劉軍海 ， 苗僑偉， 何 敏

（1.陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學(xué)陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723001）

蒲公英又名婆婆丁， 是菊科多年生草本植物，廣泛生于山坡草地、路邊、田野、河灘（劉光武，2022；劉曉燕，2022）。 蒲公英營養(yǎng)成分豐富，可作為野生蔬菜食用， 也是一味重要的臨床常用草藥（秦聰聰，2022），主要含有黃酮類、多糖類、色素類、有機(jī)酸類物質(zhì)（趙欣，2022）。 其資源豐富，來源廣泛，價(jià)格低廉，其中酚酸類物質(zhì)種類豐富，尤其是蒲公英葉中綠原酸含量較高（馮戲雨，2019），臨床報(bào)道其具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用 （高林曉，2022；Bagdas，2020；Naveed，2018；Li，2010）。 近年來，蒲公英在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域的研究也在不斷深入，隨著國家禁止在飼料中添加抗生素類藥物等相關(guān)政策的發(fā)布，尋找天然來源、低毒低殘留、成本低廉的抗生素類產(chǎn)品已成為目前畜牧養(yǎng)殖中的重點(diǎn)（劉靜慧，2020）。

本研究以陜西漢中野生蒲公英為原料， 采用超聲波輔助醇水溶液提取綠原酸， 以綠原酸得率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，探究綠原酸提取的最佳條件，并對(duì)所得綠原酸提取液進(jìn)行體外抗氧化活性探究及穩(wěn)定性研究，旨在為蒲公英開發(fā)成安全穩(wěn)定的功能性飼料提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 蒲公英（陜西漢中野生）；無水乙醇（AR， 利安隆博華有限公司）； 維生素C 片（AR，四川依科制藥有限公司）；無水碳酸鈉（AR，成都市科龍化工試劑廠）；氯化鈉（AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；葡萄糖（AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；硫酸銅（AR，天津博迪化工股份有限公司）；硫酸鋅（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；硫酸亞鐵（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；硫酸鐵（AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；山梨糖醇（食品級(jí)，壽光市華力糖醇有限公司）；焦亞硫酸鈉（食品級(jí)， 恒億化工有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（≥98%，阜陽生物技術(shù)有限公司）；雙氧水（AR，西安龍?zhí)┗げ牧嫌邢薰荆?；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（AR，南京源植生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器 LD5-10 低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；TU-1900 型雙光束紫外可見分光光度計(jì) （濟(jì)寧市裕澤工業(yè)科技有限公司）；GW1030 超聲波清洗機(jī)型（深圳市冠博科技實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取5.5 mg的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，加入適量無水乙醇，超聲輔助至完全溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中， 用無水乙醇定容至刻度線作為綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 經(jīng)雙光束紫外可見分光光度計(jì)測定綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收波長為326 nm，分別移取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1、3、5、7、9 mL 于10 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容后靜置15 min。 使用無水乙醇作為空白對(duì)照組在326 nm 處測定其吸光度， 每組平行測定3 次，求取平均值。以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度A 為縱坐標(biāo)，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度C 為橫坐標(biāo)，做出C-A 關(guān)系圖。

1.2.2 綠原酸的提取及測定 將蒲公英全草洗凈，放入烘箱干燥至恒重， 用中草藥粉碎機(jī)粉碎后過50 目篩網(wǎng)得蒲公英全草粉末， 放入棕色磨口瓶中備用。準(zhǔn)確稱取蒲公英全草粉末1.00 g 于干燥試管中，按照料液比為1:14（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液， 搖勻后在60 ℃條件下放入600 W超聲波清洗機(jī)超聲輔助提取1 h， 將試管中的液體移入離心管設(shè)置轉(zhuǎn)速（3000 r/min）離心20 min 后減壓抽濾并量取上層清液體積并記錄。 移取1 mL清液稀釋50 倍后在326 nm 處測定其吸光度，根據(jù)1.2.1中所得線性方程求出提取液濃度。 以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，計(jì)算蒲公英中綠原酸的提取率。

式中：C 為超聲后的提取液濃度，μg/mL；V為離心后的上層清液的體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為稱取的蒲公英葉粉末的質(zhì)量，g。

1.2.3 綠原酸提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 提取料液比的篩選用50%的乙醇水溶液為提取溶劑， 分別設(shè)置料液比1:11、1:12、1:13、1:14、1:15（g/mL），按照“1.2.2”的方法條件進(jìn)行提取， 探究不同提取料液比對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.3.2 提取時(shí)間的篩選 分別設(shè)置提取時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h，按照“1.2.2”的方法條件進(jìn)行提取，探究不同提取時(shí)間對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.3.3 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的篩選 分別配制體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液作為提取溶劑，按照“1.2.2”的方法條件進(jìn)行提取， 探究不同提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.3.4 提取溫度的篩選 分別設(shè)置溫度為40、50、60、70、80 ℃，按照“1.2.2”的方法條件進(jìn)行提取，探究不同提取溫度對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以提取料液比（A），提取時(shí)間（B），提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（C），提取溫度(D)為主要影響因素，空白列（E）為誤差列，以綠原酸得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 L16（45) 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5 體外抗氧化性檢測分析

