常海軍，伯朝英，石源偉，熊 杰，胡 渝

（重慶工商大學環(huán)境與資源學院 重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲運工程技術研究中心 重慶 400067）

我國食品加工業(yè)中肉制品加工業(yè)已占有舉足輕重的位置。然而，肉及肉制品加工與儲藏過程中其成分的氧化卻是一種不可回避的自然現(xiàn)象。研究表明，肉類產(chǎn)品品質(zhì)降低主要是由于脂肪和蛋白質(zhì)的氧化作用[1]。此外，肌肉中含量最高的蛋白——肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein，MP），占據(jù)總蛋白的55%～60%[2]，具備不可或缺的生物學功能，這種蛋白不僅參與肌肉的收縮過程，而且對肉制品的嫩度也會產(chǎn)生顯著的影響，對于保持和提高肉制品品質(zhì)具有重要意義[3]。然而，在肉品的加工和儲存過程中，蛋白質(zhì)極易受到分子氧自由基或活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的侵害，導致其發(fā)生氧化變質(zhì)，從而影響其功能特性及消化率，進而損壞其品質(zhì)特性。肉蛋白抗氧化成為業(yè)界亟需解決的技術難題。目前合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚（BHA）、沒食子酸丙酯（PG）、特丁基對苯二酚（TBHQ）、二丁基羥基甲苯（BHT）等廣泛應用于肉類工業(yè)中脂肪和蛋白的抗氧化[4]，然而由于這些合成類抗氧化劑具有潛在的毒理學作用，選擇天然抗氧化劑代替合成類抗氧化劑成為必然的趨勢。

姜黃素是一種天然的、具備多重生物活性的化學物質(zhì)，它具有出色的抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌特性。同時，姜黃素還具有抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松等作用，是一種備受矚目的天然食藥同源物質(zhì)，該結構不僅包含基礎的碳鏈，還擁有酚羥基和β-二酮這兩個活躍部分，特別是二酮部分，它還展現(xiàn)烯醇式結構的變化[5-6]。宋立敏[7]對姜黃素類化合物在體外的抗氧化效果進行了研究，并探討了其對CCl4引發(fā)的肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抗氧化作用，研究結果表明姜黃素類化合物具有較好的抗氧化活性，并呈良好的劑量關系。李瑞化[8]報道姜黃素對脂多糖誘導牛乳腺上皮細胞氧化損傷導致的炎癥具有較好的保護作用。雖然姜黃素在許多方面的生物活性得到廣泛的研究，但是在肉蛋白抗氧化或與蛋白相互作用方面的研究仍較少。

本文選擇豬肉肌原纖維蛋白作為主要研究材料，并構建一個芬頓（Fenton）氧化系統(tǒng)來模擬肉制品的氧化過程，探究姜黃素對肌原纖維蛋白氨基酸側(cè)鏈基團、蛋白結構、溶解度的影響，旨在為肉制品中天然植物多酚類化合物的抗氧化應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮豬背最長肌，購于重慶市南岸區(qū)人人樂超市；姜黃素（純度為99%），上海阿拉丁試劑公司。

牛血清蛋白（BSA）、水溶性維生素E（Trolox）、哌嗪-1，4-二乙磺酸（PIPES）、L-抗壞血酸、L-亮氨酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA），上海阿拉丁試劑公司；5，5-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、溴化鉀、2，4-二硝基苯肼（DNPH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、ABTS+·、過氧化氫（H2O2，30%）、結晶紫、三氯化鐵等，上海阿達瑪斯試劑有限公司。所用試劑均為分析純級。

TGL-20 高速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；UV-1900 紫外-可見分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；日立F-7000 熒光分光光度儀，日本日立公司；IRPrestige-21 傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；多功能養(yǎng)生破壁機，廣東順德多蒙電器有限公司；Ultra-Turrax T25 高速均質(zhì)勻漿機，德國IKA-WERKE；pHS-3C+酸度計，成都世紀方舟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 姜黃素清除自由基能力測定

