謝晨杰， 宋超東， 譚柄福， 楊登峰， 申乃坤， 姜明國(guó)， 張紅巖

（1.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西海洋微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530008；2.廣西科學(xué)院北部灣海洋研究中心，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007）

近年來(lái)，全球家禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，每年可產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)噸的羽毛（Li，2019）。如此巨大數(shù)量的廢棄羽毛如果采用填埋或焚燒等方法處理， 不僅會(huì)造成土壤、 空氣等的污染， 還會(huì)傳播疾病（Cedrola 等，2012；Sarkar 等，2012；Agrahari 等，2010；Saber 等，2010）。然而羽毛廢棄物是自然界中蛋白質(zhì)含量最高的資源之一，其中β-角蛋白含量約占85%（Li 等，2020）。但角蛋白分子中含有大量相互交聯(lián)的二硫鍵、氫鍵等化學(xué)鍵，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易被降解（Li 等，2020；Callegaro 等，2018）。 因此，羽毛廢棄物需要處理后才能應(yīng)用。目前采用的物理、化學(xué)等方法在降解羽毛的過(guò)程中存在污染環(huán)境、成本高等問題， 同時(shí)還會(huì)破壞羽毛中的一些必需氨基酸（張榮等，2020；Cascarosa 等，2012） 。 而利用微生物降解廢棄羽毛， 不僅能改善環(huán)境污染等問題， 也能將羽毛廢棄物轉(zhuǎn)化為大量氨基酸應(yīng)用于飼料、肥料等行業(yè)（張榮等，2020），是一種綠色經(jīng)濟(jì)的方法（Deniz 等，2021；Sharma 等，2018）。

目前已發(fā)現(xiàn)多種微生物能分泌角蛋白酶降解羽毛，包括真菌、放線菌和細(xì)菌（Gurav 等，2020；Jaouadi 等，2015；Habbeche 等，2014）。產(chǎn)角蛋白酶的真菌有鐮刀菌屬、曲霉屬等。 如Aspergillussp.DHE7 表現(xiàn)出了很高的角蛋白酶活性（El-Ghonemy 等，2021）。 但真菌多為致病菌，商業(yè)價(jià)值較小（楊連等，2015）。放線菌中可分泌角蛋白酶的菌株多為鏈霉菌屬， 該屬菌除可分泌角蛋白酶降解廢棄羽毛外，還能利用菌絲纏繞在羽毛上，對(duì)羽毛有一定的機(jī)械破壞力， 使羽毛能夠更快更好地完成降解，但放線菌存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、酶活較低等問題（Li 等，2020）。 與真菌和放線菌相比，細(xì)菌的生長(zhǎng)周期短、發(fā)酵時(shí)間短、產(chǎn)角蛋白酶活性高，因此對(duì)細(xì)菌角蛋白酶的研究一直是國(guó)內(nèi)外的熱點(diǎn)話題（Jaouadi 等，2015）。 目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)角蛋白酶的細(xì)菌多為芽孢桿菌。 如BacillusparamycoidesGxun-30（張妮等，2020）、Bacillussp.NKSP-7 （Akram 等，2020）、Bacillussp.NDS-10（Akram 等，2021）等都能分泌角蛋白酶，且具有較高的羽毛降解能力。除此之外， 產(chǎn)角蛋白酶的細(xì)菌還有Pseudomonas aeruginosaGxun-7 （楊夢(mèng)瑩等，2022）、Serratia marcescens（耿芳等，2018）、Caldicoprobacter guelmensis（Bouacem 等，2015）等。 角蛋白酶除了可以降解角蛋白外，還可用于牲畜飼料、生物醫(yī)學(xué)、皮革、紡織、洗滌及環(huán)保等工業(yè)（Nnolim 等，2020；Brandelli 等，2015；Brandelli 等，2010）。因此，尋找高效的角蛋白酶分泌菌株是目前研究熱點(diǎn)之一（Akram 等，2020）。但目前分泌角蛋白酶的菌株存在降解效果差、酶活低、抗逆性差等問題，急需尋找可高產(chǎn)角蛋白酶且抗逆性強(qiáng)的菌株。