1.2.5.1 DPPH 自由基清除法準(zhǔn)確稱取DPPH 4.5 mg 于燒杯中，加入50%的乙醇水溶液使其充分溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中定容，該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，密封避光保存。 將綠原酸提取液和維生素C 分別稀釋配成0.12、0.24、0.3、0.48、0.6 μg/mL系列的溶液。在10 mL 試管中分別加入2.0 mL 綠原酸提取液，2 mL DPPH 溶液，再加2 mL 的50%乙醇溶液，混勻，用1 cm 的比色皿在517 nm 波長處測定吸光度，記為Ai；再放入柜子避光保存0.5 h后再次測量吸光度，記為Aj；對(duì)照組試驗(yàn)只加2 mL的DPPH 溶液，再加4 mL 的50%乙醇溶液，其吸光度記為AC（參比溶液為50%乙醇溶液）。每個(gè)樣品測定三次，求取平均值。 在同等條件下，測定維生素C 對(duì)DPPH 清除的能力（馬萌，2022）。

1.2.5.2 羥基自由基清除法 準(zhǔn)確稱取H2O2試劑4.5 mg 于燒杯中， 將其轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用50%乙醇水溶液定容，備用。 將綠原酸提取液和維生素C 分別稀釋配成0.12、0.24、0.3、0.48、0.6 μg/mL 系列的溶液。 在10 mL 試管中分別加入2.0 mL 綠原酸提取液，2 mL H2O2溶液，再加2 mL 的50%乙醇溶液，混勻，然后用1 cm 的比色皿在326 nm 波長處測定吸光度，記為Ai；再放入柜子避光保存0.5 h 后再次測量吸光度，記為Aj；對(duì)照組試驗(yàn)只加2 mL 的H2O2溶液， 再加4 mL的50%乙醇溶液，其吸光度記為AC（參比溶液為50%乙醇溶液）。每個(gè)樣品測定三次，求取平均值。在同等條件下，測定維生素C 對(duì)H2O2羥基自由基清除的能力（王凱，2021）。

1.2.6 穩(wěn)定性研究

1.2.6.1 金屬鹽離子對(duì)于綠原酸穩(wěn)定性的影響分別取7 份10 mL 綠原酸提取液于50 mL 燒杯中，向其中6 個(gè)燒杯分別加入1.00 g 的不同金屬鹽Na+（a）、K+（b）、Zn2+（c）、Cu2+（d）、Fe2+（e）、Fe3+（f），剩余一個(gè)作為空白對(duì)照。

1.2.6.2 pH 對(duì)于綠原酸穩(wěn)定性的影響分別取7 份10 mL 綠原酸提取液于50 mL 燒杯中， 用1 mol/L 的稀硫酸和無水碳酸鈉分別調(diào)節(jié)其pH，將pH 為7 作為空白對(duì)照，檢測并記錄其吸光度。

1.2.6.3 食品添加劑對(duì)于綠原酸穩(wěn)定性的影響分別取4 份10 mL 綠原酸提取液于50 mL 燒杯中，分別向其中3 個(gè)燒杯中加入1.00 g 不同的食品添加劑，剩余一個(gè)空白對(duì)照，檢測并記錄其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖1 可以看出， 吸光度與質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系， 得出方程式為y=0.07965x+0.04055，R2=0.9998，表明線性關(guān)系良好。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液C-A 關(guān)系圖

2.2 綠原酸提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取料液比對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響由圖2 可以看出，隨著提取料液比的增加，綠原酸的提取率先增大后減小。 當(dāng)提取料液比為1:14（g/mL）時(shí)，蒲公英中綠原酸的提取量達(dá)到最大值。 而出現(xiàn)提取率先增大后減小的趨勢可能是因?yàn)楫?dāng)提取溶劑較少時(shí)，蒲公英中的綠原酸沒有完全浸出，而當(dāng)提取溶劑過大時(shí)， 蒲公英中的其他活性物質(zhì)例如黃酮、色素等也被浸出，造成綠原酸提取率略有減小。料液比增大會(huì)造成溶劑用量大，生產(chǎn)成本高而且影響后續(xù)對(duì)于蒲公英綠原酸提取液中綠原酸含量的測定與判斷。綜上所述，初步選擇的料液比水平為1:14（g/mL）。