1.2.1.1 ·OH 清除能力 參考Wang 等[9]的方法并稍作修改，先用95%乙醇配制100 μmol/L 的姜黃素與VC 儲備液。分別按順序加入2 mL FeSO4（9 mmol/L）、乙醇-水楊酸（9 mmol/L）和適量的姜黃素或VC（0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mL）于15 mL 離心管中，再加入適量的去離子水，保證反應溶液的總體積為15 mL。最后再加入1 mL 的H2O2，搖勻。37℃水浴加熱15 min 后取出，測其吸光度，參比溶液為不加H2O2的體系，空白組為不加樣品的體系?！H 清除效率計算方法見式（1）。

式中，A0——空白組吸光度（不加樣品）；AX——樣品組吸光度；AX0——背景組的吸光度（不加顯色劑H2O2）。

1.2.1.2 ABTS+·清除能力 參考王鈺等[10]的方法并稍作修改，先用95%乙醇配制1 μmol/mL 姜黃素及0.2 μmol/mL VC 儲備液。取0.8 mL ABTS+·工作液于試管中，分別加入適量的姜黃素（0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 mL），再加入適量95%乙醇，保證每管總反應液為2.8 mL，振蕩搖勻，靜置反應6 min，于最大吸收波長734 nm 處測定吸光度并記錄為A樣品，以2 mL 95%乙醇溶液代替樣品溶液測定吸光度為A空。用VC 作為陽性對照。ABTS+·清除效率見式（2）。

式中，A空——乙醇代替樣品液的吸光度；A樣品——樣品溶液的吸光度。

1.2.1.3 DPPH·清除能力 參考常相娜等[11]報道的方法并稍作修改，先用95%乙醇配制0.1 μmol/mL 姜黃素及0.1 umol/mL VC 儲備液，用95%乙醇將DPPH 溶成0.004%溶液避光放置備用，取適量的樣品液于試管中（0.125，0.25，0.5，1.0，2.0 mL），添加適量95%乙醇，已確保每管加入的樣液體積為2.0 mL，再加入4.0 mL 0.004% DPPH 乙醇溶液，混合搖勻后室溫下避光反應30 min，用95%乙醇調(diào)零，在波長517 nm 處測得吸光度A1，用95%乙醇替代DPPH 乙醇溶液與樣品混勻后，在波長517 nm 處測得A2；最后用95%乙醇替代樣品與4.0 mL DPPH 無水乙醇溶液混合，在517 nm 處測得A3，同時用VC 做陽性對照。DPPH·清除效率見式（3）。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取 以豬背最長肌肉為原材料，參照Cao 等[12]的方法略作調(diào)整，具體操作如下：低溫下配制pH=7.0 肌原纖維蛋白提取液，其中包含0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA 和10 mmol/L 磷酸鈉，將冷藏的豬背最長肌肉室溫下自然解凍，切成小塊（約1 cm×1 cm×1 cm），然后置于絞肉機中。向絞肉機中加入4 倍體積的肌原纖維蛋白提取液，先以低檔位運行30 s，再以高檔位運行1 min，使肌肉塊充分破碎并勻漿化。將勻漿的肌肉提取液放入離心管中離心（8 000×g，10 min，4 ℃）。棄上清液，所得沉淀再加入4 倍體積的肌原纖維蛋白提取液，重復提取3次，最后為了除去蛋白中殘留的結締組織，將離心后得到的沉淀再次加入4 倍體積的0.1 mol/L Na-Cl 溶液中，充分攪拌均勻后過濾（3 層紗布），接著調(diào)整pH=6.25，并離心（參數(shù)同上），得到白色膏狀沉淀，稱為肌原纖維蛋白沉淀。試驗過程中要保持低溫環(huán)境（0～4 ℃），避免蛋白質(zhì)變性影響試驗結果，同時蛋白膏需在48 h 內(nèi)使用。

