圖1 黃精用量對感官評價的影響Fig.1 Effect of Polygonatum dosage on sensory evaluation

2.1.2 陳皮用量對感官評價的影響 如圖2 所示，蒸制板栗感官評價的得分隨陳皮的添加的增加呈先增加后下降趨勢，當添加量大于4.5 g 后開始下降。這是由于陳皮本身香氣與板栗香氣融合，干擾蒸制板栗的味道，且陳皮的風味會掩蓋板栗的香味，從而導致感官評價得分降低，故選取陳皮的添加量為4.5 g 進行下一步試驗。

圖2 陳皮用量對感官評價的影響Fig.2 Effect of Citrusreticulata dosage on sensory evaluation

2.1.3 山楂用量對感官評價的影響 如圖3 所示，蒸制板栗感官評價的得分隨山楂的添加的增加呈先增加后下降趨勢，當添加量大于3.0 g 后開始下降。這是由于山楂帶有酸味，適當添加能解膩，但添加量過多會導致蒸制板栗過酸，影響口感，從而導致感官評價得分降低，故選取山楂的添加量為3.0 g 進行下一步試驗。

圖3 山楂用量對感官評價的影響Fig.3 Effect of Crataegus pinnatifida dosage on sensory evaluation

2.2 正交試驗優(yōu)化板栗蒸制工藝

L9（34）正交試驗中各實驗組板栗多糖含量，蒸制工藝條件及正交實驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。由直觀分析可知，影響蒸制板栗總多糖含量和感官評價效果的因素主次順序為：A＞B＞C，即陳皮＞山楂＞黃精。經(jīng)方差分析，最終確定最佳中藥用量方案為A2B2C1，即蒸制120 g 板栗需陳皮4.5 g、山楂3 g、黃精3 g，測得對照組板栗多糖含量為69.65±0.98 mg/g；經(jīng)藥食兩用中藥制成的蒸制板栗，感官評價得分為：89.2±0.56；多糖含量為：97.10±0.16 mg/g。

表3 正交試驗設計方案與結(jié)果Table 3 Scheme and results of orthogonal experiment design

表4 綜合評分方差分析Table 4 Comprehensive analysis of variance

2.3 板栗對小鼠小腸運動的影響

與空白組相比，板栗組小鼠腸推進率小于空白組，但無顯著性差異（P＞0.05），蒸制板栗組小鼠腸推進率顯著提高（P＜0.05）；與板栗組相比，蒸制板栗組腸推進率顯著提高（P＜0.01），見圖4，表明經(jīng)陳皮、山楂、黃精蒸制后的板栗可有效促進小鼠小腸運動。

圖4 板栗對小腸運動的影響Fig.4 Effect of Chestnut on small intestinal motility

2.4 氧化應激小鼠血清抗氧化酶活性測定

由見圖5 可知，與空白組相比較，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px、HO-1、CAT 活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MDA 活性明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明D-gal 誘導氧化應激成功；與模型組相比，蒸制板栗多糖組的GSHPx、HO-1、CAT 活性極顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），SOD 也明顯提高（P＜0.05），MDA 活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），表明經(jīng)陳皮、山楂、黃精蒸制后的板栗具有良好的抗氧化效果，可有效改善D-gal 誘導的小鼠衰老，此外，與板栗多糖組對比，蒸制板栗組CAT 顯著提高（P＜0.05），提示板栗多糖、蒸制板栗多糖均有抗氧化活性，蒸制板栗組整體抗氧化活性較板栗多糖組高（P＜0.01）。

圖5 血清中SOD、GSH-Px、HO-1、CAT、MDA 含量Fig.5 Content of SOD, GSH-Px, HO-1, CAT, and MDA in the serum

