郭曉莎， 劉軍海

（1.陜西理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學(xué)陜西省催化基礎(chǔ)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000）

蓖麻（Ricinus communisL.）是一年或多年生草本大戟科植物，在我國南北均有分布。 蓖麻籽即蓖麻的籽粒，主要含蓖麻油、蓖麻堿、總黃酮以及蓖麻毒素等活性成分，具有防腐、潤滑、殺蟲、抗菌消炎等功效 （袁樸芳，2022； 劉月廉，2022；Eepika，2022）。 蓖麻餅粕是蓖麻籽生產(chǎn)蓖麻油之后的副產(chǎn)物，一般用作飼料或者農(nóng)家肥，但蓖麻餅粕含有蓖麻堿、蓖麻毒素等，一定程度限制其在飼料工業(yè)中的應(yīng)用（劉文峰，2019；El-Naggar Mai，2019； 任春環(huán)，2014； 賈濤，2013）。 蓖麻堿是吡啶衍生類生物堿，是蓖麻餅粕中重要的活性成分之一，具有保肝護(hù)肝，改善記憶，鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)咳等藥理活性，對于預(yù)防阿爾茲海默癥以及治療冠心病、心絞痛等疾病也具有一定效果 （Saravana Kumar，2022；Zhang，2017；春英，2015；鄧青，2015）。 從蓖麻餅粕中提取蓖麻堿，可很好的改善蓖麻餅粕在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用，同時(shí)提取的蓖麻堿還可以有著更為廣泛的應(yīng)用， 因此，從蓖麻餅粕中提取蓖麻堿有著極大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。目前對于蓖麻餅粕中蓖麻堿的提取工藝有索氏提取法（穆莎茉莉，2012）、浸漬提取法（吳雪平，2006）、微波輔助提取法（許偉，2014）、超聲波輔助提取法（柯增光，2015）等。 超聲輔助提取法具有提取成本低、提取時(shí)間短、工業(yè)技術(shù)化成熟等優(yōu)點(diǎn)，在天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。 本研究以蓖麻餅粕為原料，優(yōu)化蓖麻堿的提取工藝，研究蓖麻堿的抗氧化性，并對結(jié)構(gòu)表征，以期為蓖麻堿的提取、開發(fā)及應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 蓖麻餅粕，市購；溴化鉀，光譜純；無水乙醇、甲醇、三氯乙烷、水楊酸、維生素C、DPPH·等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 WGLL-230BE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱， 天津市泰斯特儀器有限公司；FW117 型中草藥粉碎機(jī)， 紅景天工貿(mào)有限公司；DJ-1 大功率強(qiáng)磁力攪拌器， 鞏義市杜甫儀器廠；SHB 型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；超聲波清洗機(jī)， 寧波新生物科技股份有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；低溫冷卻液循環(huán)泵， 杭州瑞佳精密科學(xué)儀器有限公司；VERTEX 70 紅外分光光度計(jì)，天津市拓普儀器有限公司；FW-4 壓片機(jī)， 天津市光學(xué)儀器廠；Cary50 型紫外可見分光光度計(jì)，美國瓦里安。

1.3 蓖麻子的提取與測定方法

1.3.1 原料處理 將蓖麻餅粕置于鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃烘至絕干，用中草藥粉碎機(jī)將蓖麻餅粕粉碎，過40 目篩，稱取蓖麻餅粕于索氏提取器中，按料液比1:15（mg/mL）加入石油醚（沸程60 ～90 ℃），回流3 h，進(jìn)行脫脂處理。 抽濾，收集濾餅，置于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，烘至絕干，得脫脂蓖麻餅粕粉，待用。

1.3.2 蓖麻堿的提取 用電子天平分別稱量

1.3.1 處理的脫脂蓖麻粉5 g，按一定提取料液比，在250 mL 錐形瓶中分別加入水、 無水乙醇、甲醇、三氯乙烷、1%（體積分?jǐn)?shù)）鹽酸。放入超聲提取裝置中，設(shè)定超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度，進(jìn)行超聲輔助提取。 提取結(jié)束后將提取液取出、冷卻、抽濾、 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑， 得膏狀蓖麻堿粗提物。 取出提取物，加入三氯乙烷回流3 h。 再取出回流液， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去溶劑， 得到蓖麻堿提取物。 最后加入甲醇，測定吸光度，計(jì)算提取率。 試驗(yàn)每次平行3 組，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.3.3 最大波長的選擇 取1.3.2 蓖麻堿提取物。甲醇溶解后，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1 所示。 可以看出，在257、310 nm 出現(xiàn)峰值，與徐文清（2001）結(jié)果基本一致。

圖1 提取物紫外光譜分析圖

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及提取率

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取1.0000 g 蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)品1 份，用10 mL 甲醇溶解，分別取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于100 mL 的容量瓶中，加入甲醇定容。第一組作空白對照，用紫外分光光度計(jì)在波長310 nm 處分別測其吸光度值， 以吸光度為縱坐標(biāo)， 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)， 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.0572X+0.0232，R2=0.9934，表明蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)品在0.2 ～1 mg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好（邱靖，2013；穆莎茉莉，2012；張海悅，2010）。