1.2.3 肌原纖維蛋白的氧化處理 參照熊杰等[13]報道的樣品處理方法，略加改動。稱取一定量的MP 蛋白膏，各自加入不同體積的姜黃素溶液（5 μmol/mL，溶解于芬頓氧化體系：5 mmol/L H2O2，30 μmol/L FeCl3，100 μmol/L 抗壞血酸），然后加入氧化體系，充分混勻后在4 ℃條件下氧化處理12 h，制得不同濃度姜黃素-蛋白溶液并通過加入1 mL 水溶性維生素E 結束氧化反應。添加姜黃素的試驗管中姜黃素最后濃度為5，10，15 μmol/mL和20 μmol/mL，分別記作ox+c5、ox+c10、ox+c15和ox+c20。最終，體系蛋白質(zhì)量濃度達到40 mg/mL。同時還制備了不含抗氧化劑且未氧化的空白對照組（con）和雖不含抗氧化劑但含有氧化因子的氧化對照（ox）。

1.2.4 肌原纖維蛋白的化學和結構變化分析

1.2.4.1 氨基酸側(cè)鏈修飾 羰基含量參考曹云剛[14]的描述的方法進行測定。

總巰基含量參考Guo 等[15]的描述，采用DTNB法進行測定，具體操作如下：將肌原纖維蛋白分散液用1% NaCl 溶液（溶于Tris-甘氨酸緩沖液：6.96.9 g/L 甘氨酸、10.4 g/L Tris、1.2 g/L EDTA，pH=8.0）稀釋至蛋白膏質(zhì)量濃度為5 mg/mL，取0.5 mL 蛋白稀釋液，加入5 mL 1.5% SDS 溶液和0.5 mL Ellman’s 試劑（SDS 溶液和Ellman’s 試劑均用Tris-甘氨酸緩沖液進行配置），在常溫條件下進行15 min 的避光反應，接著在波長412 nm處測量了其吸光度，并用Tris-甘氨酸緩沖液替代樣品進行反應作為零值調(diào)整?？値€基含量計算方法見式（4）。

式中，D——稀釋倍數(shù)；C——樣品質(zhì)量濃度，mg/mL；A412nm——波長412 nm 處吸光度。

自由氨基含量參照臧學麗等[16]描述的方式并稍作修改。取200 μL 稀釋的蛋白膏樣液于5 mL的試管中（稀釋于0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH=8.2），接著加入2 mL SDS（1%）和1 mL TNBS（0.01%）。充分搖勻后，在50 ℃的水浴中避光反應30 min。然后，加入試劑進行終止反應（2 mL 0.1 mol/L Na2SO3）。終止反應后在室溫下冷卻15 min。最后，在波長420 nm 處測量其吸光度。在相同的條件下，使用蒸餾水替代樣品液作為零值調(diào)整。同時在試驗中，分別配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L 的亮氨酸溶液，并按照前述方法測量不同濃度下的亮氨酸吸光度，據(jù)此繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算樣品自由氨基含量，計算方法見式（5）。

式中，C——根據(jù)標準曲線計算出的樣品濃度，mmol/L；m——蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.4.2 蛋白的構象變化

1）二級結構變化 蛋白質(zhì)的二級結構參照Li 等[17]描述的方式并稍作修改。將氧化后的肌原纖維蛋白懸浮液冷凍干燥后與干燥的溴化鉀按1∶200 的質(zhì)量比充分混合，并用瑪瑙研磨至無反光點為止，然后將研碎的粉末倒入壓片機中壓成透明薄片。用傅里葉紅外光譜采集光譜數(shù)據(jù)，參數(shù)設置分別為：分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，掃描區(qū)間為400～4 000 cm-1。進行樣品掃描之前先用溴化鉀進行背景掃描。利用OMNIC 軟件獲得1 700～1 600 cm-1的吸收光譜，用于酰胺Ⅰ帶分析，再利用PeakFit4.12 軟件對酰胺Ⅰ帶光譜圖進行基線校正、傅里葉去卷積和二階導數(shù)峰擬合，從而通過各峰相對面積計算出各種構象的相對含量。