3 討論與結(jié)論

中醫(yī)藥在改善機體免疫能力，抗氧化應激和衰老有其獨特的優(yōu)勢。多糖廣泛存在于藥用植物及微生物的細胞壁、動物細胞膜中，其可通過提高機體抗氧化、調(diào)節(jié)免疫作用、對應激反應的影響及延長生長期等方面對機體起到延緩衰老的作用[23-24]。從食用安全性和保健功效兩角度考量，藥食兩用中藥是開發(fā)保健食品和尋找抗氧化抗衰老藥物的潛在資源。板栗風味良好，具有補腎、抗衰老的作用，多糖是其有效物質(zhì)之一，然而板栗生吃不易消化，熟吃又滯氣[25]。黃精[26-27]、山楂[28]、陳皮[29-30]消食健胃、行氣化瘀，富含多糖和黃酮，且具有抗氧化自由基損傷的活性。為進一步增強板栗抗氧化功效、改善其消化不良消化的弊端，本研究參考中藥熟地黃、黃精等炮制工藝，提取中藥活性成分對板栗進行蒸制加工；基于感官評價和多糖含量，以總多糖為主要評價指標，采用苯酚-濃硫酸法測定板栗蒸制前后總多糖含量[31]，優(yōu)選黃精、山楂、陳皮提取液蒸制板栗的工藝為：每100 g 蒸制板栗含板栗91.95%，陳皮3.45%、山楂2.30%、黃精2.30%，對照組板栗多糖含量為：69.65±0.98 mg/g；經(jīng)藥食兩用中藥提取液蒸制板栗中多糖含量為：97.10±0.16 mg/g。

為明確蒸制前后機體對板栗的消化情況，本研究借助腸推進實驗，通過每天2 次，連續(xù)3 d 給正常小鼠灌胃板栗，模擬板栗多食造成消化不良的情況，在末次灌胃半小時后進行腸道推進檢測，結(jié)果顯示，連續(xù)3 d，每天2 次給予板栗會造成小鼠腸道推進減慢，與板栗組對比，藥食兩用中藥蒸制后的板栗促進腸推進具有顯著差異（P＜0.01），表明板栗借助山楂、陳皮消食的功效改善自身消化不良的弊端；為進一步明確藥食兩用中藥蒸制板栗對小鼠血清氧化應激的影響，本研究采用D-gal 誘導，構(gòu)建氧化應激衰老動物模型[32]，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖誘導的小鼠相較空白組更明顯出現(xiàn)氧化應激，氧化應激產(chǎn)物MDA 含量顯著升高（P＜0.05），經(jīng)板栗經(jīng)中藥蒸制前后，其多糖均可有效促進體內(nèi)防御系統(tǒng)中抗氧化酶系SOD、GSH-Px、HO-1、CAT 的合成或活性增強，降低代謝產(chǎn)物MDA的活性，防止自由基堆積。

本研究借鑒中藥炮制，提出板栗新的加工方法，提供了一種新的板栗加工品，可為同類食藥兩用中藥的開發(fā)利用提供參考，可促進板栗資源的利用，利于多種類板栗保健品的開發(fā)，提升板栗在抗氧化抗衰老研究方面的附加值。本研究不足之處在于，尚未完全闡明板栗補腎機制，僅從血清水平闡明其具有抗氧化作用，未能在更深的作用機制層面闡明板栗通過何種途徑補腎，從而抗氧化抗衰老，這亦是現(xiàn)代研究的不足之處。板栗作為一種風味良好的食品，在中醫(yī)藥領域亦是補腎佳品，如何實現(xiàn)中醫(yī)藥學與食品科學的有機結(jié)合，一直是中醫(yī)藥學者研究的熱點，本研究僅提供一點微薄思路，供做參考。在本研究水平上，藥食兩用中藥蒸制的板栗可改善板栗本身不易消化的缺點，且其多糖在抗氧化抗衰老作用。然而板栗中營養(yǎng)成分含量豐富，對板栗中是否還存在其他具有顯著抗氧化、抗抗衰老作用的成分及板栗抗衰老作用機制還需進一步深入研究。