王雅麗， 郗艷菊， 楊紅亞， 陸 安， 郝慶紅，4 ， 郭云霞， 吳國江

（1.河北農業(yè)大學生命科學學院，河北 保定 071001；2.河北省功能性飼料添加劑技術創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050011；3.石家莊九五堂生物科技有限公司，河北 石家莊 050011；4.河北省飼用微生物技術創(chuàng)新中心，河北 保定 071001）

隨著抗生素耐藥性、 殘留及耐藥菌株等問題的日益嚴重（Tian，2021；徐文豪，2019；Schokker，2017），2019 年7 月10 日， 國家農業(yè)農村部發(fā)布《中華人民共和國農業(yè)農村部公告第194 號》（農業(yè)農村部，2019），明確12 種促生長藥物飼料添加劑退出歷史舞臺，從呼吁在飼料中“減抗替抗”，到現在國家正式出臺“飼料禁抗”“養(yǎng)殖減抗”“食品無抗”相關政策法規(guī)，在這樣的背景下，畜禽“無抗養(yǎng)殖”成為一種趨勢。 研究報道，乳酸菌及其代謝產物可以降低腸道pH，抑制有害菌，促進機體免疫功能，提高飼料利用率，促進營養(yǎng)物質的消化吸收，達到防治疾病，提高動物生產性能目的（梅文晴，2021；Reuben，2019； 曾燕霞，2018； 劉鳳美，2018）。將乳酸菌及其代謝產物代替抗生素是養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個方向， 因此有必要對乳酸菌及其代謝產物的相關作用進行一定的評估， 加快其在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應用。 本試驗旨在篩選產酸能力較強的乳酸菌菌株，探究其抑菌性能，為其在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應用提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、擬輪枝鐮孢菌（保存于河北農業(yè)大學生命科學學院藥理學實驗室）。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS 液體培養(yǎng)基由蛋白胨10.0 g；牛肉膏10.0 g；吐溫80 1.0 mL；硫酸鎂0.2 g；酵母粉5.0 g；無水乙酸鈉5.0 g；硫酸錳0.2 g；磷酸二氫鉀2.0 g；檸檬酸銨2.0 g；葡萄糖20 g；蒸餾水1000 mL 組成；冰乙酸調pH 至6.2 ～6.5。 MRS 固體培養(yǎng)基是在配制好的MRS 液體培養(yǎng)基中，1000 mL放入20 g 瓊脂粉，滅菌備用。 MRS-CaCO3培養(yǎng)基是在無菌的MRS 固體培養(yǎng)基中，放入滅菌備用的CaCO3溶液，充分混勻。 NA 培養(yǎng)基由蛋白胨10.0 g；牛肉膏3.0 g；NaCl 5.0 g；瓊脂20.0 g；蒸餾水1000 mL組成。 NB 培養(yǎng)基是液體NA 培養(yǎng)基，用于細菌的發(fā)酵。 PDA 培養(yǎng)基由馬鈴薯200.0 g； 葡萄糖20.0 g；瓊脂20.0 g；蒸餾水1000 mL 組成，用于對峙培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 2.5%石蕊溶液、 吲哚試劑、Nessler 試劑、結晶紫液、0.5%番紅溶液等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗預處理 分離乳酸菌采用稀釋涂布法，取10.0 g 雞腸道樣品放入錐形瓶中，加入90 mL滅菌備用的MRS 液體培養(yǎng)基中，180 r/min 振蕩30 min 混勻， 置于37 ℃搖床培養(yǎng)24 h， 即制成10-1溶液。