目前陸地微生物資源的挖掘日益困難，而海洋微生物資源不僅豐富而且開發(fā)程度低 （張妮等，2020）。 所以本研究在前期已從海洋環(huán)境篩選出大量可產(chǎn)角蛋白酶菌株的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從廣西北部灣某海鴨養(yǎng)殖基地取樣， 分離高效降解羽毛的菌株，并對(duì)菌株發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，最后對(duì)羽毛降解液中游離氨基酸組成及含量進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 材料 采集廣西北部灣海鴨養(yǎng)殖基地灘涂沙、羽毛等樣品，裝入自封袋中低溫帶回實(shí)驗(yàn)室并儲(chǔ)存于4 ℃（文冰潔，2018）。雞羽毛收集于家禽屠宰場(chǎng)，用自來(lái)水沖洗去除雜質(zhì)，隨后烘干至衡重，最后將羽毛剪成1 ～2 cm 的小段，保存在密封袋中備用（Wang 等，2017）。

1.2 主要試劑與儀器 干酪素、福林酚、三氯乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。 GelDoc XR BI0-RAD 凝膠電泳成像分析儀， 北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司；L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀，日立高新技術(shù)公司；Tgradient 型多功能梯度PCR 儀，德國(guó)Biometra公司；Regulus 8100 場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司。

1.3 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基、初篩培養(yǎng)基、羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基等配制參考李志偉 （2020）、 東秀珠等（2001）的方法進(jìn)行。

1.4 菌株的篩選

1.4.1 富集 8 g 樣品土壤加入到20 mL 的無(wú)菌水中，放入搖床充分混合30 min，取上清接種于富集培養(yǎng)基。 180 r/min 搖床37 ℃培養(yǎng)2 d。

1.4.2 初篩 將富集培養(yǎng)液按10-1～10-7梯度稀釋后，涂布于初篩培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)。 挑選透明圈大的菌株進(jìn)行劃線純化， 并計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值。

1.4.3 復(fù)篩 將上述透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株接種于20 mL 的LB 肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 的搖床培養(yǎng)12 h 制備種子液。 種子液按照2%（V/V） 的接種量接種到羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液上清即為粗酶液，取樣測(cè)定其酶活，根據(jù)羽毛降解效果和酶活大小進(jìn)行復(fù)篩。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 形態(tài)與生理生化特征鑒定 觀察培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)特征。 革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。 在掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)及大小。 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)該菌進(jìn)行生理生化鑒定（劉曉迪等，2012）。

1.5.2 16S rDNA 鑒定 按照楊夢(mèng)瑩等（2022）的方法進(jìn)行16S rDNA 鑒定，確定菌株的分類地位。

1.6 菌株的產(chǎn)酶條件

1.6.1 角蛋白酶酶活測(cè)定 參考張妮等（2020）的方法進(jìn)行酶活測(cè)定。 把50 ℃時(shí)1 min 催化酪蛋白生成1 μg 酪氨酸所需要的酶量定義為1 個(gè)酶活單位（U）。

1.6.2 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 在初始發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 （羽毛10 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO41.4 g/L，MgSO40.1 g/L，KH2PO40.7 g/L， 初始pH 7.0，30 ℃，200 r/min，接種量2%，裝液量50/250 mL，發(fā)酵時(shí)間48 h）下采用單因素試驗(yàn)探究菌株產(chǎn)酶的最適羽毛含量 （0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，m/V）、最佳碳源（葡萄糖、蔗糖、果糖、木薯粉、可溶性淀粉）、最佳碳源濃度（10、20、30、40、50 g/L）、最適氮源（玉米漿、酪蛋白、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨、尿素）、最適pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）。 每組試驗(yàn)進(jìn)行三次，結(jié)果取平均值。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選出對(duì)產(chǎn)角蛋白酶有顯著影響的4 個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平L9（34）的正交優(yōu)化試驗(yàn)。 以角蛋白酶酶活（U/mL）作為響應(yīng)值，確定發(fā)酵條件的最優(yōu)組合，并對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證。

1.7 粗酶液的酶學(xué)性質(zhì) 采用單因素試驗(yàn)探究菌株所產(chǎn)角蛋白酶的最適作用條件。 按照上文提到的方法制備粗酶液應(yīng)用于下述試驗(yàn)。 粗酶液與酪蛋白底物反應(yīng)后通過(guò)測(cè)定角蛋白酶的活性判斷角蛋白酶的最適作用條件。

1.7.1 酶的最適作用溫度 酶與底物在不同溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）下反應(yīng)10 min。

1.7.2 酶的溫度穩(wěn)定性 粗酶液于不同溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）下水浴10 min 后與底物反應(yīng)。