1.3.4.2 蓖麻堿提取率的計(jì)算

式中：A 為蓖麻堿提取液的吸光度；100 為稀釋的倍數(shù)；V 為蓖麻堿提取液的總體積，mL；m 為蓖麻餅粕的質(zhì)量，g。

1.3.5 抗氧化性試驗(yàn)

1.3.5.1 DPPH·清除率的測定 準(zhǔn)確稱取10 mg DPPH，用無水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至250 mL 容量瓶中定容，以配制0.04 mg/mL DPPH 的溶液，使用電子天平精確稱取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g 的Vc，用無水乙醇定容于10 mL 容量瓶中，得相應(yīng)濃度的Vc 溶液。 蓖麻堿溶液與配制Vc 溶液相同，配制備用。 取5 只干燥的試管，向其中分別加入2 mL 配制好的不同質(zhì)量濃度的蓖麻堿溶液，再分別加入2 mL DPPH 溶液，混合后將混合液室溫靜置30 min， 在517 nm 處測定溶液吸光度值為A1。 同理， 配制五份不同濃度的Vc 溶液和DPPH 溶液混合液，靜置30 min 后測其吸光度值為A2。 以無水乙醇加DPPH 混合溶液為對照，其吸光度值A(chǔ)0。 DPPH 自由基清除率（Y）按下式計(jì)算。

1.3.5.2 ·OH 清除率的測定 分別將蓖麻堿稀釋20、50、80、110、140 mg/L 的溶液，取1 mL 不同質(zhì)量濃度的蓖麻子堿稀釋于試管中，依次先加入1 mL、10 mmol/L FeSO4以及1 mL、9 mmol/L 乙醇-水楊酸溶液，接著加入3.5 mL 蒸餾水，最后加入5.5 mL、7.8mmol/L H2O2后搖勻，37 ℃水浴加熱30 min 后取出，反應(yīng)結(jié)束后，于510 nm 測其吸光度A1，用蒸餾水代替雙氧水溶液測其吸光度為A2， 再用蒸餾水代替蓖麻子堿的吸光度為A0， 以上參比均為蒸餾水。 以蓖麻子堿和Vc 為陽性對照，測其清除率。計(jì)算公式同DPPH 自由基清除率。

1.3.6 結(jié)構(gòu)分析 取1.3.2 蓖麻堿提取物，加入無水乙醇重結(jié)晶以除去雜質(zhì)（朱慶莉，2020；Qing-li Zhu，2018；任春環(huán)，2014；李久明，2013），得到固體后KBr 壓片，進(jìn)行紅外光譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對提取率的影響試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對提取效果的影響 按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定料液比為1:10（g/mL），提取時(shí)間為30 min，提取溫度為50 ℃，考察水、無水乙醇、甲醇、三氯乙烷、1%鹽酸（體積分?jǐn)?shù)）不同提取溶劑對蓖麻堿的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溶劑對提取率的影響

從圖2 可以看出，不同提取溶劑中，三氯乙烷最好，熱水最差，但考慮到提取成本，以及提取溶劑的回收、毒性等因素，綜合來看，熱水不失為較好的提取溶劑，一方面是提取率相差不大，另一方面是提取成本較低、無毒、安全。 因此選擇熱水做為提取劑。

2.1.2 提取溫度對提取率的影響 以水為提取溶劑，按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定料液比為1:10（g/mL），提取時(shí)間為30 min， 改變提取溫度為40、50、60、70、80、90 ℃，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對提取率的影響

從圖3 可以看出， 隨著提取溫度的升高，提取率先增加再減少，70 ℃提取率最大。 這是因?yàn)殡S著提取溫度的升高，蓖麻堿的溶解度也增加，因此提取率增加。 蓖麻堿分子較大，溫度過高，蓖麻堿分子分解，提取率下降。 另外，提取溫度高，提取成本大。 綜合來看，70 ℃為較為適宜的提取溫度。

2.1.3 提取時(shí)間對提取率的影響 以水為提取溶劑，按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定料液比為1:10（g/mL），提取溫度為70 ℃， 改變提取時(shí)間為20、30、40、50、60、70 min，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對提取率的影響

從圖4 可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，提取率先增加再減少，50 min 時(shí)提取率最大。 這是因?yàn)?，隨著提取時(shí)間的增加，超聲波空化效應(yīng)使得蓖麻堿不斷快速被溶解于溶劑中，提取率不斷增加。50 min 時(shí)，蓖麻堿已基本被提取出來，時(shí)間再增加，提取率下降，這是因?yàn)殚L時(shí)間的高溫對蓖麻堿結(jié)構(gòu)破壞。 因此，提取時(shí)間50 min 較為合適。