圖2 提取料液比對(duì)綠原酸得率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響由圖3 可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，綠原酸的提取率呈現(xiàn)先增大后減小的過程，可以直觀看出，綠原酸提取率與提取時(shí)間之間的關(guān)系有一個(gè)峰值，即超聲振蕩時(shí)間為1.5 h 時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到最高。 而出現(xiàn)提取率先增大后減小的趨勢可能是當(dāng)提取時(shí)間小于1.5 h 時(shí)， 蒲公英中綠原酸未完全浸出， 當(dāng)提取時(shí)間大于1.5 h 時(shí)綠原酸含量有所減小可能是因?yàn)槌晻r(shí)間較長導(dǎo)致綠原酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或者是其他活性物質(zhì)如黃酮、 色素等浸出量增大，造成綠原酸提取率略有減小。綜上所述，此次試驗(yàn)控制了其他因素的影響，極大增強(qiáng)了試驗(yàn)結(jié)果的可信度， 初步選擇超聲提取時(shí)間水平為1.5 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)綠原酸得率的影響

2.2.3 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響 由圖4 可知， 隨著提取溶劑體積分?jǐn)?shù)的增加， 蒲公英中綠原酸的提取率會(huì)呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。 可以直觀看出當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，蒲公英中綠原酸的提取率達(dá)到峰值。而出現(xiàn)提取率先增大后減小的趨勢可能是提取溶劑體積分?jǐn)?shù)過大時(shí)蒲公英中一些脂溶性物質(zhì)會(huì)被乙醇溶液大量浸出， 相當(dāng)于給蒲公英中的綠原酸添加了一部分雜質(zhì)，即會(huì)影響綠原酸的測定。另一方面可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)過大導(dǎo)致綠原酸中某些有效成分的變性失活， 破壞了綠原酸的原本結(jié)構(gòu)，降低了從蒲公英中提取綠原酸的提取率。提取溶劑體積分?jǐn)?shù)大成本高且不利于后期處理，綜上所述，初步選擇提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液。

圖4 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸得率的影響

2.2.4 提取溫度對(duì)蒲公英綠原酸得率的影響 由圖5 可知，隨著提取溫度的增加，蒲公英中綠原酸的提取率會(huì)呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。 可以直觀看出當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，蒲公英中綠原酸的提取率達(dá)到峰值。 而出現(xiàn)提取率先增大后減小的趨勢可能是在一定范圍內(nèi)升高溫度有助于提升分子擴(kuò)散速率，從而增大提取率，但是當(dāng)溫度過高時(shí)可能會(huì)增加其他雜質(zhì)的浸出率或者導(dǎo)致綠原酸變性。 綜上所述，在保證提取率的前提下，初步選擇提取溫度為60 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)綠原酸得率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)控制單因素變量可知，主要影響蒲公英中綠原酸提取率的因素有料液比（A），超聲振蕩溫度（B），乙醇的體積分?jǐn)?shù)（C），超聲振蕩時(shí)間（D），選擇這四個(gè)影響因素的四個(gè)最佳水平，采用L16（45）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以蒲公英中綠原酸提取率為指標(biāo)進(jìn)行考察。 正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析如表2 所示， 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析如表3 所示。由表2 可以看出，蒲公英中綠原酸提取的最佳工藝條件為A1B3C2D4，即料液比為1:12（g/mL），提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為1.5 h，提取溶劑體積分?jǐn)?shù)為50%。 按此條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)， 取平均值， 得到蒲公英中綠原酸得率為3.18%。 由表3 可知，四個(gè)提取因素中，料液比、提取溫度、體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸的提取影響均不顯著，而提取時(shí)間對(duì)綠原酸的提取影響非常顯著。因此，實(shí)際生產(chǎn)過程中可適當(dāng)減少料液比， 降低提取溫度，減小體積分?jǐn)?shù)，以降低生產(chǎn)成本。 但要嚴(yán)格控制提取時(shí)間，以保證較高的綠原酸提取率。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 綠原酸體外抗氧化性研究結(jié)果

2.4.1 綠原酸提取液對(duì)DPPH 自由基的清除能力由圖6 可知， 綠原酸提取液和VC 對(duì)于DPPH 自由基的消除能力趨勢是隨著濃度的增加而不斷增加的。 當(dāng)濃度達(dá)到0.6 μg/mL 時(shí)，綠原酸提取液對(duì)DPPH 自由基消除能力達(dá)到最大值，為80%。綠原酸提取液和VC 對(duì)DPPH 自由基均有良好的清除能力，表明綠原酸具有良好的抗氧化能力，相同濃度下對(duì)于DPPH 自由基的清除能力略低于VC。