1.7.3 酶的最適pH 用pH 分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的Tris-HCl 緩沖液和pH 為9.0的Gly-NaOH 緩沖液稀釋粗酶液后與底物反應(yīng)。

1.7.4 化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響 用pH 為7.5 的Tris-HCl 緩沖液配制相同濃度的乙二胺四乙酸（EDTA）、SDS、PMSF、β-巰基乙醇、 二甲基亞砜（DMSO）和異丙醇，分別加入到粗酶液中與底物反應(yīng)。 并用pH 為7.5 的Tris-HCl 緩沖液作為空白對(duì)照。

1.7.5 金屬離子對(duì)酶活性的影響 用pH 為7.5的Tris-HCl 緩沖液配制不同濃度（0.05、0.5、5 mmol/L）的金屬離子溶液（NaCl、KCl、SrCl2、MnCl2、CaCl2、CoCl2、MgCl2、CuCl2、AlCl3）， 然后分別稀釋粗酶液后與底物反應(yīng)。 用pH 為7.5 的Tris-HCl緩沖液作空白對(duì)照。

1.7.6 酶的底物特異性 分別選擇人的頭發(fā)、雞的羽毛、雞羽毛粉、角蛋白、酪蛋白和牛血清作為底物， 用pH 為7.5 的Tris-HCl 緩沖液將上述底物配制成2%的濃度 （不溶性的底物進(jìn)行粉碎處理），然后與粗酶液進(jìn)行反應(yīng)。

1.7.7 測(cè)定酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 用pH 為7.5 的Tris-HCl 緩沖液配制濃度分別為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%（m/V）的最適底物溶液，然后與經(jīng)適當(dāng)稀釋后的粗酶液混合， 在其最適溫度下分別反應(yīng)10 min， 測(cè)定角蛋白酶活性。 根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法作1/V0-1/[S] 圖，計(jì)算Km值和Vmax值。

1.8 羽毛降解產(chǎn)物的游離氨基酸分析 用5%的磺基水楊酸按1：5 的比例沉淀羽毛降解液2 h，4 ℃、12000 r/min 離心20 min， 收集上清液并用0.2 μm 的膜濾器過(guò)濾， 采用L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析 用SPSS 21.0 和Graph-Pad Prism 8 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，用Mega 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選 將經(jīng)過(guò)富集和稀釋的富集培養(yǎng)基涂布于初篩培養(yǎng)基上， 從中挑選出現(xiàn)透明圈的菌落劃線培養(yǎng)，共分離得到75 株產(chǎn)生透明圈的菌株（圖1A）。將這些菌株的種子液接種到羽毛發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中有56 株菌對(duì)羽毛有較好的降解效果，隨后測(cè)定發(fā)酵上清的角蛋白酶酶活，挑選出酶活較高的菌株。最終選定15 號(hào)菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)， 并將該菌命名為Gxun-15。 該菌能在發(fā)酵48 h 后，將培養(yǎng)基中1%（m/V）的羽毛降解80%以上（圖1B），酶活可達(dá)202.35 U/mL。

圖1 菌株的篩選

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化特性 Gxun-15 菌落在酪蛋白平板上呈淺黃色，菌落凸起，邊緣較光滑（圖2A）。Gxun-15 為革蘭氏陰性菌（圖2B）。掃描電鏡觀察菌體呈桿狀（圖2C）。

圖2 Gxun-15 的形態(tài)特征

菌株生理生化試驗(yàn)中鑒定結(jié)果表明， 硫化氫試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，其余V-P、硝酸鹽還原、甲基紅等結(jié)果均為陰性（表1）。 根據(jù)菌株形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，將Gxun-15 初步鑒定為假單胞菌屬菌株（Pseudomonnasspp.）。

表1 Gxun-15 的生理生化特征

2.2.2 菌株的分子鑒定 將菌株Gxun-15 的16S rDNA 測(cè)序后，在EZ BioCloud 上進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果顯示，Gxun-15 菌株基因序列與彎曲假單胞菌（Pseudomonas geniculata）ATCC19374 同源性最高，為99.51%。 將Gxun-15 的16S rDNA 序列提交到NCBI，獲得的GenBank 登錄號(hào)為OP975708。 進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示Gxun-15 為彎曲假單胞菌（P.geniculata）（圖3）。根據(jù)菌株形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA 序列鑒定結(jié)果，最終將該菌命名為P.geniculataGxun-15。