2.1.4 料液比對提取效果的影響 以水為提取溶劑，按1.3.2 進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)定提取溫度為70 ℃，提取時(shí)間為50 min，改變料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35（g/mL），結(jié)果見圖5。

圖5 料液比對提取率的影響

從圖5 可以看出，隨著料液比的增加，提取率一直增加，但超過1:20（g/mL）以后，基本不再發(fā)生變化。 這是因?yàn)椋S著料液比的增加，單位質(zhì)量蓖麻餅粕的提取溶劑增加，而提取溶劑增加，有利于蓖麻堿的溶解，提取率不斷增加。料液比超過1:20（g/mL）時(shí)，蓖麻餅粕中蓖麻堿絕大部分已被提取出來，再增加料液比，提取率盡管有所增加，但基本趨于不變。同時(shí)，較大的料液比也增加了提取成本。 故取料液比為1:20（g/mL）較適宜。

2.2 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素四水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，以空白為誤差列。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果及極差分析見表1，方差分析見表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果及極差分析

表2 方差分析

表1 極差分析表明， 蓖麻餅粕中蓖麻堿超聲輔助最佳提取工藝條件為以水為提取溶劑， 提取溫度70 ℃，提取時(shí)間50 min，料液比1:20（g/mL）。

表2 方差分析表明， 提取溫度和料液比對提取影響不顯著，而提取時(shí)間影響顯著。考慮到提取成本，在實(shí)際生產(chǎn)中，可適當(dāng)降低提取溫度和料液比，但需要嚴(yán)格控制好提取時(shí)間。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)2.2 分析結(jié)果， 確定以水為提取劑，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間50 min，料液比1:20（g/mL），在此條件下按1.3.2 進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果提取率為5.34%。

2.4 抗氧化性試驗(yàn)

2.4.1 蓖麻堿對DPPH·自由基清除能力 圖6為蓖麻堿與Vc 清除DPPH·自由基結(jié)果比較。 可以看出，隨著蓖麻堿濃度逐漸增大，DPPH·自由基清除率也在隨之增大， 當(dāng)蓖麻堿濃度逐步上升達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到了60.3%，小于Vc 對DPPH·自由基清除能力， 但試驗(yàn)結(jié)果表明蓖麻堿仍具有較強(qiáng)的DPPH·自由基清除能力 （王萍，2022；李伶，2022；武佳文，2021）。

圖6 蓖麻堿對DPPH·自由基清除能力

2.4.2 蓖麻堿對·OH 清除能力 由圖7 可以看出， 蓖麻堿對于羥自由基的清除率略高于Vc，并且蓖麻堿的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，表明蓖麻堿與羥自由基具有良好的量效關(guān)系，當(dāng)濃度達(dá)到9 mg/mL 時(shí)，蓖麻堿對羥自由基的清除率可達(dá)78.7%， 表明蓖麻堿具有良好的抗氧化活性（李伶，2022；武佳文，2021；康大偉，2017）。

圖7 蓖麻堿對羥自由基清除能力

2.5 紅外結(jié)果分析 從圖8 可以看出， 由于-C=O 與環(huán)上＞C＝C＜不飽和鍵的共扼作用，使-C=O 吸收峰出現(xiàn)在1660 cm-1；2929 cm 為-CH3的-C-H伸縮振動吸收峰；1053 cm-1為-C-O 伸縮振動引起的吸收峰；1378 cm-1為-CH3彎曲振動吸收峰；2224 cm-1為典型的-C≡N 三鍵伸縮振動引起的吸收峰。1542 cm-1可歸結(jié)為吡啶環(huán)的骨架伸縮振動；3479 cm-1為雜質(zhì)水引起的吸收峰。 綜上，可以確定提取物為蓖麻堿，即3-氰基-4-甲氧基-1-甲基-2-吡啶酮，分子式為C8H8N2O2。

圖8 紅外光譜分析

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明：（1） 以蓖麻餅粕為原料，以水為提取劑，采用超聲波輔助法提取蓖麻堿，最佳的提取工藝為：提取溫度70 ℃，提取時(shí)間50 min，料液比1:20（g/mL），在此條件下提取率為5.34%。（2） 蓖麻堿具有一定的抗氧化性， 當(dāng)蓖麻堿濃度為10 mg/mL 時(shí)， 對DPPH·自由基的清除率為60.3%。 小于Vc 對DPPH·自由基的清除能力。 蓖麻堿對·OH 具有一定的清除能力，當(dāng)蓖麻堿濃度為9 mg/mL 時(shí)，蓖麻堿對羥自由基的清除率可達(dá)78.7%， 略強(qiáng)于Vc 對·OH 自由基的清除能力。（3） 蓖麻餅粕中蓖麻堿提取物，經(jīng)三氯乙烷回流，無水乙醇重結(jié)晶，可得到純品蓖麻堿。紅外分析結(jié)果表明，提取物為蓖麻堿。