1.2.2 乳酸菌的分離與篩選 準確吸取預處理的腸道樣品的MRS 液體培養(yǎng)液1.0 mL，進行10 倍梯度稀釋，將CaCO3-MRS 培養(yǎng)基溶解，倒入無菌平板中，待其凝固后，取合適梯度（10-5、10-6、10-7）菌液1.0 mL 分別進行平板涂布， 置于37 ℃恒溫中培養(yǎng)48 h。 選擇有較大溶鈣圈的菌落，用竹簽挑取，接種到MRS 斜面上， 平放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，可將腸道中乳酸菌進行初步分離與篩選。將分離的乳酸菌菌株十字劃線于傾注了CaCO3-MRS 固體培養(yǎng)基的平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察記錄溶鈣圈直徑； 從初篩中挑取較優(yōu)良的菌株進行復篩，在CaCO3-MRS 固體培養(yǎng)基平板上， 打孔器打孔，取搖床培養(yǎng)48 h 的菌液50 μL 注入孔中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，記錄溶鈣圈的直徑。

1.2.3 產酸菌株鑒定

1.2.3.1 菌落形態(tài)觀察 觀察菌落形態(tài)， 包括顏色、大小、形狀、培養(yǎng)基顏色及溶鈣圈等。挑取單菌落進行革蘭氏染色和芽孢染色試驗。

1.2.3.2 分子生物學鑒定 將篩選所得較優(yōu)良菌株的菌體，接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，搖床培養(yǎng)48 h 后備用。 使用試劑盒提取基因組DNA，PCR 反應體系如表1 所示， 首先對菌株進行革蘭氏染色， 再按照北京百泰克公司生產的試劑盒使用手冊進行操作。 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物并純化， 送華大基因技術服務有限公司測序， 序列用NCBI-BLAST 進行同源性比較，選取序列相似性高的標準菌株，用Clusta1.83和MEGA5.0 進行序列分析并構建發(fā)育樹。

1.2.3.3 生理生化試驗 將分離獲得的菌株分別接種于相應的生理生化培養(yǎng)基，進行淀粉水解試驗、V-P 試驗、甲基紅試驗、吲哚產生試驗、過氧化氫酶測定等生理生化試驗。 參照 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠，2001）和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》 對菌株進行鑒定 （趙斌，2002）。

1.2.4 發(fā)酵液中有機酸的測定 參照馬瑞（2012）方法， 以乳酸 （純度為98%）， 乙酸 （純度為99.5%），檸檬酸（純度為99.5%），用流動相溶解并定容至100 mL，所配制溶液均經0.22 μm 微孔濾膜過濾所得標準品。 有機酸測定色譜條件： Atlantis C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動相為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀∶甲醇=30∶70， 進樣量30 μL，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長210 nm。

1.2.5 抑菌性能測定

1.2.5.1 菌懸液的制備 參照李凡姝（2016）方法制備L-2 菌株發(fā)酵液；參照楊雪海（2011）方法制備細菌菌懸液；參照Cheong（2014）方法制備真菌菌懸液。

1.2.5.2 抑菌性測定 參照張輝華（2001）方法制備NA 培養(yǎng)基平板， 測定對細菌的抑菌性； 參照Magnusson 等（2003）方法制備PDA 培養(yǎng)基平板，測定對真菌的抑菌性。

1.2.6 數據處理與統(tǒng)計 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析，MEGA7.0 進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結果與分析

2.1 高產乳酸菌的篩選 由表2 可知，初篩篩選所得到100 株菌株中，58 株菌株具有溶鈣圈，溶鈣圈超過20 mm 的有21 株。

表2 篩選所得菌株溶鈣圈結果

從表3 可以看出，復篩得到H-1、L-2、C-2、B-8 4 株產酸活性強而穩(wěn)定，且生長優(yōu)良的菌株，其中菌株L-2 的透明圈最大。圖1 為L-2 菌株在MRS 培養(yǎng)基上的溶鈣圈， 圖2 為菌株L-2 的發(fā)酵液中HPLC有機酸色譜圖，其中乳酸含量最高，為49.85 g/L。

圖1 L-2 菌株在MRS 培養(yǎng)基上的溶鈣圈

圖2 菌株L-2 發(fā)酵液HPLC 色譜圖

表3 復篩四株菌的溶鈣圈結果mm

2.2 菌落和菌體形態(tài)觀察 將篩選得到的L-2 菌株，通過稀釋涂布平板法，獲得單菌落，觀察、記錄菌落形態(tài)、邊緣等特征，挑取單菌落，然后再在顯微鏡下觀察。 記錄菌株的形態(tài)、邊緣等結果（表4）。