2）三級結構變化 使用熒光分光光度儀來分析蛋白的三級結構，并參考Cao 等[18]的方法進行適當?shù)恼{(diào)整。用緩沖溶液PIPES（含0.6 mol/L NaCl，pH=6.25）將蛋白樣液稀釋至0.4 mg/mL，并使用1 cm 光程的熒光比色皿，在283 nm 的激發(fā)波長下，記錄300～400 nm 的發(fā)射光譜。參數(shù)設置分別為：掃描速度達到1 200 nm/min、激發(fā)和發(fā)射光譜狹縫均為5 nm、電壓為700 V。同時在同試驗條件下，記錄溶劑的發(fā)射光譜，并從樣本的發(fā)射光譜中減去了溶劑的背景成分。

3）表面疏水性測定 參照賈娜等[19]描述的技術并進行適當?shù)恼{(diào)整，量取5 mg/mL 的蛋白稀釋液5 mL（稀釋于20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液中）于10 mL 的離心管中，隨后加入1 mg/mL 的BPB 溶液50 μL，并進行充分的渦旋混合。于4 000 r/min 下進行離心10 min，放棄沉淀物，轉(zhuǎn)移上清液，再次進行離心，吸取上清液于波長595 nm 處測其吸光度A樣品，并用5 mL 的磷酸鹽緩沖溶液替代樣品，通過相同的方法，測量其吸光度作為A對照，并用BPB 的結合量來表示其表面的疏水性，計算方法見式（6）。

1.2.5 溶解度測定 根據(jù)Cao 等[12]的描述，使用PIPES 緩沖液將蛋白原液稀釋到8 mg/mL，然后進行冷凍離心（4 ℃、8 000×g、20 min），測定其上清液的蛋白質(zhì)量濃度，同時也測量未離心前的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白溶解度計算方法見式（7）。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

2 結果與分析

2.1 清除自由基能力

姜黃素在其結構中包含酚羥基和β-二酮這2個具有活性的部分，這2 個部分在化學反應中都能提供1 個質(zhì)子，同時在碳鏈的核心位置，CH2基團上氫原子的轉(zhuǎn)移對于姜黃素和酚羥基基團的抗氧化作用都具有顯著的影響[5]，因此通過測定姜黃素對自由基的清除能力可以初步了解其抗氧化能力。從圖1～3 可以看出除了對ABTS+·的清除效果姜黃素不如VC 外，清除DPPH·以及·OH 的能力都優(yōu)于VC，因此姜黃素對于清除自由基能力具有一定的效果，可以將其應用于調(diào)控蛋白質(zhì)的氧化。宋立敏[7]曾研究過姜黃素對自由基的清除能力，并將其應用于小鼠肝臟抗脂質(zhì)氧化的實驗中，結果表明姜黃素類化合物抗脂質(zhì)過氧化能力與VE 相當，可以有效減小肝臟的氧化應激損傷。

圖1 姜黃素、VC 對·OH 清除能力Fig.1 Scavenging ability of curcumin and VC on ·OH

圖2 姜黃素、VC 對ABTS+·清除能力Fig.2 Scavenging ability of curcumin and VC on ABTS+·

圖3 姜黃素、VC 對DPPH 自由基清除能力Fig.3 Scavenging ability of curcumin and VC on DPPH free radical