圖6 綠原酸提取液和VC 對(duì)DPPH 自由基的清除作用

2.4.2 綠原酸提取液對(duì)于羥基自由基的清除能力由圖7 可知， 綠原酸提取液對(duì)于羥基自由基具有很強(qiáng)的清除能力， 且隨著樣品濃度增加其對(duì)羥基自由基清除作用加強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到0.6 μg/mL 時(shí)，綠原酸提取液對(duì)雙氧水中羥基自由基消除能力達(dá)到最大值，為79%。 在相同濃度下，綠原酸提取液對(duì)羥基自由基清除能力均高于VC 溶液， 說明綠原酸抗氧化活性高于VC 溶液。

圖7 綠原酸提取液和VC 對(duì)羥基自由基的清除作用

2.5 穩(wěn)定性研究結(jié)果

2.5.1 金屬鹽離子對(duì)于綠原酸穩(wěn)定性的影響 由圖8 可知，Zn2+、Na+對(duì)于綠原酸提取液中綠原酸影響不顯著，F(xiàn)e2+和Fe3+會(huì)有一定的促進(jìn)作用， 促進(jìn)綠原酸提取液中綠原酸的含量增長； 可能是因?yàn)殍F離子與蒲公英綠原酸提取液中的一些雜質(zhì)離子發(fā)生反應(yīng)， 所以顯示綠原酸提取液中添加鐵離子之后對(duì)于綠原酸的含量增加有著促進(jìn)作用。 而Cu2+對(duì)于綠原酸的含量有很大的抑制作用， 可能是因?yàn)殂~離子更容易與蒲公英綠原酸提取液中的綠原酸發(fā)生反應(yīng)， 導(dǎo)致蒲公英綠原酸提取液中綠原酸濃度的降低， 故蒲公英綠原酸提取液的保存應(yīng)該要避免使用銅制品保存， 更不應(yīng)該與銅制品接觸，防止綠原酸含量減少導(dǎo)致的活性低下，生理活性不強(qiáng)等問題。

圖8 金屬離子對(duì)綠原酸提取液穩(wěn)定性影響

2.5.2 pH 對(duì)于綠原酸穩(wěn)定性的影響 由圖9 可知，綠原酸在偏酸性環(huán)境中穩(wěn)定性比較強(qiáng)，但是酸性強(qiáng)度太大也會(huì)導(dǎo)致綠原酸含量降低， 可能是綠原酸結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致含量降低。 而且綠原酸不適合在pH 大于7 的堿性溶液中反應(yīng)， 保存在堿性環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致原有的綠原酸含量減小，可能是pH過大導(dǎo)致蒲公英提取液中綠原酸某些化學(xué)鍵的斷裂重組。 綜上所述與pH=7 的中性溶液相比，偏酸性環(huán)境比較適合綠原酸的存放， 堿性環(huán)境并不適合綠原酸參與的反應(yīng)， 故綠原酸參與的反應(yīng)最好在pH＝7 或偏酸性的條件下， 防止綠原酸的效能降低或者提取率降低。

圖9 pH 對(duì)綠原酸提取液穩(wěn)定性影響

2.5.3 食品添加劑對(duì)于綠原酸穩(wěn)定性的影響 由圖10 可知，山梨糖醇，焦亞硫酸鈉，葡萄糖等食品添加劑對(duì)于綠原酸提取液中綠原酸的含量有很大的抑制作用， 綠原酸已確定可以作為保健食品與飼料添加劑， 目前我國已經(jīng)開始利用蒲公英中的綠原酸作為主要原材料制作一些飼料添加劑，故飼料添加劑中應(yīng)注意綠原酸與其他一些食品添加劑的活性克制， 這三種食品添加劑經(jīng)過試驗(yàn)研究都會(huì)對(duì)蒲公英中提取出來的綠原酸含量產(chǎn)生一定抑制作用。綜上所述，在生產(chǎn)綠原酸有關(guān)飼料添加劑時(shí)要盡量避免與抑制綠原酸含量的其他添加劑一同制備。

圖10 食品添加劑對(duì)綠原酸穩(wěn)定性影響

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助醇水溶液提取蒲公英中的綠原酸，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取工藝， 得到蒲公英中綠原酸的最佳提取工藝條件為料液比1:12（g/mL），提取溫度60 ℃，提取時(shí)間1.5 h，提取溶劑體積分?jǐn)?shù)50%，蒲公英中綠原酸平均得率3.18%?？寡趸栽囼?yàn)結(jié)果表明，蒲公英中綠原酸具有較好的抗氧化性作用。 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明， 蒲公英中綠原酸保存條件應(yīng)在偏酸性且不宜與銅制品接觸。 此研究為將蒲公英中綠原酸進(jìn)一步開發(fā)為天然低毒的功能性飼料提供理論參考。