表4 菌落與菌體形態(tài)

2.3 16S rDNA 測序結果

2.3.1 PCR 擴增電泳檢測 以菌株LB-1-23 的基因組DNA 為模板對其16S rDNA 基因序列進行PCR 擴增，PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。

圖3 菌株L-2 PCR 擴增電泳圖

2.3.2 L-2 菌株系統(tǒng)樹的構建 將L-2 菌株的拼接序列，基于NCBI 條件下，進行BLAST 比對搜索， 選取同源性較高時模式菌株的16S rDNA 基因序列，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。 如圖4 可知，菌株L-2與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚在同一分支上，親源關系最近，同源性為99%，再根據菌落與菌體形態(tài)，初步鑒定菌株L-2 為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖4 基于16S rDNA 基因序列L-2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 生理生化鑒定結果 從表5 生化試驗結果可以看出，L-2 菌株在明膠液化、接觸酶等方面與所驗證菌株的生化特征保持一致性。由此表明，通過PCR 擴增電泳圖，革蘭氏染色，芽孢染色，生理生化驗證等，從雞腸道中篩選所得到的L-2 菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

表5 生理生化鑒定結果

2.5 菌株L-2 對腸道病原菌的抑菌作用 由表6、表7 可以看出，菌株L-2 發(fā)酵液對細菌、真菌均有廣譜抑菌效果。 菌株L-2 發(fā)酵液對大腸桿菌、 沙門氏菌、 痢疾桿菌的抑菌圈直徑分別為19.5、18.3、17.8 mm， 且對大腸桿菌的抑菌性優(yōu)于其他兩種致病菌。 菌株L-2 發(fā)酵液對尖孢鐮孢菌等真菌也具有抑制性，且抑菌圈直徑比細菌小，說明真菌對菌株L-2 發(fā)酵液的敏感度較低。 試驗結果表明，從動物腸道中篩選得到的菌株L-2 發(fā)酵液對病原菌有很好的抑制性， 可有力減少腸道內細菌和真菌感染所致的疾病，改善腸道環(huán)境。

表6 菌株L-2 發(fā)酵液對細菌的抑制作用

表7 菌株L-2 發(fā)酵液對真菌的抑制作用

3 結論

本研究從雞腸道中篩選出具有較強產酸能力的菌株L-2，經生理生化反應和16S rDNA 序列分析鑒定為植物乳桿菌，經高效液相色譜分析發(fā)現，菌株L-2 發(fā)酵液中可產生乳酸、乙酸和檸檬酸等有機酸， 通過打孔法測定L-2 菌株的抑菌作用，菌株L-2 發(fā)酵液對三種食源性致病細菌均表現出很好的抑菌效果， 且對大腸桿菌的抑制效果最為顯著，說明菌株L-2 發(fā)酵液中存在抑制細菌成分，該結果與其他文獻報道（孫杰，2020；李衛(wèi)娜，2019；楊雪梅，2011）研究結果基本一致。菌株L-2發(fā)酵液對尖孢鐮孢菌等真菌也具有抑制性， 抑菌圈直徑均超過14 mm，該結果與Cheong （2014）發(fā)現，12 株植物乳桿菌具有抑制真菌活性結果一致。Magnusson（2003）對1200 株乳酸菌進行研究，發(fā)現其中幾株植物乳桿菌對真菌具有強抑制活性。 菌株L-2 能夠產生乳酸、乙酸等有機酸，破壞病原菌細胞膜結構，從而產生抑菌作用，這與Yin等（2020）發(fā)現，植物乳桿菌DY-6 的主要抑菌物質為乳酸、乙酸等報道一致。本研究篩選出的乳酸菌L-2 可對進一步開發(fā)抑菌微生態(tài)制劑用于畜禽類疾病防控提供一定基礎。