2.2 不同處理對肌原纖維蛋白氨基酸側(cè)鏈修飾的影響

2.2.1 蛋白羰基含量 蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈基團在氧化過程中極易受到ROS 的攻擊形成羰基衍生物[20-21]，羰基的濃度已經(jīng)變成了衡量蛋白質(zhì)氧化損害的關鍵指標。通常，人們認為蛋白質(zhì)的氧化損傷程度越高，其分子結構中的羰基濃度也就越高。采用紫外-可見光譜對不同條件下制得的蛋白質(zhì)進行了測定。如圖4 所示，con 組的MP 的羰基含量約為0.16 nmol/mg，氧化12 h 之后的ox 組的羰基含量顯著性上升約為0.25 nmol/mg，而姜黃素的加入顯著性的降低了羰基含量的上升，并且抑制效率呈濃度依賴性，高濃度20 μmol/L 的姜黃素抑制效率約達23%，由此可以說明姜黃素可以有效的抑制肉蛋白的氧化。這可能歸功于姜黃素的結構中含有多個酚羥基以及β-二酮結構，兩者均展現(xiàn)出了出色的清除自由基的能力[22]。

圖4 不同處理方式對蛋白羰基含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on protein carbonyl content

2.2.2 總巰基含量 MP 的總巰基主要有2 種類型：一種是埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基，另外一種是暴露在蛋白質(zhì)表面的活性巰基[23]。MP 主要包括肌動蛋白與肌球蛋白，二者都含有巰基，沒有二硫鍵，其中肌球蛋白的巰基最多[2]，巰基對活性羥基很敏感，容易被氧化成二硫鍵，引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集反應，因此，巰基的缺失經(jīng)常被用作評估蛋白質(zhì)氧化損失。由圖5 可見，con 組中MP 的巰基含量大約是7.88 μmol/g，而在氧化12 h 后，ox 組MP的巰基含量顯著降低至4.12 μmol/g，約下降了48%，在芬頓氧化的復雜體系中，由鐵催化的氧自由基（如O2·、HO2·、HO·、O·等）可能涉及巰基的氧化過程，另外脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的自由基（L·、LO·和LOO·）也可能通過二硫鍵的形成導致巰基含量的損失[24]，此外，在脂質(zhì)氧化過程中生成的二級醛類物質(zhì)與SH 基團的反應也會阻止DTNB 探針檢測到SH[25]。然而，姜黃素的加入顯著性抑制了巰基的損失（P＜0.05），且姜黃素的濃度與其抑制效果之間存在正向關聯(lián)。高濃度姜黃素（20 μmol/L姜黃素）組的MP 的巰基含量為7.411 μmol/g，巰基損失率僅為6.0%左右。試驗結果表明姜黃素有助于減少巰基的流失。這可能是因為姜黃素具有酚羥基結構和β-二酮結構，這些都能為質(zhì)子與自由基的反應提供支持，從而降低了巰基與自由基之間的化學反應。過去Barclay 等[26]研究了姜黃素的抗氧化活性，認為姜黃素酚羥基上的氫質(zhì)子對抗氧化活性起到?jīng)Q定性作用。

圖5 不同處理方式對蛋白總巰基含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on total sulfhydryl group content of protein

2.2.3 自由氨基含量 在蛋白質(zhì)結構中，賴氨酸側(cè)鏈的ε-NH2基團極易受到自由基的侵害，進而生成羰基，這些羰基進一步與NH2反應形成席夫堿，從而對自由氨基產(chǎn)生削弱效果[27]。因此，自由氨基可以被視為評估蛋白質(zhì)氧化損害的一個指標。如圖6 所示，未經(jīng)氧化的con 組MP 的自由氨基含量大約為108 nmol/mg。經(jīng)過12 h 的氧化處理后，ox 組的自由氨基含量明顯下降到62 nmol/mg，減少了大約42.59%。此外，姜黃素的加入顯著地延緩了自由氨基含量的減少（P＜0.05），5，10，15，20 μmol/L 姜黃素處理組分別自由氨基含量分別下降了29.0%，27.6%，20.3%，6.5%。可能是因為姜黃素的加入對MP 的降解有保護作用，可以有效的抑制自由氨基的下降，并且其抑制效果與姜黃素濃度也具有顯著影響，濃度越高抑制效果越顯著。冉麗丹等[28]對茶多酚-β 環(huán)糊精在羊肚冷藏過程中對肌原纖維蛋白氧化的作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)茶多酚-β 環(huán)糊精可以有效的保護MP 的降解，減緩自由氨基的下降。對蛋白羰基，巰基和自由氨基進行全面分析，檢測結果證明，姜黃素加入后，能有效地抑制羥自由基對蛋白的氧化損傷。