圖3 菌株Gxun-15 基于16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 單因素優(yōu)化結(jié)果 當(dāng)羽毛濃度較低時(shí)，酶活隨羽毛含量增加而增大， 但當(dāng)濃度高于3.0%（m/V）時(shí)，酶活反而下降。 羽毛含量為3%（m/V）時(shí)，酶活達(dá)到最高，為294.01 U/mL，因此，該菌株的最佳羽毛添加量為3%（m/V）（圖4A）。 與對(duì)照相比，添加葡萄糖、蔗糖、木薯粉、可溶性淀粉為碳源時(shí)，均能顯著（P＜0.05）提高角蛋白酶活，其中添加蔗糖時(shí)酶活最高，為275.62 U/mL（圖4B）。進(jìn)一步優(yōu)化蔗糖濃度， 其最適添加量為40 g/L，酶活可達(dá)331.68 U/mL（圖4C）。氮源優(yōu)化結(jié)果表明，與其他氮源相比，添加酪蛋白時(shí)菌株產(chǎn)酶活性最高，為245.50 U/mL（圖4D）。 雖然添加玉米漿或硫酸銨與添加酪蛋白酶活差異不顯著 （P＞0.05），但添加酪蛋白時(shí)羽毛降解效果更好，所以最優(yōu)氮源為酪蛋白。 最后對(duì)菌株發(fā)酵初始pH 進(jìn)了優(yōu)化，當(dāng)pH 為7.5 ～9.0 時(shí)菌株降解羽毛效果較好， 酶活相對(duì)較高且趨于平穩(wěn)， 因此最適pH為7.5 ～9.0（圖4E）。

圖4 Gxun-15 產(chǎn)酶條件的單因素優(yōu)化

2.3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化Gxun-15 的最佳產(chǎn)酶條件根據(jù)上述單因素結(jié)果，選取羽毛、酪蛋白、蔗糖、初始pH 這4 個(gè)對(duì)酶活影響較大的因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)（表2）。 由正交試驗(yàn)和方差分析的結(jié)果（表3、表4）可知，4 個(gè)因素對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響均為極顯著（P＜0.01），主次順序?yàn)橛鹈珴舛龋ˋ）＞初始pH（D）＞碳源（C）＞氮源（B）。 最優(yōu)組合方案為A2B1C3D1，即羽毛濃度2.5%（m/V），酪蛋白濃度1 g/L，蔗糖濃度40 g/L，初始pH 7.5。 在確定最優(yōu)組合下進(jìn)行3 個(gè)平行驗(yàn)證試驗(yàn)，平均酶活為（674.39±5.81）U/mL，與預(yù)測(cè)值相符，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)的正確性。 與初始酶活（202.35 U/mL）相比，優(yōu)化后酶活提高了3.3 倍。

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析

2.4 角蛋白酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液的最適作用溫度 粗酶液反應(yīng)溫度在30 ～60 ℃時(shí)， 酶活隨溫度的升高而增大；但在60 ～90 ℃時(shí)，酶活隨溫度增高而減?。划?dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，酶活最高可達(dá)642.63 U/mL。 因此，該酶的最適作用溫度為60 ℃（圖5）。

圖5 粗酶液的最適作用溫度

2.4.2 Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液的溫度穩(wěn)定性 粗酶液經(jīng)不同溫度處理后，酶活均下降。在50 ℃以下其酶活性下降相對(duì)緩慢， 即低溫對(duì)酶的破壞性較弱；在50 ～60 ℃時(shí)，酶活性下降最快，60 ℃時(shí)相對(duì)酶活性低于20%；90 ℃時(shí)相對(duì)酶活性降到10%以下，可見高溫對(duì)酶的破壞性較大（圖6）。

圖6 粗酶液的溫度穩(wěn)定性

2.4.3 Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液的最適作用pH Gxun-15 所產(chǎn)粗酶液在pH 為5.5 ～6.5 時(shí)，酶活性隨pH 的增大而增大； 在pH 為6.5 ～8.0時(shí)，酶活性相對(duì)穩(wěn)定；但當(dāng)pH 超過(guò)8.0 時(shí)，酶活性下降迅速（圖7）。 因此，該角蛋白酶的最適pH 為6.5 ～8.0。

圖7 粗酶液的最適作用pH

2.4.4 化學(xué)試劑對(duì)Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液活性的影響 化學(xué)試劑中β-巰基乙醇對(duì)酶活具有極顯著促進(jìn)效果（P＜0.01），可使酶活提高5倍。EDTA、DMSO 和異丙醇對(duì)酶活幾乎無(wú)影響。但SDS 和PMSF 能夠抑制角蛋白酶酶活， 其中添加PMSF 的相對(duì)酶活性僅為34.49%， 由此可知該角蛋白酶為絲氨酸蛋白酶（圖8）。