圖6 不同處理方式對蛋白自由氨基含量的影響Fig.6 Effects of different treatments on free amino content of protein

2.3 不同處理對肌原纖維蛋白構象的變化影響

2.3.1 蛋白二級結構 蛋白質(zhì)的次級結構主要由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲組成，這4種次級結構相對比的改變能夠從某種程度上反應出蛋白質(zhì)的氧化穩(wěn)定性與結構穩(wěn)定性，因此四者相對含量的變化常用于評定蛋白質(zhì)結構的穩(wěn)定性。如圖7 所示，氧化后MP 的β-轉(zhuǎn)角和α-螺旋明顯增多而β-折疊和無規(guī)卷曲顯著下降，而姜黃素的加入正好調(diào)節(jié)了各個含量的變化。鄧小蓉等[29]也曾研究過氧化對白斑狗魚肌原纖維蛋白二級結構的影響，結果表明，在一定濃度范圍內(nèi)氧化會導致α-螺旋的上升。通常情況下，肽鏈中的氫鍵穩(wěn)定性呈現(xiàn)出α-螺旋的形態(tài)，而肽鏈之間的氫鍵穩(wěn)定性直接影響β-折疊，β-轉(zhuǎn)角是由MP 的有序結構決定的，而MP 的高級結構和相關蛋白的適應性則決定了不規(guī)則的卷曲結構[30]。試驗結果表明，5 mmol/L 的羥自由基氧化會導致MP 的部分有序結構（即β-折疊）會轉(zhuǎn)向α-螺旋形態(tài)，從而減少了分子之間的相互作用力，姜黃素的添加正好可以緩解羥自由基氧化引起的結構變化，說明姜黃素可以緩解羥自由基氧化引起的MP 二級結構變化，對MP 具有良好的保護作用。

圖7 不同處理方式對MP 二級結構的影響Fig.7 Influence of different processing methods on secondary structure of MP

2.3.2 MP 固有色氨酸熒光 非極性氨基酸對蛋白質(zhì)的極性及微環(huán)境非常的敏感，因此色氨酸以及酪氨酸固有熒光通常被用于蛋白質(zhì)的三級結構的檢測[31]。通常，蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)的色氨酸位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水環(huán)境中，此時熒光強度較強，反之，蛋白質(zhì)局部或者全部展開后色氨酸就會與極性環(huán)境接觸，溶劑對一部分熒光有輕微屏蔽作用，使其所擁有熒光強度降低[32]。由圖8 可見，con 組MP 最大發(fā)射波長下熒光強度達到5 144 cps 左右；ox 組MP 氧化12 h 熒光強度顯著降低，達到4 272 cps 左右，表明氧化使MP 結構鋪展。然而，加入姜黃素后色氨酸熒光強度再次減弱，說明姜黃素的添加使得氧化MP 的結構進一步展開，并且濃度越大，色氨酸強度降得越明顯。這可能是因為姜黃素是含有多個酚羥基的酚酸類物質(zhì)，這種物質(zhì)可能增強了色氨酸微環(huán)境的極性特性，與此同時姜黃素與色氨酸或者酪氨酸的共價或非共價結合也可能部分掩蓋了MP 的熒光強度。與此類似的有Cao 等[12]報道了綠原酸的添加會降低色氨酸熒光強度，Dai 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸的加入，使豬肉肌原纖維蛋白產(chǎn)生了熒光猝滅的現(xiàn)象。