2.4.5 金屬離子對(duì)Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液活性的影響 Na+、Mg2+、K+從離子濃度0.05 ～5 mmol/L逐漸抑制酶活。 Mn2+從離子濃度0.05 ～5 mmol/L逐漸促進(jìn)酶活，當(dāng)Mn2+濃度為5 mmol/L 時(shí)，促進(jìn)效果最明顯，相對(duì)酶活達(dá)到192.18%。 Sr2+在濃度為0.05 mmol/L 時(shí)對(duì)酶活性無(wú)影響， 但當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mmol/L 時(shí)，對(duì)酶活有促進(jìn)作用，濃度進(jìn)一步增大到5 mmol/L，促進(jìn)作用減弱。 Al3+和Cu2+對(duì)酶活的抑制效果極顯著（P＜0.01）。添加了離子濃度為5 mmol/L 的Al3+和Cu2+的相對(duì)酶活分別為9.70%和13.47%（表5）。

表5 金屬離子對(duì)Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液活性的影響（相對(duì)活性）%

2.4.6 Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液的底物特異性 圖9 的底物特異性結(jié)果表明，Gxun-15 所產(chǎn)粗酶液對(duì)可溶性底物和不可溶性底物均具有一定的降解能力，其中對(duì)酪蛋白的降解能力最好，對(duì)角蛋白的降解能力次之。 以角蛋白為底物的酶活超過(guò)了酪蛋白酶活的1/2， 符合角蛋白酶的定義（Gurav 等，2020）。 以羽毛為底物的酶活低于羽毛粉，可能是酶與羽毛底物的接觸面積小于羽毛粉，反應(yīng)不充分。 該酶對(duì)頭發(fā)、羽毛的降解能力較弱，原因可能是二者均為固體不溶物。 牛血清作為可溶性底物，酶對(duì)它的降解能力比對(duì)酪蛋白低很多，說(shuō)明該酶對(duì)酪蛋白有一定的底物專一性， 且專一性很強(qiáng)。

圖9 粗酶液的底物特異性

2.4.7 Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液的動(dòng)力學(xué)性質(zhì) 以酪蛋白為底物測(cè)其酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)， 得酶動(dòng)力學(xué)公式為y=0.02558x+7.669， 線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.9850，Km值為0.003 g/mL，Vmax值為0.130 mg/mL·min。 Km值比較小，說(shuō)明Gxun-15 分泌的角蛋白酶對(duì)酪蛋白底物具有良好的匹配性， 酶液的催化速率較高（圖10）。

圖10 粗酶液的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

2.5 羽毛降解產(chǎn)物的游離氨基酸分析 Gxun-15的羽毛降解液中共檢測(cè)到16 種游離氨基酸，總含量達(dá)到221.24 mg/L， 遠(yuǎn)高于目前文獻(xiàn)報(bào)道的GRK（表6）。 16 種氨基酸中有7 種為必需氨基酸， 必需氨基酸總量占游離氨基酸總量的70.34%， 其中苯丙氨酸含量最高為118.36 mg/L。而對(duì)照組游離氨基酸總共有9 種， 總含量?jī)H有16.56 mg/L。

表6 羽毛降解產(chǎn)物游離氨基酸成分mg/L

3 討論與結(jié)論

本研究從廣西北部灣海鴨養(yǎng)殖基地取樣，篩選出了一株高效羽毛降解菌株， 經(jīng)鑒定為P.geniculataGxun-15。 該菌株在降解尼古?。↙iu等，2014）， 維持植物根部離子平衡 （Singh 等，2020），促進(jìn)植物生長(zhǎng)（Gopalakrishnan 等，2015）等方面有相關(guān)研究， 但目前鮮見關(guān)于彎曲假單胞菌在羽毛降解方面的研究報(bào)道。