圖8 不同處理方式對MP 內(nèi)源性色氨酸熒光的影響Fig.8 Effects of different treatments on MP endogenous tryptophan fluorescence

2.3.3 MP 表面疏水性 表面疏水性是一種廣泛用于評價疏水氨基酸在蛋白質(zhì)表面分散程度的技術，對應著蛋白質(zhì)的三級結構[23]，一般情況下使用BPB 與蛋白質(zhì)結合量來表征其表面疏水性的大小[13]。如圖9 所示，未氧化的MP 的BPB 結合量約為3.54 μg，氧化后顯著性增加到13.88 μg（P＜0.05），這是由于蛋白質(zhì)氧化后，引起其疏水性氨基酸側(cè)鏈暴露，進而削弱蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)結合，從而使得暴露的疏水性氨基酸與BPB 結合，進而表面疏疏水性增強[34]。添加姜黃素的處理組均在氧化的基礎上減緩了表面疏水性的增加，姜黃素處理后（5，10，15，20 μmol/L）的表面疏水性分別降低了3.47%，9.96%，20.00%，51.79%（P＜0.05）。顯然姜黃素雖能在一定程度上逆轉(zhuǎn)表面疏水性的增加，但并不能恢復到原始狀態(tài)。Guo 等[15]曾報道，天然植物多酚和膳食蛋白質(zhì)共價或非共價結合均能有效地降低表面疏水性，并推測蛋白質(zhì)表面疏水性改變與MP 氧化應激和酚-蛋白相互作用相關。

2.4 不同處理對肌原纖維蛋白溶解度的影響

蛋白質(zhì)溶解度的大小影響著其它功能作用發(fā)揮，并且蛋白質(zhì)溶解度的大小可以側(cè)面反映出其表面疏水性的大小，一般情況下兩者呈負相關關系[14]。如圖10 所示，與空白對照組相比氧化組顯著性的降低了蛋白質(zhì)的溶解度，約降低50.20%（P＜0.05），可能是因為包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團的暴露或者是單個的活性基團通過二硫鍵的聚合作用，從而使其溶解度下降[35]。加入姜黃素之后，蛋白質(zhì)的溶解度也得到了顯著性提高，與氧化組相比較，添加姜黃素MP（5，10，15，20 μmol/L）的溶解度分別升高了26.440%，33.19%，53.95%，70.84%。可能是因為姜黃素的引入減少了氧化引起的MP 的損傷，可以減少MP 結構的變化，減少聚集。與此結果類似的有陳楷文[36]研究的沒食子酸可以緩解MP 溶解度由于氧化作用而導致的降低。于晶超[37]認為低、中等濃度的阿魏酸低聚糖的引入也可以顯著性使溶解度增加。

圖10 不同處理方式對MP 溶解度的影響Fig.10 Influence of different treatment methods on MP solubility

3 結論

姜黃素對ABTS+·、DPPH·以及·OH 都具有較好地清除能力，其中清除DPPH·以及·OH 的能力優(yōu)于VC。姜黃素的添加可以有效的抑制·OH 誘導的蛋白氧化及結構的變化。具體表現(xiàn)在添加姜黃素在一定程度上可以抑制羰基的生成和表面疏水性的升高；可以緩解巰基、自由氨基和溶解度的下降；從傅里葉紅外光譜以及色氨酸熒光分析中表明姜黃素對肌原纖維蛋白的結構也起到了一定的積極作用，且在一定的濃度范圍內(nèi)（5～20 μmol/L），姜黃素的濃度越高，對MP 的抗氧化以及結構保護效果越好。因此姜黃素對MP 的氧化和結構調(diào)控作用在肉制品品質(zhì)改善中具有較好的應用前景，可為肉制品貨架期的延長提供一定的理論依據(jù)。