Gxun-15 經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化最佳羽毛添加量為2.5%（m/V）， 高于菌株B.aryabhattaiS-2 報(bào)道的1%（m/V）（倪維敏等，2022），說(shuō)明該菌具有較好的羽毛降解能力；其最佳碳源為40 g/L 蔗糖，這與菌株B.subtilisA1-2 不同（閆志宇等，2015），說(shuō)明不同菌株具有不同的碳源需求。 在羽毛降解過(guò)程中，隨著羽毛的降解，會(huì)釋放出氨，羽毛培養(yǎng)基的pH 會(huì)進(jìn)一步上升。 而菌株Gxun-15 產(chǎn)角蛋白酶的能力在初始pH 為弱堿性環(huán)境（pH 7.5）時(shí)較強(qiáng)。由此可見，Gxun-15 在發(fā)酵過(guò)程中能更好地適應(yīng)pH 較為波動(dòng)的發(fā)酵環(huán)境，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力，這與報(bào)道的B.subtilisA1-2 菌株類似（閆志宇等，2015）。 菌株Gxun-15 優(yōu)化后酶活力可達(dá)674.39 U/mL，較優(yōu)化前的酶活（202.35 U/mL）提高了3.3 倍，高于許多其他報(bào)道菌株酶活性，如B.tropicusGxun-17（112.57 U/mL）（Shen 等，2022）、B.pumilusJYL（57.14 U/mL）（Sun 等，2020）。

角蛋白酶的作用溫度與來(lái)源微生物的生存環(huán)境有關(guān)， 多數(shù)微生物來(lái)源的角蛋白酶最適溫度為30 ～80 ℃，最適pH 為7.5 ～9.0。Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶的最適作用溫度為60 ℃，與目前一些報(bào)道類似 （Shen 等，2022；Sun 等，2020； 閆志宇等，2015）， 但低于異常嗜熱分泌角蛋白酶最適溫度（100 ℃）（Nam 等，2002） ， 而高于Chrysosporium indicum分泌角蛋白酶的最適溫度 （35 ℃）（Sharma 等，2016） 。 Gxun-15 所產(chǎn)角蛋白酶的最適pH為6.5 ～8.0， 這與目前多數(shù)細(xì)菌分泌角蛋白酶相同， 但低于Nocardiopsissp.TOA-1 角蛋白酶的最適pH（12.5）（Mitsuiki 等，2004），高于Chrysosporium indicum最適pH（3）（Sharma 等，2016） 。 化學(xué)試劑β-巰基乙醇可使酶活提高5 倍，可能是因?yàn)棣?巰基乙醇具有很強(qiáng)的還原性，能夠促進(jìn)羽毛角蛋白中二硫鍵的斷裂，進(jìn)而提高角蛋白酶活，這與報(bào)道B.coagulansX3（雷平等，2022）相一致。 來(lái)源于微生物的角蛋白酶絕大多數(shù)為絲氨酸蛋白酶。PMSF 對(duì)該菌所產(chǎn)角蛋白酶有明顯的抑制作用，可知該角蛋白酶為絲氨酸蛋白酶， 與Bacillussp.RCM-SSR-102（Pintubala 等，2020）等菌株的報(bào)道相似。 以上結(jié)果表明菌株Gxun-15 分泌的角蛋白酶具有較好的化學(xué)試劑穩(wěn)定性， 在多種工業(yè)領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。

據(jù)報(bào)道， 利用Bacillus pumilusGRK 降解羽毛，游離氨基酸含量?jī)H有60.74 mg/L（Reddy 等，2017），而利用Gxun-15 降解，游離氨基酸總含量達(dá)到221.24 mg/L，是GRK 的3.6 倍。 且Gxun-15的羽毛降解產(chǎn)物中多為必需氨基酸， 主要氨基酸為苯丙氨酸、甲硫氨酸等，而GRK 的羽毛降解產(chǎn)物中異亮氨酸和賴氨酸相對(duì)含量較多。由此可見，不同微生物所產(chǎn)角蛋白酶對(duì)羽毛角蛋白的作用位點(diǎn)不同。 利用Gxun-15 降解羽毛，其降解產(chǎn)物中氨基酸含量豐富， 種類多， 在氨基酸有機(jī)肥（Sun等，2020）和動(dòng)物飼料蛋白產(chǎn)品開發(fā)（Li，2019）方面有巨大潛力。

因此，海洋來(lái)源的P.geniculataGxun-15 具有高效的羽毛降解能力， 其羽毛降解產(chǎn)物中富含多種氨基酸。該菌分泌的角蛋白酶為絲氨酸蛋白酶，具有良好的化學(xué)試劑穩(wěn)定性。 本研究為今后的羽毛廢棄物處理提供了新的菌種資源， 并且該菌在飼料、氨基酸肥料等方面具有良好的應(yīng)用前景。